Thực hành vi sinh vật thực phẩm lê nhã uyên, nguyễn thị thanh hải

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Viện Công nghệ sinh học Môi trường …………… Th.S LêNhãUyên Th.S Nguyễn Thị Thanh Hải Tài liệu THỰC HÀNH VI SINH VẬT THỰC PHẨM (Lưu hành nội bộ) Nha Trang, 2019 MỤC LỤC PHẦN 1: CÁC KỸ THUẬT VI SINH CƠ BẢN Bài 1: AN TỒN PHỊNG THÍNGHIỆM Bài 2: NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI TẾ BÀO VI SINH VẬT Bài 3: CHUẨN BỊ DỤNG CỤ VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT 12 Bài 4: CÁC PHƯƠNG PHÁP CẤY VI SINH VẬT 18 Bài 5: LẤY MẪU THỰC PHẨM VÀ CHUẨN BỊ MẪU 25 PHẦN 2: CÁC NHÓM VI SINH VẬT CẦN KIỂM TRA TRONG MẪU THỰC PHẨM…26 Bài 6: TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ (TPC – Total Plate count) 27 Bài 7: XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG COLIFORM, FECAL COLIFORM VÀ ESCHERICHIA COLI 29 Bài 8: KIỂM TRA SALMONELLA TRONG MẪU THỰC PHẨM .32 Bài 9: KIỂM TRA VIBRIO TRONG MẪU THỰC PHẨM 35 Bài 10: KIỂM TRA STAPHYLOCOCCUS AUREUS TRONG THỰC PHẨM 38 Bài 11: KIỂM TRA LISTERIA MONOCYTOGENES TRONG THỰC PHẨM 40 Bài 12: KIỂM TRA CLOSTRIDIUM sp TRONG THỰC PHẨM………………………… 42 PHẦN 3: MỘT SỐ TEST SINH HOÁ QUAN TRỌNG…………………………………… 43 PHẦN 4: ỨNG DỤNG VI SINH VẬT CÔNG NGHIỆP 54 PHỤ LỤC 55 PHẦN 1: CÁC KỸ THUẬT VI SINH CƠ BẢN Bài 1: AN TỒN PHỊNG THÍNGHIỆM 1.1 Quy tắc làm việc phịng thínghiệm vi sinh 1.1.1 Nội quy phịng thínghiệm (1) Tham dự đầy đủ thínghiệm theo chương trình quy định Trước đến phịng thínghiệm, sinh viên cần chuẩn bị đầy đủ nội dung lýthuyết thínghiệm làm (2) Tuân thủ thời khóa biểu thực hành xếp (3) Phải mặc áo bảo hộ (blouse) làm việc phịng thínghiệm Tóc phải cột, bọc gọn tránh nhiễm vi sinh vàsém cháy lửa đèn cồn (4) Khơng ăn uống, hút thuốc phịng thínghiệm Khơng đưa tay lên sờ miệng (5) Không đem canh cấy vi sinh, hốchất, dụng cụ khỏi phịng thínghiệm trừ phép giáo viên hướng dẫn (6) Cần cóýthức tiết kiệm mơi trường, hóa chất, vật liệu thực thínghiệm (7) Khi làm việc với trang thiết bị, dụng cụ cần cẩn thận, kính hiển vi Khi chưa biết cách vận hành, sinh viên phải hỏi giáo viên hướng dẫn người phụ trách (8) Khi thực thínghiệm vi sinh, sinh viên cần tuân thủ kĩ thuật vô trùng vàkhử trùng để tránh lây nhiễm vi sinh vật (9) Khi thực thínghiệm, sinh viên làm việc theo nhóm, sau phân tích kết thí nghiệm (10) Dọn dẹp, lau chùi sau làm việc Các trang thiết bị, dụng cụ, hoáchất sau dùng xong phải để nơi quy định (11) Nhóm trực nhật cótrách nhiệm kiểm tra vịi nước, kiểm tra tình hình sử dụng điện trang thiết bị, tắt điện, tắt quạt trước MỘT SỐ LƯU Ý VỚI SINH VIÊN NHẰM ĐẠT KẾT QUẢ TỐT TRONG THỰC HÀNH VI SINH VẬT HỌC Trước làm thínghiệm: - Cần tìm hiểu mục đích, u cầu vànội dung thực hành - Nắm vững lýthuyết liên quan đến thínghiệm - Đọc cẩn thận bước tiến hành thínghiệm cách đọc kết Trong qtrình thực hành: - Cần thực thao tác bước thínghiệm để đạt mục đích vàyêu cầu đề Sau thực hành: - Phải làm đầy đủ tường trì nh, trả lời câu hỏi vàbài tập phần cuối 1.1.2 Kĩ thuật vôtrùng, khử trùng: Một số thuật ngữ cần phân biệt: Vơ trùng là1 qtrình màtất vi sinh vật sống bị pháhuỷ Các vi sinh vật bị giết nóng áp lực hay nhiệt độ cao điều kiện khô, hay đốt thành tro Nếu nói vật vơ trùng, hiểu vật hồn tồn khơng có vi sinh vật sống Nói chung nói đến vơ trùng, ý nói đến an tồn phịng thínghiệm, chủ yếu nói đến vơ trùng nóng áp lực autoclave Phương pháp khử trùng đốt cháy tác nhân khử trùng đốt thành tro Tất chất thải sinh học phải đốt cháy kỹ trước thải bỏ Khử trùng q trình sinh vật khơng sinh bào tử, sinh dưỡng bị pháhuỷ Các tác nhân gây quátrình gọi làchất khử trùng hay chất giết khuẩn Các tác nhân sử dụng cho vật dụng chúng độc với mô người động vật Nhiễm trùng xác định cósự phát triển (nhân lên) vi sinh vật mô thể Thuật ngữ vô trùng dùng để trình mà ngăn cản xâm nhập tác nhân nhiễm trùng vào mô vô trùng, ngăn ngừa nhiễm trùng Các kỹ thuật vô trùng thao tác màcác nhàvi sinh vật học dùng để loại tất vi sinh vật khỏi môi trường nhiễm hay mô sống tiếp xúc Các chất kháng khuẩn làcác hoá chất (thường làcác chất khử khuẩn hồtan) cóthể sử dụng an tồn cho bên thể nhằm phá huỷ hay ức chế vi khuẩn sinh dưỡng Khi thực thínghiệm vi sinh, sinh viên cần tuân thủ thao tác thực kỹ thuật để không gây tạp nhiễm ảnh hưởng đến thínghiệm hay khơng gây phân tán vi sinh vật môi truờng xung quanh Các kĩ thuật bao gồm kĩ thuật vơ trùng dụng cụ thínghiệm, mơi trường ni cấy vi sinh vật; tuân thủ kĩ thuật khử trùng đồi với tay người nghiên cứu, bàn làm việc để tránh gây nhiễm trùng Việc liên quan đến thực kỹ thuật vô trùng, khử trùng vàthực hành phương tiện an tồn phịng thínghiệm Khi bắt đầu làm vệc với canh cấy vi khuẩn thực hành, sinh viên phải học kỹ thuật Một số điều phải tuân theo: - Rửa tay Trước bắt đầu làm việc, người làm phải rửa tay, sau sử dụng dung dịch sát khuẩn vàlau khô giấy lau Kết thúc công việc, trước rời phịng thínghiệm, phải rửa tay xàphịng - Khử trùng mặt bàn làm việc Bắt đầu buổi làm việc, người làm phải lau bàn chất diệt khuẩn nhằm loại bụi bẩn mặt bàn, làm giảm thiểu nguy nhiễm khuẩn vào canh cấy Kết thúc cơng việc, trước rời phịng thínghiệm, cần khử trùng lại để bảo vệ cho nhóm thực tập - Sử dụng đèn cồn (đèn gas) Trong phịng thínghiệm vi sinh đèn cồn sử dụng để khử trùng vịng cấy que cấy, miệng bình, miệng ống nghiệm Để khử trùng vòng cấy cần đốt nóng đỏ sau vịng cấy nguội cách giữ vịng cấy thời gian vùng vơtrùng xung quanh lửa Cần lưu ý, để an toàn sử dụng đèn cồn, không di chuyển đèn cồn cháy, không chụm hai đèn cồn với để châm lửa, không dùng miệng thổi tắt đèn cồn, muốn tắt thìphải dùng nắp chụp đậy lại - Pipette Pipette dùng để chuyển canh cấy phải sử dụng thiết bị hút học, không sử dụng miệng để hút 1.1.3 Xử lýcanh cấy vi sinh vật Thải bỏ canh cấy Các dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật trước thải bỏ phải hấp khử trùng (autoclave) 1210C / 15 phút để giết chết vi sinh vật Xử lý làm đổ canh cấy Tất trường hợp cố làm đổ canh cấy vi sinh vật phải báo cáo với giáo viên hướng dẫn Mặc dù đa số vi sinh vật sử dụng thực hành làkhơng gây bệnh, có số gây bệnh Do vậy, phải xử lýtất trường hợp cố làm đổ dịch cấy, phịng có liên quan đến vi sinh vật gây bệnh Biện pháp xử lý: + Tất áo bảo hộ, vải lau dính dịch cấy phải đem autoclave + Dùng giấy, vải thấm dịch sát khuẩn đặt vào vùng canh cấy đổ + Đổ thuốc sát khuẩn quanh nơi có canh cấy vi sinh, để hạn chế lây lan xung quanh vàkhơng khí + Dùng kẹp (loại cóthể hấp tiệt trùng được) gắp giấy, vải lau bỏ vào dụng cụ chứa đựng đem autoclave (autoclave kẹp gắp) (Tương tự, hoáchất gây nguy hiểm đến người gây kích ứng thể, gây tổn thương da hay gây ung thư phải báo cáo với giáo viên hướng dẫn để cóbiện pháp xử lý thích hợp) 1.2 Sử dụng trang thiết bị, dụng cụ phịng thínghiệm vi sinh - Thiết bị dập mẫu - Tủ sấy dụng cụ - Nồi hấp vôtrùng - Tủ ủ ấm vi sinh - Cân phân tích - Tủ lạnh - Kính hiển vi - Máy lắc loại Bài 2: NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI TẾ BÀO VI SINH VẬT 2.1 Dụng cụ, mơi trường, hóa chất 2.1.1 Dụng cụ: - Kính hiển vi quang học - Lame, lamen - Bình nước rửa - Giấy thấm - Que cấy, đèn cồn, hộp quẹt 2.1.2 Mơi trường, hóa chất: - Nước muối sinh lý - Thuốc nhuộm loại: tím Violet, lugon, Xanh Methylene, Fucshine, Cồn - Dầu soi kính - Ống giống vi khuẩn lactic, vi khuẩn Gram (-), nấm men, nấm mốc 2.2 Phương pháp làm tiêu 2.2.1 Phương pháp làm tiêu soi tươi Cách làm tiêu giọt ép - Dùng que cấy ống hút lấy giống vi sinh vật để làm vết bơi Đặt lákính lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh khơng tạo thành bọt khí Muốn để mép lákính tiếp xúc với phiến kính từ từ hạ lákính xuống - Đưa tiêu lên quan sát kính hiển vi Cách làm tiêu giọt treo Loại tiêu dùng để theo dõi sinh sản, hình thành bào tử, khả di động phản ứng tế bào vi sinh vật với loại kích thích - Dùng phiến kính đặc biệt cóphần lõm hình trịn - Bơi vazơlin quanh phần lõm phiến kính - Cho giọt canh trường lên lákính - Thận trọng xoay ngược lákính cho giọt canh trường xuống phía đặt lên phần lõm phiến kính - Hình 1: Phương pháp làm tiêu giọt treo 2.2.2 Phương pháp làm tiêu cố định Phương pháp vôtrùng tạo vết bôi: - Lắc ống nghiệm để vi khuẩn lơ lửng ống, ý không làm ướt nút ống nghiệm - Hơ đỏ đầu que cấy vàphần kim loại Hơ nóng phần tay cầm - Mở nút ống nghiệm hơ nóng miệng ống Khơng đặt nút xuống bàn - Làm nguội đầu que cấy giây, lấy vòng que cấy dịch chứa vi sinh vật, tránh chạm đầu que cấy vào thành ống nghiệm - Hơ nóng miệng ống nghiệm lần - Đậy nút ống nghiệm đặt lên giá - Đặt vòng cấy chứa vi khuẩn vịng mục tiêu định sẵn thành vịng trịn phiến kính - Hơ que cấy lại trước chuyển vòng cấy khác từ canh cấy đặt sang chỗ khác Phương pháp cố định tế bào: Đối với mẫu lấy từ mơi trường dịch lỏng: - Đặt vịng que cấy dịch chứa vi sinh vật vào vịng trịn mục tiêu - Tán vi sinh vật khắp vùng vịng mục tiêu Vết bơi làm khơở nhiệt độ phịng Đối với mẫu lấy từ mơi trường rắn: Đặt vịng que cấy nước vào vịng trịn mục tiêu, sau đưa sinh khối vi sinh vật vào tán làm tương tự Đưa phiến kính qua lửa vài lần để tiêu diệt vàgắn vi khuẩn vào phiến kính Hình 2: Phương pháp làm tiêu cố định Hình 3: Làm tiêu cố định từ môi trường lỏng môi trường rắn Nhuộm đơn: - Đặt tiêu lên cầu thuỷ tinh (đặt nằm ngang miệng khay nhân, thuỷ tinh) - Nhỏ vào vết bôi vài giọt Xanh Methylene, để yên phút - Rửa vết bôi cách nghiêng phiến kính, dùng bình xịt cho dịng nước chảy nhẹ qua vết bơi đến nước chảy khơng cịn màu - Dùng giấy thấm khôtiêu hơ nhẹ tiêu đèn cồn - Quan sát tiêu vật kính (x 40) chuyển sang vật kính (x 100) dùng dầu soi Hình 4: Phương pháp nhuộm đơn Nhuộm Gram Các kỹ thuật nhuộm dùng việc nhận diện vi khuẩn chưa biết Nhuộm gram làmột thínghiệm quan trọng PTN vi sinh vật Mặc dùkỹ thuật đơn giản, cần tiến hành thínghiệm cẩn thận Chúý: (1) không làm vết bôi quádày (2) Chú ý bước tẩy màu (3) Canh cấy vi khuẩn gram dương già có khuynh hướng màu nhanh canh cấy non, khiến chúng xuất gram âm thay vìvi khuẩn gram dương Để cókết đáng tin cậy nên sử dụng canh cấy khoảng 16 Một điểm khác cần chúý, vài lồi Bacillus có thử nghiệm nhuộm gram thay đối: bắt màu gram dương, bắt màu gram âm Các bước thực nhuộm Gram: Phủ crystal violet lên vết bôi vàgiữ 20 giây Sử dụng bình nước cất rửa vết thuốc nhuộm thời gian ngắn, làm nước thừa Phủ vết bôi với dung dịch iodine gram vàgiữ 30 giây - phút Đổ hết dung dịch iodine gram vàgiội tràn vết bôi với ethyl alcohol 95% 10-20 giây Đây bước định Vết bôi dày cần khoảng thời gian lâu vết bôi mỏng Sự màu xuất dịng chảy từ phiến kính hịa tan thuốc nhuộm khơng cịn màu Dừng hoạt động alcohol cách rửa phiến kính với nước bình rửa vài phút Phủ safranin vết bôi vàgiữ 20 giây Rửa nhẹ nhàng vài giây, thấm khơbằng giấy thấm vàkhơng khíkhơ Kiểm tra phiến kính dầu soi kính Hình 5: Phương pháp nhuộm Gram Hình 6: Một số hình ảnh kiểu nhuộm quan sát tế bào vi khuẩn 2.3 Kính hiển vi: Hiện có nhiều loại kính hiển vi, số loại dùng phổ biến phịng thí nghiệm vi sinh vật: kính hiển vi trường sáng, kính hiển vi trường tối, phản pha, vàhuỳnh quang; trình bày kính hiển vi trường sáng Nếu trước bạn tìm hiểu kính hiển vi, thìbài khơng cónhiều thơng tin cung cấp cho bạn; nhiên lần tìm hiểu vi sinh vật, bạn cần đọc kỹ để sử dụng kính hiển vi Trong kính hiển vi trường sáng, tia sáng trực tiếp từ nguồn đến mắt người màkhông bị lệch hướng mờ nằm tụ quang Đây loại kính học sử dụng dành cho người bắt đầu học sinh học, thường đuợc sử dụng phịng thínghiệm vi sinh vật Tất loại kính hiển vi trường sáng có cấu trúc chung, khác hệ thống Bài tập giúp bạn hiểu rõvề loại kính hiển vi phịng thínghiệm 2.3.1 Các phận kính hiển vi Khung đỡ gồm chân vàthân kính Bàn soi cóbộ phận kẹp lam kính, vít trượt điều chỉnh vị trílam kính bàn soi Hệ thống thấu kính gồm thị kính, vật kính vàtụ quang Ốc chỉnh kính: ốc chỉnh kính thơvàốc chỉnh kính tinh Hình 7: Các phận kính hiển vi 2.3.2 Các thao tác chăm sóc kính hiển vi Kính hiển vi làdụng cụ cần chăm sóc đặc biệt để tránh hư hỏng hệ thống quang học học Các thao tác sử dụng kính cần thực theo dẫn sau: Vận chuyển: Khi chuyển kính hiển vi từ vị trínày sang vị trí khác phịng thínghiệm, phải đỡ dụng cụ hai tay Nếu cầm tay thìrất dễ va chạm vào vật dụng khác Mỗi lần di chuyển phép cầm 01 kính hiển vi Ngăn nắp: Giữ nơi soi kính ngăn nắp, cất sách vở, dụng cụ khơng cần thiết Vùng soi kính gọn gàng, ngăn nắp xảy cố Dây điện: Dây dẫn điện bóng đèn kính hiển vi dễ làm sinh viên vấp, kéo kính hiển vi rơi xuống đất Chú ý dây điện cho người lại phòng thínghiệm khơng bị vấp 10 Hình 8: Hai tay đỡ dụng cụ cách chắn di chuyển kính hiển vi bình kỵ khí Nếu nghi ngờ Clostridium chịu nhiệt, thực ủ song song 37oC 50oC Thông thường việc đọc kết ttrên đĩa dễ ống nghiệm ISA mơi trường khơng chọn lọc nên lồi vi khuẩn sinh H2S khác Clostridium tăng trưởng vàtạo khuẩn lạc màu đen môi trường Để khẳng định Clostridium cần thực thêm quy trình tiêu chuẩn để giúp khẳng định kết 12.4 Báo cáo kết quả: Đếm tất khuẩn lạc đen, hay bao quanh vịng đen Mật độ Clostridium mẫu tính từ số khuẩn lạc đếm nhân với hệ số pha loãng mẫu vàbiểu diễn kết dạng CFU/g hay CFU/ml PHẦN 3: MỘT SỐ TEST SINH HOÁ QUAN TRỌNG Bài 13: CÁC TEST SINH HĨA QUAN TRỌNG THƯỜNG GẶP Sau ni cấy môi trường chọn lọc, môi trường phân biệt, thu cấc khuẩn lạc đơn, khiết kỹ thuật phân lập trình bày mục chương này.Chủng làyêu cầu cần cho việc định danh vi sinh vật Việc định danh thực dựa vào đặc điểm kiểu hình, đặc biệt làcác phản ứng sinh hóa thực chủng vi sinh vật Có cách tiếp cận để thực phép thử nghiệm sinh hóa dùng cho mục đích định danh làcách truyền thống, sử dụng KIT vàdùng thiết bị tự động Các kết thử nghiệm sinh hóa hàng trăm lồi vi sinh vật nhiều phịng thí nghiệm khác tên giới tổng hợp thành Bảng Sinh hóa định danh vi sinh vật Bảng Sinh hóa bao gồm đặc điểm sinh hóa đặc trưng để phân biệt lồi vi sinh vật gây bệnh thường gặp Mỗi đặc điểm sinh hóa biểu thị trị số làtỉ lệ phần trăm thử nghiệm sinh hóa cho kết dương tính theo thống kêở lồi vi sinh vật Như vậy, trị số 100 có nghĩa 100% trường hợp loài thử cho kết dương tính, ngược lại trị số có nghĩa 0% trường hợp thử nghiệm cho kết dương tính hay nói cách khác 100% trường hợp thử nghiệm đặc điểm sinh hóa tương ứng lồi cho kết âm tính Các đặc điểm sinh hóa cótrị số dao động mức 50% khơng cógiátrị việc định danh Trong thực tế kiểm nghiệm, kết thử nghiệm sinh hóa biểu thị quy uớc ký hiệu như: (+), (-), (+/-) làkhỏang 70% dương tính (-/+) làkhỏang 70% làâm tính THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG LÊN MEN: a Nguyên tắc: Thử nghiệm nhằm xác định khả sử dụng nguồn carbon định vi sinh vật để tăng trưởng Vi sinh vật cókhả khác việc sử dụng nguồn carbon khác để tăng trưởng Các nguồn carbon cóthể chia thành nhóm là: đường đơn ( monosaccharide), đường đa ( oligo-hay poly saccharide rượu (alcolhol) Các nguồn carbon thường sử dụng thử nghiệm khả lên men gồm: 44 Glucose Arabinose Trehalose Sorbtol Galactose Raffinosse Melibiose Adonitol Fructose Rhaffinosse Salicin Dulcitol Lactose Xylose Mannitol Inulin Saccharose Cellobiose Inositol Trong số nguồn carbon cótên tận –ose đường (kể salicin), tận –ol làcác nhóm chức rượu –OH Tuy nhiên thực tế nhóm chức thường gọi chung đường Khi sử dụng nguồn carbon để lên men, tùy phương thức lên men sản phẩm tạo khác bao gồm rượu, acide hữu cơ, CO2… tất trường hợp, sản phẩm tạo thành làm giảm pH môi trường Do khả lên men đánh giá làm giảm pH môi trường dẫn đến thay đổi màu thị pH mơi trường Ngồi CO2 tạo thành bẫy lại tạo thành bọt khítrong ống Durham vànổi ống hay làm vỡ thạch ống nghiệm thạch sâu Môi trường lỏng thường dùng hầu thử nghiệm lên men Thử nghiệm khả lên men thường dùng để định danh vi sinh vật đường ruột, vídụ nhóm Enterobacteriaceae có khả lên men glucose: E coli, Klebsiella nhóm Enterobacter lên men glucose vàlactose Ngồi thử nghiệm giúp phân biệt số giống vi sinh vật, vídụ Listeria monocytogens có salicin (+) lồi Corynebacterium có salicin (-); S aureus có mannitol (+), S epidermidis có mannitol (-) b Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng mơi trường Phenol red broth base có pH 7,4 Chỉ thị môi trường đỏ phenol, màu đỏ phenol chuyển vàng pH môi trường 6,8 Một thị pH khác làandrade ( dung dịch 0,5% fuschin NaOH 0,6%, sử dụng nồng độ cuối là0,1%) có màu nâu pH 7,1 chuyển thành màu đỏ pH 5,0 vàcó màu vàng môi trường kiềm Nguồn carbon: tùy vi sinh vật cần kiểm định, thường sử dụng tổ hợp khác 8-10 loại nguồn carbon nêu nồng độ 1%( trừ trường hợp salicin là0,5%) Các loài chất thường pha chế thành dung dịch mẹ cónồng độ gấp 10 nồng độ sau ( thường ghi là10X, tức là10% cho loại nguồn carbon 5% cho salicin) bảo quản tủ lạnh Khi sử dụng bổ sung lượng thích hợp dung dịch mẹ vào mơi trường để đạt nồng độ cuối cần thiết( pha loãng 1/10) Mơi trường bổ sung chứa bình tam giác hấp khử trùng Sau khử trùng vàlàm nguội, môi trường phân phối vào ống nghiệm vơtrùng với thể tích là5ml/ ống nghiệm vơ trùng, ống nghiệm dùng hay bảo quản tủ lạnh dùng Tiến hành cấy chủng vi sinh vật làm que cấy trịn vào ống nghiệm mơi trường, cóthể dùng que cấy cho lần cấy chung loại vi sinh vật Sau cấy, ủ ống môi trường 37oC 18-20h, trường hợp khẳng định kết âm tính, thời gian ủ cóthể kéo dài đến 30 ngày c Đọc kết quả: Khả lên men chủng đánh giá dựa vào sinh acid sinh Sinh acid là(+) môi trường chuyển màu thị đỏ phenol thành màu vàng, ngược lại màu thị đỏ thìacid (-) Nếu thị làandrade, kết (+) môi trường đỏ, là(-) môi trường màu vàng hay khơng màu 45 Sinh (+) có bọt khítrong ống durham, vàchuyển màu mơi trường, số vi sinh vật lên men chậm, đổi màu sinh không rõ ràng, trường hợp nghgi ngờ cần so sánh với ống đối chứng THỬNGHIỆM KHẢ NĂNG OXI HÓA- LÊN MEN: a Nguyên tắc: Các vi sinh vật dị dưỡng cần cung cấp nguồn carbon dạng tự do, thường carbohydrate từ môi trường Các carbohydrate vi sinh vật sử dụng làm nguồn lượng thông qua phương thức biến dưỡng làlên men hay hơhấp Lên men là1 qtrình biến dưỡng lượng điều kiện kị khí, lượng tạo chế phosphoryl hóa chất, khơng có tham gia chuỗi chuyền điện tử nhận điện tử sau từ bên ngòai tế bào Quátrình lên men glucose chia phân tử thành phân tử đường triose ( đường C) Sản phẩm cuối quátrình lên men tùy thuộc vào loại vi sinh vật điều kiện môi trường Tuy điểm cốt yếu đường lên men làphân tử glucose bi phosphoryl hóa bước để trở thành glucose-6-phosphate Quátrình lên men cần chất nhận điện tử cuối là1 hợp chất hữu Glucose tham gia trình lên men thường trao đổi theo đường Embden-Meyerhof, có trường hợp trao đổi theo đường Entner- Doudoroff đường theo hướng trao đổi pentose Ngược lại hô hấp là1 qtrình biến dưỡng lượng, điện tử chuyền từ chất chất nhận điện tử, tình ATP tạo theo chế phosphpryl hóa oxi hóa Cuối chuỗi chuyền điện tử làchất nhận điện tử sau cần cung cấp từ mơi trường Qtrì nh làhơhấp hiếu khíkhi chất nhận diện tử sau làoxi phân tử, diễn mơi trường có oxi Ngược lại qtrình làhơhấp kị khíkhi chất nhận điện tử cuối khơng phải làoxi mànitrate, sulfate Trong qtrì nh hơ hấp hiếu khí, phân tử glucose khơng bị tách thành phân tử triose trình lên men mà bị oxihoas nhóm chức aldehyde, tạo thành acid gluconic khơng bị phosphoryl hóa giai đoạn đầu quátrình phân giải trình lên men Q trình lên men thường tạo mơi trường có tính acid cao so với oxihóa Thử nghiệm oxi hóa- lên men gọi làthử nghiệm Hugh- Leifson nhằm xác định vi sinh vật thử nghiệm biến dưỡng carbohydrate theo oxihoas hay lên men Cách thực cách nuôi cấy chủng thử nghiệm môi trường Hugh-Leifson chứa glucose nguồn carbon vàchỉ thị pH làbromothymol blue Các sản phẩm acid quátrình lên men làm biến đổi màu thị pH Chủng làm đối chứng phương thức oxi hóa làAcinetobacter calcoaceticus, cho lên men làE.coli, cho không khả biến dưỡng glucose làAlcaligenes faecalis b Phương pháp tiến hành: Cấy đâm sâu vi sinh vật thử nghiệm vào ống nghiệm mơi trường Hugh-Leifson có chứa 2-5g agar/lit ống phủ lên bề mặt dầu khống paraffin vơ trùng để ngăn tiếp xúc với oxi khơng khí.Ủ ống điều kiện 24-48h/37oC Trường hợp chủng thử nghiệm cầu khuẩn Streptococci hay Micrococci, môi trường Hugh-Leifson thay môi trường BP cải biên chất thị thay bromocresol blue c Đọc kết quả: Phương thức biến dưỡng carbohydrate làlen men ống bị acid hóa bề mặt vàtrong phần sâu mơi trường Ngược lại ống kị khíbị acid hóa khắp mặt thạch sâu, ống hiếu khíkhơng bị acid hóa mặt màchỉ bị acid hóa phần đáy ống nghiệmthìkết luận vi sinh vật biến dưỡng carbohydrate theo oxi hóa 46 THỬ NGHIỆM BILE ESCULIN: a.Nguyên tắc: Thử nghiệm phân biệt vi sinh vật dựa khả thủy phân liên kết glycosidetrong Esculin thành Esculetin vàglucose cósự diện muối mật Esculin dẫn xuất acetaldehyde monosaccharide Trong phản ứng này, liên kết βglucoside esculin bị thủy phân, phóng thích glucose vàesculin Esculin kết hợp với muối sắt môi trường tạo thành phức hợp màu đen hay nâu đen Chủng làm đối chứng (+) cho thử nghiệm là: Serratia marcescens, (-) Edwardsiella tarda b Phương pháp tiến hành Môi trường sử dụng cho thử nghiệm môi trường Aesculin Medium hay môi trường Edwards Sau cấy chủng, chủng có hoạt tính thủy phân esculin làm đen mơi trường c Đọc kết quả: Thử nghiệm (+) màu môi trường chuyển thành màu đen hay nâu đen, thử nghiệm là(-) mfu môi trường không đổi THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG BIẾN DƯỠNG CITRATE: a.Nguyên tắc: Một số vi sinh vật có khả sử dụng Citrate làm nguồn carbon để thu lấy lượng vật chất Sự biến dưỡng Citrate thường thông qua kết hợp với acetyl- CoA thành oxaloacetate để vào chu trình Krebs hay chu trình tricarboxylic acid Sản phẩm biến dưỡng Citrate thay đổi tùy pH môi trường Khi pH tăng, môi trường chuyển sang kiềm, lượng acetatevàformate tạo thành tăng lactate CO2 giảm Ở pH trung tính sản phẩm chủ yếu làCO2 vàacetate Ở pH acid, sản phẩm tạo chủ yếu aceton lactate Như biến dưỡng citrate vi sinh vật tạo CO2 làm kiềm hóa mơi trường Mặt khác vi sinh vật dùng citrate làm nguồn carbon có khả dùng muối amonium làm nguồn đạm Sự phân giải muối amonium dùng làm nguồn đảmtong môi trường sinh NH3, làm kiềm hóa mơi trường Như thử nghiệm khả dùng citrate làm nguồn carbon có chứa đạm dạng amonium, khả tăng trưởng chủng thể qua khả biến dưỡng nguồn carbon citrate nguồn đạm amonium làm tăng giá trị pH môi trường Sự gia tăng giá trị pH thị đổi màu thị pH môi trường Thử nghiệm dùng để phân biệt nhóm Klebsiella, Entrobacter (+) với E.coli (-) thử nghiệm IMViC hay để phân biệt Edwardsiella (-) với Salmonella (+) Chủng dùng làm đối chứng (+) cho thử nghiệm proteus rettgeri , (-) Staphylococcus epidermidis b Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho khả biến dưỡng citrate môi trường rắn Simone citrate agar (SCA) hay môi trường Christensens citrate sulfite agar (CCSA) Môi trường SCA chứa sodium citrate hay potassium citrate làm nguồn carbon nhất, thị bromoyhymol blue, pH 6,9 Chỉ thị có màu vàng pH 6,0, màu xanh lục với pH trung tính màu xanh dương pH lớn 7,6.Chủng mơi trường KIA hay mơi trường thích hợp khác cấy ria bề mặt môi trường SCA rắn ống thạch nghiêng, ủ 35oC/24-48h hay kéo dài đến ngày cần thiết Môi trường CCSA chứa nguồn đạm cystein, thị màu phenol red, pH 6,7.Mơit trường chưa sử dụng có màu kem đến nâu Ở pH acid (8,4) trở thành màu đỏ Chủng vi sinh vật cấy vàủ điều kiện môi trường SCA 47 c Đọc kết quả: - Trường hợp môi trường SCA, thử nghiệm là(+) xuất khuẩn lạc môi trường chuyển màu xanh dương, ngược lại, môi trường giữ nguyên trạng thái ban đầu - Trường hợp môi trường CCSA , thử nghiệm (+) môi trường chuyển sang màu đỏ, ngược lại, môi trường không đổi màu THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG SINH INDOL: a Nguyên tắc: Tryptophan mọt acid amin bị oxi hóa số vi sinh có hệ enzyme tryptophanase tạo nên sản phẩm cóchứa gốc indol Sản phẩm trung gian phản ứng oxi hóa tryptophan indolpyruvic acid IPA Phân tử sau bị biến đổi theo hướng loại nhóm amin thành indol hay theo hướng loại nhóm carboxyl thành skatol Tryptophanase xúc tác phản ứng loại nhóm amin tạo thành indol Việc phát indol thực phản ứng phân tử với thuốc thử chứa Dimethylaminobenzaldehyde( p- DMABA) Nhân pyrol indol chứa nhóm CH2 kết hợp với nhân benzen p-DMABA tạo nên phức chất dạng quinone có màu đỏ b Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm nước tryptone hay môi trường kết hợp MIU( motility indol urea), SIM( sulphite indol motility) cần kiểm tra lúc nhiều đặc tính sinh hóa cần thiết Hai loại thuốc thử cóthể sử dụng cho thử nghiện làthuốc thử Erlich vàthuốc thử Kovac’s Sinh khối chủng cấy vào ống môi trường lỏng thuộc loại thuốc thử nêu trên, ủ nhiệt độ 37oC/24-48h Trước bổ sung thuốc thử cóthể bổ sung 1ml eter hay xylene vào ống nghiệm, lắc để tách chiết indol lên lớp dung môi hưũ Nhỏ giọt thuốc thử vào dịch nuôi cấy, để yên vài phút, theo dõi tạo màu đỏ dung môi hữu c Đọc kết quả: Thử nghiệm dương có màu đỏ xuất lớp dung môi hữu cơ, âm khơng cósự thay đổi màu lớp dung mơi hữu Đơi có xuất màu cam làdo skatol, làtiền chất methyl hóa indol tạo 6.THỬ NGHIỆM MR ( METHYL RED): a Nguyên tắc: Thử nghiệm MR nhằm phân biệt vi sinh vật dựa khác biệt khả tạo vàduy trìcác sản phẩm biến dưỡng cótính acid bền mơi trường quátrình lên men glucose Chỉ thị đỏ methyl red giúp phân biệt nồng độ ion H+ diện môi trường sau vi sinh vật lên men glucose Chỉ thị có màu thay đổi khác tùy dãy pH hay nồng độ ion H+: đỏ pH thấp 4,4, màu cam vùng pH 5,0- 5,8, màu vàng pH 6,0 hàm lượng ion H+ phụ thuộc vào tỉ lệ CO2 vàH2 đường chuyển hóa đường vi sinh vật Đối với vi sinh vật đường ruột, thời gian nuôi cấy để thử nghiệm phản ứng MR thường xác định khoảng 18-24h Tuy nhiên sinh vật tạo acid môi trường từ chúng bắt đầu tăng trưởng Khi bắt đầu thời gian nuôi cấy, vi sinh vật có phản ứng MR(+) có đặc tính tích lũy acid mơi trường ngày nhiều độ pH môi trường ngày giảm, ngược lại vi sinh vật cho phản ứng MR(-), tiếp tục chuyển hóa sản phẩm có tính acid tạo thàng sản phẩm trung tính Thử nghiệm MR phụ thuộc lớn vào thời gian nuôi cấy tiến hành thời gian 1- ngày 37oC b Phương pháp tiến hành: Thử nghiệm tiến hành ống nghiệm chứa môi trường lỏng glucose photphate( MR-VP Broth) Dùng que cấy vòng lấy lượng nhỏ sinh khối từ khuẩn lạc chủng môi trường KIA, 37oC khoảng 2-5 ngày Thêm vào vài giọt thuốc thử đỏ methyl red vào ống nghiệm dịch nuôi cấy, đọc kết 48 c Đọc kết quả: Thử nghiệm MR (+) mơi trường có màu đỏ sau bổ sung thuốc thử, là(-) có màu vàng, trường hợp cómàu cam, cần tiếp tục ủ ống mơi trường cógiống ngày vàthực lại thử nghiệm THỬ NGHIỆM VP( VOGES- PROSKAUER) a Nguyên tắc: Ở vi sinh vật, biến dưỡng lượng phương thức lên men từ Gluose qua đường đường phân tạo chất trung gian chủ yếu pyruvic acid Để khôi phục dự trữ NAD+ tế bào phục vụ cho đường đường phân, loài vi sinh vật, sau acid pyruvic tiếp tục chuyển hóa theo đường chuyển hóa khác tạo srn phẩm lên men cuối khác Họ Enterobacteriaceae có đặc tính chung lên men sinh hỗn hợp acid acid formic, acid acetic, acid succinic, ethanol, H2 vàCO2 họ cóthể chia làm nhóm khơng sinh 2,3-butanediol( vídụ E.Coli) nhóm sinh 2,3-butanediol( vídụ Klebsiella, Enterobacter) Phân tử 2,3- butanediol chuyển hóa qua lại thành acetoin: điều kiện cóoxi mơi trường cótính kiềm, 2,3- butanediol bị oxi hóa thành acetoin nhờ xúc tác enzyme 2,3- butanediol dehydrogenase; ngược lại, acetoin cóthể bị khử thành 2,3- butanediol hoạt tính enzyme diacetyl reductase Ngồi ra, acetoin cịn bị oxi hóa thành diacetyl Như vậy, cóoxi vàpH kiềm, 2,3- butanediol bị chuyển hóa thành acetoin, đến lượt mình, acetoin bị oxi hóa thành diacetyl, chất tham gia vào phản ứng tạo màu thử nghiệm VP Như thử nghiệm VP cóthể giúp phân biệt lồi Enterobacteriaceae dwuja oxi hóa acetoin ( acetylmethylcarbinol, AMC) từ 2,3- butanediol thành diacetyl Sự oxi hóa acetoin thành diacetyl tăng cường nhờ xúc tác α-naptol Diacetyl kết hợp với nhân guanidine cótrong pepton kết tụ thành phức diacetyl-guanidine có màu đỏ Trong thuốc thử Kloblentz O’ Meara cóchứa creatine cótác dụng bổ sung nuồn guanidine b Phương pháp tiến hành: Môi trường thử nghệm cho phản ứng VP làmôi trường lỏng Clark-Lubs ( mơi trường MR-VP), cópH 6.9 Dùng que cấy vịng cấy vào ống mơi trường MR-VP sinh khối từ khuẩn lạc chủng ủ 18-24h môi trường KIA hay TSI Ủ yên ống môi trường 37oC 24-48h hay đến 10 ngày cần thiết Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử trực tiếp vào mơi trường Có3 loại thuốc thử VP là: Thuốc thử Barritt: dung dịch A 5% α-naptol cồn tuyệt đối, dung dịch B KOH40% hay NaOH Thuốc thử Kloblentz: gồm dung dịch A α-naptol cồn 95%, dung dịch B 0,3%creatin 40%KOH hay NaOH Thuốc thử O’Meara: dung dịch 0,3 %creatin 40%KOH hay NaOH Khi sử dụng loại thuốc thử cóhai thành phần trước tiên nhỏ giọt dung dịch thuốc thử A sau cho giọt thuốc thử B Đối với thuốc thử thành phần, bổ sung 1ml thuốc thử vào ống môi trường, lắc nhẹ ống 1phút để oxi hóa acetoin Đọc kết sau 20 phút hay chậm 4h c Đọc kết quả: Thử nghiệm VP là(+) có màu đỏ bề mặt môi trường, là(-) bề mặt môi trường khơng đổi màu THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG TÍNH DI ĐỘNG: a Nguyên tắc: Vi sinh vật di động nhờ khả có cấu trúc protein gọi làtiên mao, có nhiều vi khuẩn hình que, số vi khuẩn cóhình cầu Khả di động làmột dùng để phân biệt vi sinh vật Khả quan sát nhờ vào tăng trưởng di động vi sinh vật vào bên mơi trường thạch mềm Ngồi ra, triphenyltetrazolium chloride 49 ( TTC) cóthể bổ sung vào mơi trường để giúp phát dễ dàng vị tríhiện diện tế bào vi sinh vật môi trường hợp chất vào bên tế bào bị khử thành formazan có màu đỏ b Phương pháp tiến hành: Sử dụng môi trường thạch mềm chứa 0,5% agar Môi trường đun tan, phân phối vào ống nghiệm dung tích 5ml vơ trùng Trường hợp sử dụng TTC tong môi trường để phát vị trítế bào, dung dịch 1%TTC vơtrùng màng lọc 0,45µm, sau bổ sung vào mơi trường thạch mềm hấp khử trùng thành nồng độ 0,05g/l trước làm đông môi trường Dùng que cấy thẳng thu lấy sinh khối từ khuẩn lạc chủng sau ủ nhiệt độ thích hợp 18-24h mơi trường KIA hay mơi trường thích hợp khác Chủng cấy cách đâm sâu đầu que cấy xuyên vào môi trường ống nghiệm đến độ sâu khoảng 2cm Các ống môi trường ủ 37oC 24-48h, (-) ủ tiếp 21-25oC ngày Thực song song việc ủ điều kiện tương tự ống đối chứng Do nhiệt độ cóảnh hưởng quan trọng đế khả di động vi khuẩn nên cần thiết nên thực đồng thời việc ủ môi trường cấy ống chủng hai điều kiện nhiệt độ khác c Đọc kết quả: Trường hợp môi trường thạch mềm: thử nghiệm là(+) vi sinh vật mọc lan khỏi đường cấy làm đục môi trường xung quanh; là(-) vi sinh vật mọc theo đường cấy môi trường xung quanh Ở ống đối chứng khơng cóvi sinh vật tăng trưởng, mơi trường Trường hợp mơi trường thạch mềm có bổ sung TTC; thử nghiệm là(+) vi sinh vật tạo vùng đục màu đỏ lan tỏa vào môi trường hai bên đường cấy; là(-) vi sinh vật tạo thành vùng màu đỏ dọc theo đường cấy Ở ống đối chứng khơng có vi sinh vật tăng trưởng, môi trường Thử nghiệm sinh H2S: a Nguyên tắc: Một số vi sinh vật tổng hợp enzyme desulphurhydrase xúc tác chuyển hóa điều kiện kỵ khí acid amine chứa lưu huỳnh cysteine, cystin, methionine giải phóng H2S Thành viên quan trọng nhóm enzyme làcysteine desulphurhydrase Các acid amin làsản phẩm quátrình thủy phân protein thành acid amine KhíH2S sinh tạo màu đen với thị sulphite chứa mơi trường ni cấy Ngồi nguồn đạm hữu cơ, H2S cịn cóthể tạo phản ứng khử thiosulphate Na2S2O3 enzyme thiosulphate reductase vi sinh vật để tạo sulphite vàH2S Các hợp chất sử dụng môi trường làm thị H2S cóthể làcác hợp chất sắt FeSO4 amonium sulphate sắt II hay sắt III KhíH2S phản ứng với ion sắt tạo thành sulphate sắt FeS không tan có màu đen Ngồi ra, acetate chì Pb(C2H3O2)2 dùng làm thị sulphite hợp chất phản ứng với H2S tạo sulphate chìPbS khơng tan màu đen Chỉ thị acetate chì có độ nhạy cao cho phép phát lượng nhỏ H2S tạo lồi vi khuẩn khơng thuộc họ Enterobacteriaceae, vídụ Brucella Thử nghiệm khả sinh H2S thường sử dụng để phân biệt số loài thuộc họ Enterobacteriaceae vàgiống Proteus b Phương pháp tiến hành: Các loại mơi trường cóthể sử dụng cho thử nghiệm sinh H2S làKIA, TSI, SIM, BSA tất môi trường hấp khử trùng 121oC 15 phút phân phối vào ống nghiệm vơ trùng sau giữ thành ống thạch nghiêng Dùng que cấy vòng cấy vòng cấy sinh khối chủng cấy sâu vào đáy ống thạch nghiêng Sau cấy xong, ống cógiống vi khuẩn ủ điều kiện 37oC/ 24-48h hay đến ngày cần thiết 50 Ngoài ra, thử nghiệm cách dùng acetate chì5% gắn lên thành ống mơi trường lỏng Phương pháp dùng để hạn chế độc tính ion sắt, chìlên chủng vi sinh vật cần kiểm định, mặt khác có độ nhạy cao ( phát H2S mức 0,01M) Trong trường hợp này, việc kết hợp cấy lượng sinh khối lớn vào ống môi trường sử dụng giấy tẩm acetate chìlàm thị cóthể cókết vòng 30 phút hay 1-2h hầu hết vi sinh vật sinh H2S c Đọc kết quả: Thử nghiệm khả sinh H2S là(+) xuất màu đen môi trường KIA, TSI, SIM, khuẩn lạc màu đen môi trường BSA hay xuất màu nâu đen giấy tẩm acetate chì.Thử nghiệm là(-) môi trường không xuất hay chuyển màu đen 10 THỬ NGHIỆM DECARBOXYLASE: a Nguyên tắc: Các loài vi khuẩn đường ruột khác mức độ cảm ứng tạo thành enzyme carboxylase cóvai trịxúc tác phản ứng loại bỏ nhóm carboxyl số acid amin tạo amine hay diamine vàCO2 điều kiện kỵ khí.Các enzyme cảm ứng tổng hợp môi trường cótính acid vàchứa chất cảm ứng đặc hiệu Họ decarboxylase gồm nhiều thành viên, loại tác động lên chất định Có loại decarboxylase quan trọng kiểm nghiệm vi sinh vật lysine decarboxylase (LDC), orthinine decarboxylase (ODC) arginine decarboxylase (ADC) có chất làlysine, orthinine, arginine Phản ứng xúc tác LDC loại bỏ CO2 khỏi lysine, phóng thích CO2 vàdẫn đến hình thành cadaverine Trường hợp ODC vàADC sản phẩm tạo làCO2 vàputrescine Ngoài ra, arginine cịn cóthể chuyển hóa thành citruline nhờ xúc tác enzyme arginine dihydrolase (ADH) trước chuyển hóa tiếp thành putrescine CO2 Do vậy, thử nghiệm argine decarboxylase (ADC) ký hiệu làADH Trong tất trường hợp nêu trên, CO2 làm tăng giá trị pH môi trường ghi nhận qua biến đổi màu thị pH Các thử nghiệm decarboxylase thường dùng để phân loại định danh loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae b Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng làDecarboxylase Basal Medium, chứa thị bromocresol purple, pH 6,0 Chỉ thị màu thay đổi từ pH 5,2- 6,8 Môi trường lỏng pha chế vàhấp khử trùng theo phương pháp thông thường Sau làm nguội môi trường phân vào ống nghiệm có dung tích 4-5ml vơ trùng Chủng cấy với mật độ thấp vào ống mơi trường, sau ống bổ sung 23ml dầu khoáng hay parafin ủ 37oC/ 24h-4 ngày Ooxxi tan môi trường vi khuẩn sử dụng cho tăng trưởng làm môi trường trở nên cạn kiệt ooxxi Trong điều kiện enzyme decarboxylase cảm ứng cóhiện diện chất vàphản ứng chuyển hóa cóthể xảy c Đọc kết quả: Thử nghiệm (+) mơi trường trở nên đục vàcómàu tím, là(-) mơi trường có màu vàng 11 Thử nghiệm coagulase: a Nguyên tắc: Một số vi sinh vật đặc biệt làcác lồi thuộc giống Staphylococcus có khả tiết mơi trường enzyme coagulase có tác dụng làm kết tụ thành phần huyết tương, tạo thành khối đơng làm đơng kết huyết tương Có nhiều giả thuyết khác đề xuất để giải thích chế làm đơng huyết tương coagulase khơng đề cập đây.Coagulase có chất làprotein nên nhanh chóng bị bất hoạt vàthủy phân protease Tuy nhiên enzyme khábền với nhiệt nhiệt độ 60oC 30 phút màkhơng hoạt tính 51 b Phương pháp tiến hành: Trường hợp dùng huyết tương nên dùng huyết tương người hay thỏ dạng đông khô thương phẩm Tuy nhiên tự điều chế huyết tương cách ly tâm máu chứa chất chống đông để loại bỏ tế bào máu, thu nhận huyết tương Trường hợp sử dụng fibrinogen, cóthể tự điều chế fibrinogen cách trộn huyết tương nước muối bão hịa theo tỉ lệ 1:1 để tủa fibrinogen, sau thu nhận fibrinogen ly tâm Tủa hòa tan vào nước cất vôtrùng theo tỉ lệ 1:4, bảo quản 4oC thời gian ngắn hay -20oC thời gian dài Cần kiểm tra chất lượng huyết tương hay fibrinogen chủng dương tính (S.aureus) âm tính (S.epidermis) trước sử dụng Ngồi ra, sử dụng citrate làm chất chống đông máu để thu lấy huyết tương fibrinogen, sử dụng cần bổ sung đơn vị heparin/ml huyết tương, dịch fibrinogen để tránh kết dương tính giả thường gặp vi sinh vật cókhả biến dưỡng citrate Hiện nay, EDTA thường dùng làm chất chống đông thay cho citrate để loại trừ tượng coagulase dương tính giả chủng biến dưỡng citrate Hoạt tính coagulase cóthể thử hai phương pháp: Thử phiến kính: nhỏ lên phiến kính giọt nước cất hay nước muối sinh lý, dùng que cấy vòng thu lấy lượng lớn sinh khối từ khuẩn lạc hay dịch nuôi cấy chủng vào giọt nước để tạo thành huyền phùcómật độ tế bào cao Thêm vào vịng que cấy huyết tương pha, hòa tạo huyền phù đồng Nếu phản ứng (+) tính xuất ngưng kết vòng 20 giây, (-) sau 20 phút khơng cósự ngưng kết xảy Kết (-) cần thử nghiệm tiếp việc nuôi cấy ống nghiệm Thử ống nghiệm: cho vào ống nghiệm 0,5ml huyết tương người hay thỏ không pha lỗng, bổ sung 0,5ml dịch ni cấy chủng hay lượng lớn sinh khối khuẩn lạc, xoay nhẹ ống để trộn khuẩn lạc, ủ 37oC/4h, quan sát ghi nhận kết ngưng kết 30 phút, tiếp tục ủ 24 h không thấy xuất khối kết tụ c Đọc kết quả: Nếu thử phiến kính : (+) cósự tụ rõtrong vịng 20 giây, (-) không cpos kết tụ, phải thử nghiệm lại ống nghiệm Nếu thử ống nghiệm: là(+) cósự kết tụ, là(-) khơng cósự kết tụ 12 THỬ NGHIỆM UREASE: a Nguyên tắc: Một số vi sinh vật tổng hợp enzyme urease xúc tác thủy phân urea Urea làdiamide acid carbonic Urease thuộc nhóm amidase xúc tác thủy phân liên kết amide C-N phân tử urea để giải phóng hai phân tử NH3 vàCO2 Enzyme hoạt động tối ưu pH 7,0, thuộc nhóm enzyme cấu trúc, diện thường xuyên tế bào không phụ thuộc vào diện hay không urea Sự phóng thích NH3 vàCO2 làm tăng pH mơi trường cóthể theo dõi chất thị pH Thử nghiệm urease đặc trưng cho loài Proteus spp, thường dùng để phân biệt dạng Proteus với thành viên khác nhóm Enterobacteriaceae b Phương pháp tiến hành: Thínghiệm urease thực hai môi trường: - Môi trường lỏng Rustigian- Stuart’s Urea Broth, chứa thị đỏ phenol, chuyển màu từ vàng sang đỏ ( vùng chuyển màu làpH 6,8- 8,4) Dùng que cấy vòng cấy lượng sinh khối lớn từ khuẩn lạc chủng vào ống chứa 3ml môi trường vô trùng, lắc nhẹ ống để trộn vi khuẩn vàủ 37oC/48h Quan sát chuyển đổi màu vào thời điểm 8,12,24,48h ủ Môi trường rắn Christensen Urea, chứa thị đỏ phenol môi trường lỏng trên, dùng que cấy vòng cấy lượng lớn sinh khối khuẩn lạc chủng lên bề mặt ống thạch nghiêng chứa môi trường Christensen Urea, ủ 37oC/24h Môi trường Christensen Urea dùng dạng môi trường lỏng môi trường Rustigian- Stuart’s Urea Broth 52 c Đọc kết quả: Trường hợp sử dụng môi trường lỏng Rustigian- Stuart’s Urea Broth thử nghiệm là(+) mơi trường trở thành màu đỏ tím, là(-) mơi trường có màu vàng cam khơng đổi Trường hợp sử dụng ống thạch nghiêng Christensen Urea, thử nghiệm là(+) màu mơi trường chuyển thành màu đỏ tím Bề dày môi trường bị chuyển màu thị mức độ thủy phân urea (++++: toàn thạch đổi màu, ++ mặt thạch đổi màu, +: mặt thạch đỉnh đổi màu, phần mơi trường cịn lại khơng đổi màu) Ngồi ra, cịn phân biệt (+) nhanh màu đổi vòng 6h; (+) chậm màu đổi sau 1-6 ngày Trường hợp màu môi trường làvàng hay vàng nhạt hồn tồn khơng đổi : thử nghiệm là(-) 13 THỬ NGHIỆM GELATINASE: a Nguyên tắc: Một số vi sinh vật tổng hợp enzyme gelatinase ngoại bào xúc tác thủy phân gelatinase thành polypeptide acid amin Để nhận biết khả làm tan gelatin vi sinh vật, chất bổ sung vào mơi trường ni cấy Sau cấy chủng cókhả tiết gelatinase làm tan chảy môi trường thành dạng lỏng b Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng môi trường dinh dưỡng chứa gelatin Nutrient Gelatin ống thạch sâu Tiến hành cấy lượng lớn sinh khối chủng sâu vào ống môi trường, ủ nhiệt độ phòng 14 ngày Thực song song với ống đối chứng Một phương pháp thực khác làcấy vi sinh vật môi trường dinh dưỡng chứa gelatin đĩa petri, ủ ngày nhiệt độ phịng Bổ sung bề mặt mơi trường 5-10ml dung dịch trichloacetic acid (TCA) để làm kết tủa gelatin c Đọc kết quả: Trong ống thạch sâu thử nghiệm (+) môi trường bị tan chảy ống cócấy chủng ống đối chứng trạng thái đông đặc Thử nghiệm là(-) môi trường ống không bị tan chảy Trường hợp sử dụng đĩa petri, môi trường dunh dưỡng chứa gelatin, khuẩn lạc có gelatinase dương tính tạo vịng phân giải gelatin rõ, ống đối chứng trở nên đục nhuộm TCA 53 PHẦN 4: ỨNG DỤNG VI SINH VẬT CÔNG NGHIỆP Bài 14: MỘT SỐ ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG LÊN MEN THỰC PHẨM 14.1 Lên men lactic * Cách 1: - Nguyên liệu: Dưa cải, nước muối - 3,5% 500 ml, đường: thìa càphê - Cách làm: + Dưa cải bẹ để héo, rửa sạch, cắt khúc, để + Pha 500ml dung dịch NaCl - 3,5% vàbổ sung thêm vào thìa cà phê đường + Xếp dựa vào lọ thuỷ tinh vàém chặt Để nước muối từ từ cho ngập dưa + Lên men nhiệt độ 28 – 300C - ngày + Vi khuẩn lactic sống bề mặt rau làtác nhân quátrình * Cách 2: - Cho vào bình tam giác + 150 ml sữa tươi khử trùng + thìa càphêsữa chua khuấy cho thật nhuyễn - Lắc bình để men giống tan - Để tủ ấm 30 – 350C - 4h ta sữa (chua) đông tụ Xác định đặc trưng quátrình Xác định đối tượng vi sinh vật tham gia: - Làm tiêu giọt ép từ nước dưa cải chua để quan sát hình dạng, xếp tế bào vi khuẩn lên men lactic - Làm tiêu giọt treo để quan sát chuyển động vi khuẩn lactic từ dịch sữa chua - Yêu cầu nhận biết dạng cầu khuẩn vàtrực khuẩn vi khuẩn lactic 14.2 Lên men bánh mỳ Nguyên liệu: Bột mỳ, đường, nước , nấm men Saccharomyces cerevisiae Hình 21: Nấm men Saccharomyces cerevisiae kính hiển vi quang học (a) vàkính hiển vi điện tử (b) Cách làm: - Cho bột mỳ, đường, nấm men vào thố Nhồi bột với lượng nước vừa phải - Để tủ ấm 300C/ 30phút Quan sát khối bột nhào vàgiải thích chất tượng 54 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phương pháp MPN (Most Probable Number): - Phương pháp MPN (Phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ) phương pháp dùng để ước lượng số lượng vi sinh vật diện đơn vị thể tích dựa vào bảng Mac Crandy - Thínghiệm thực độ pha loãng liên tiếp Mỗi độ pha lỗng cóthể sử dụng để cấy 3, 5, 10 ống nghiệm - Các bước thực hiện: Cho vào ống nghiệm môi trường nuôi cấy phùhợp cho sinh trưởng vàphát triển vi sinh vật cần kiểm tra Định lượng thể tích xác dung dịch mẫu nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp nhau, nồng độ pha loãng cấy vào 3, 5, 10 ống nghiệm - Dựa vào kết biểu kiến chứng minh tăng trưởng vi sinh vật cần kiểm tra ống nghiệm để xác định ống dương tính Tra bảng Mac Crandy để cókết Bảng Mac Crandy cho loạt ống nghiệm nồng độ Lượng mẫu cấy/ống 0,1 0,01 0,001 0 0 1 0 1 0 0 1 1 1 1 2 1 0 2 2 1 2 MPN/g 1100 Phụ lục 2: Biểu mẫu kiểm tra vệ sinh thực phẩm Công Ty Trách Nhiệm Hữu Hạn ĐC: ĐT: - Fax: ********************************** KẾT QUẢ PHÂN TÍCH VI SINH SẢN PHẨM MICROBIOLOGICAL ANALYSIS REPORT OF PRODUCT Số/ No: / VS/ 09 Ngày lấy mẫu/ Date of sampling: 07/04/2009 Nơi lấy mẫu/ Place of sampling: Kho thành phẩm Ngày phân tích/ Date of analysis: 07/04/2009 Ngày sản xuất/ Productiondate: 05/04/2009 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH / RESULT CHỈ TIÊU / CRITERIA Salmonella V cholerae V paraheamolyticus 2x102 1.2x102 Neg (-) 1x102