Bài giảng thực hành vi sinh vật môi trường phạm thị lan

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG BÀI GIẢNG THỰC HÀNH VI SINH VẬT MƠI TRƯỜNG Người biên soạn: Phạm Thị Lan Bộ mơn: CNKTMT Nha Trang, tháng năm 2012 BÀI : THỰC HÀNH PHA MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG I Khái niệm: - Các chất dinh dưỡng hợp chất tham gia vào trình trao đổi chất nội bào - Môi trường dinh dưỡng hỗn hợp gồm chất dinh dưỡng chất có nhiệm vụ trì oxi hoá khử, áp suất thẩm thấu tế bào ổn định độ pH môi trường - u cầu mơi trường dinh dưỡng: Có đủ chất dinh dưỡng cần thiết; có độ pH thích hợp; có độ nhớt định; khơng chứa yếu tố độc hại; hồn tồn vơ trùng - Phân loại môi trường dinh dưỡng: Người ta dựa sở khác để phân loại môi trường II Phương pháp làm môi trường Làm môi trường để thực việc phân lập, nhân giống, giữ giống vi sinh vật, đồng thời để nuôi cấy nghiên cứu đặc điểm sinh học chúng 2.1 Nguyên tắc việc chế tạo môi trường - Dựa sở nhu cầu chất dinh dưỡng khả đồng hoá chất dinh dưỡng loại sinh vật - Để đảm bảo cân áp suất thẩm thấu môi trường tế bào vi sinh vât nên cần điều chỉnh tỷ lệ nồng độ chất thành phần môi trường - Đảm bảo điều kiện hoá lý cần thiết cho hoạt động trao đổi chất vi sinh vật 2.2 Các bước chế tạo môi trường dinh dưỡng: Pha chế: + Cân, đong thật xác thành phần mơi trường pha chế theo trình tự hướng dẫn tài liệu + Môi trường lỏng: Cân, đong cất cho hồ tan vào nước + Mơi trường đặc: - Cân agar, hố chất hồ tan nước Điều chỉnh độ pH môi trường: + Muốn điều chỉnh độ pH môi trường người ta dùng HCl 10 % hay NaCl 10 % Ngoài dùng số hố chất khác như: H3PO4, H2SO4, KOH, NaHCO3, Na2CO3 + Muốn kiểm tra độ pH môi trường ta nên dùng máy đo pH (pH-metre) Phương pháp nhanh nhạy cho độ xác cao Trong phịng thí nghiệm dùng thị màu xanh bromotomol hay giấy quỳ để đo pH Phương pháp tiện lợi, nhanh không cho độ xác cao Phân phối mơi trường vào dụng cụ: Người ta thường phân phối môi trường vào ống nghiệm, đĩa pêtri, bình tam giác Trình tự phân phối gồm bước sau: + Môi trường cần đun cho hoá chất lỏng đổ qua phễu thuỷ tinh vào dụng cụ + Tay trái giữ dụng cụ chứa môi trường + Tay phải kẹp nút kéo + Nhanh tay rót mơi trường vào dụng cụ đậy nút lại * Chú ý: Đối với ống nghiệm: - Nếu dùng môi trường làm thạch nghiêng lượng mơi trường cần phân phối chiếm 1/4 thể tích ống nghiệm - Nếu làm thạch đứng lượng mơi trường cần phân phối từ 1/2 - 1/3 thể tích ống nghiệm Đối với bình cầu hay bình tam giác, lượng mơi trường phân phối chiếm 1/2 - 1/3 thể tích bình Các thao tác phân phối phải nhanh, gọn, khéo léo để mơi trường khơng dính lên miệng dụng cụ nút việc phân phối cần thực xong trước môi trường bị đông đặc - Khử trùng môi trường: Tuỳ theo tính chất điều kiện cụ thể loại mơi trường mà có chế độ phương pháp khử trùng khác Làm thạch nghiêng, thạch đứng, đổ thạch vào đĩa pêtri: + Làm thạch nghiêng: Cần tiến hành sau khử trùng môi trường vừa kết thúc môi trường chưa đông đặc + Làm thạch đứng: Đặt ống nghiệm có mơi trường làm thạch đứng vào giá ,để n môi trường nguội đông đặc + Đổ thạch vào đĩa pêtri: Tồn quy trình đổ thạch vào đĩa pêtri thực tủ cấy vô trùng * Chú ý: Thao tác đổ thạch phải khẩn trương khéo léo để hạn chế nhiễm khuẩn Mặt thạch phải phẳng, nhẵn, có độ dày khoảng 2mm Thơng thường 1/4 lít mơi trường phân phối 22 - 25 đĩa pêtri Sau đổ môi trường vào đĩa pêtri, - ngày sau kiểm tra lại xem môi trường có bị nhiễm khuẩn khơng sử dụng để cấy hay phân lập � Nhớ viết vào nhãn: Tên môi trường Khử trùng ngày tháng năm � Để vào nơi cất giữ môi trường để tiện cho việc theo dõi, sử dụng bảo quản Bảo quản kiểm tra môi trường: + Môi trường chưa dùng cần bảo quản chỗ mát, hạn chế tác dụng ánh sáng, nhiệt độ từ – 50C không để môi trường bị khô + Trước sử dụng, để kiểm tra độ vô khuẩn môi trường, người ta thường đặt chúng vào tủ ấm 370C, 48 - 72h Sau lấy quan sát, loại bỏ ống có vi sinh vật phát triển sử dụng ống nghiệm, đĩa pêtri có môi trường đạt yêu cầu BÀI : CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT I Khái niệm : Phân lập vi sinh vật trình tách riêng loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu đư a dạng khiết Đây khâu có ý nghĩa quan trọng việc nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật Vi sinh vật dạng khiết giống vi sinh vật đươc tạo từ tế bào ban đầu - Trong thiên nhiên vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật thường tồn dạng hỗn hợp gồm nhiều lồi khác Muốn nghiên cứu hình thái, sinh lý, lý hoá sử dụng vào thực tiễn lồi cần phải đưa chúng dạng khiết - Nguyên tắc: Tách rời tế bào vi sinh vật; Nuôi cấy tế bào môi trường dinh dưỡng đặc trưng khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt II Phương pháp phân lập vi sinh vật khiết: Quá trình phân lập vi sinh vật dạng khiết: Với hầu hết loại mẫu nghiên cứu, trình phân lập vi sinh vật dạng khiết gồm bước sau: - Tạo khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu - Phân lập vi sinh vật khiết - Kiểm tra độ tinh khiết khuẩn lạc 2.1 Tạo khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật môi trường phân lập a Yêu cầu: - Nếu mẫu ban đầu dạng rắn phải đưa dạng lỏng cách: + Nghiền mẫu + Hoà tan mẫu nước cất vô trùng Sau thực mẫu dạng lỏng + Tiếp tục pha loãng nồng độ cần thiết + Cấy mẫu môi trường đặc trưng - Để có chủng thuần, cần tiến hành lặp lại nhiều lần kỹ thuật pha loãng nêu tất khuẩn lạc xuất môi trường đồng Mức độ khiết chủng kiểm tra sau: - Việc tạo hộp ria từ khuẩn lạc đơn chủng tạo loại khuẩn lạc bề mặt mơi trường có hình thái giống với khuẩn lạc chủng ban đầu - Mỗi khuẩn lạc đơn chứa loại tế bào có hình thái giống quan sát kính hiển vi Trong thao tác tạo khuẩn lạc đơn cần lưu ý hạn chế thấp nguy bị nhiễm cách thực nghiêm túc yêu cầu thao tác vô trùng b Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn: - Có nhiều kỹ thuật ria khác để thực hộp ria tạo khuẩn lạc đơn Một số kỹ thuật ria thường dùng: kỹ thuật ria chữ T , kỹ thuật ria bốn góc, kỹ thuật ria tia, kỹ thuật ria liên tục - Thao tác kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn thực sau: Kỹ thuật hộp ria: - Dùng que cấy vịng thao tác vơ trùng thu giống - Ria đường đĩa pêtri chứa môi trường thích hợp (ria chữ T ria bốn góc) Sau đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy làm nguội trước thực đường ria - Bao gói đĩa pêtri, ủ nhiệt độ thời gian thích hợp tủ ấm Kỹ thuật hộp trải: - Dùng pipetman đầu típ vơ trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1 ml dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường đĩa pêtri - Nhúng đầu gạt (que trải) thuỷ tinh vào cồn 700, hơ qua lửa để khử trùng Để đầu gạt nguội không gian vô trùng lửa - Mở đĩa pêtri, đặt nhẹ nhàng gạt lên bề mặt thạch đĩa petri Dùng đầu gạt xoay, trải dịch giống lên bề mặt thạch Trong trải, thực xoay đĩa vài lần, lần khoảng 1/2 chu vi đĩa tạo điều kiện cho gạt trải dịch giống khắp bề mặt môi trường - Rút gạt khỏi đĩa, đậy đĩa, gói ủ nhiệt độ thời gian thích hợp tủ ấm Kỹ thuật hộp đổ: - Dùng pipetman đầu típ vơ trùng, thao tác vô trùng chuyển ml dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường đĩa pêtri - Đổ khoảng 15 - 20 ml môi trường đun chảy để nguội đến 45 – 550 C vào đĩa petri cấy mẫu - Xoay nhẹ đia petri chiều ngược chiều kim đồng hồ vài lần để dung dịch giống trộn môi trường cấy - Đậy nắp đĩa pêtri, để đông tự nhiên 2.2 Phân lập vi sinh vật môi trường đặc đĩa pêtri a Phân lập vi sinh vật hiếu khí: + Hút 0,1 ml dịch mẫu pha lỗng cho vào đĩa pêtri có mơi trường thích hợp + Dùng que gạt thủy tinh phân phối dịch mẫu trải khắp mặt thạch + Tiếp tục sử dụng que gạt gạt mẫu cho khắp mặt thạch đĩa pêtri thứ đĩa thứ + Đặt đĩa pêtri 1, 2, vào tủ ấm nhiệt độ thích hợp sau thời gian định tuỳ giống vi sinh vật ta nhận khuẩn lạc riêng rẽ từ đĩa thứ b Phân lập vi sinh vật kị khí: + Dùng mơi trường đặc ống nghiệm đem chưng cách thuỷ để loại bỏ khơng khí mơi trường + Để nguội mơi trường cịn 45 – 500 C + Hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống mơi trường, đậy nút lại, lắc trịn quanh trục ống nghiệm + Rót nhanh mơi trường ống nghiệm vào nắp đĩa pêtri đậy thật nhanh nắp lại, cho mặt nắp mơi trường khơng cịn khơng khí + Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc nắp đĩa petri ủ nhiệt độ thích hợp + Sau vi sinh vật phát triển, chọn khuẩn lạc riêng rẽ khối môi trường, dùng que cấy cắt khối mơi trường cấy vào mơi trường lỏng thích hợp 2.3 Kiểm tra độ tinh khiết giống phân lập Có nhiều cách kiểm tra: Kiểm tra vết cấy: Quan sát sinh trưởng vi sinh vật qua vết cấy môi trường đặc + Nếu vết cấy có bề mặt màu sắc đồng đều, chứng tỏ giống phân lập tinh khiết giữ lại + Nếu vết cấy khơng loại bỏ Kiểm tra lại độ chủng loại khuẩn lạc: + Chọn khuẩn lạc riêng rẽ môi trường thạch nghiêng + Tách khuẩn lạc hồ tan, pha lỗng nồng độ cần thiết nước cất vô trùng + Nhỏ giọt dịch vào đĩa pêtri có môi trường + Dùng que gạt phân phối giọt dịch khắp mặt thạch đĩa pêtri thứ nhất, đĩa thứ 2, thứ + Đặt đĩa pêtri vào tủ ấm với nhiệt độ thời gian thích hợp tuỳ loại vi sinh vật + Sau lấy quan sát khuẩn lạc riêng rẽ Sự khiết khuẩn lạc biểu khiết giống III Thực hành phân lập vi sinh vật từ loại canh trường khác 3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis: - Cỏ khô cắt nhỏ, cho vào bình tam giác - Bổ sung thêm: + Một chút phân + Nước đổ ngập cỏ - Đun sôi 15 phút để diệt tế bào sinh dưỡng tế bào không sinh bào tử - Đậy nút bông, để tủ ấm nhiệt độ 25 – 260 C 48 - 72 h - Kết quả: + Xuất lớp váng xám có nhiều vi khuẩn Bacillus sublitis cỏ khơ có bào tử vi khuẩn + Soi kính hiển vi : Tế bào Bac sublitis có hình que, dài, bào tử hình ơvan nằm xa tâm hay gắn tâm khuẩn lạc Tế bào có kích thước (3 - x 0,6) μm 3.2 Phân lập nấm mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus niger Mucor: - Có thể phân lập lồi nấm mốc cơm nguội, xơi làm mốc tương, bánh mì để khơ ngày - Thông qua màu sắc mốc để nhận diện + Mốc có màu trắng: Có thể Mucor hay Rhizopus + Mốc có màu đen Aspergillus niger + Mốc có màu xanh lục Penicillium italicum Loại mốc thường có vỏ cam, chanh để lâu ngày - Dùng que cấy đầu hình thước thợ lấy sợi nấm cấy vào mơi trường thạch nghiêng thích hợp (Czapek) 3.3 Phân lập nấm men: - Có thể phân lập nấm men dễ dàng từ môi trường như: + Bề mặt trái dịch ép số trái táo, lê, nho, dâu, mơ, dứa, + Trong rượu nếp, bánh men rượu, bia, nước mía, hạt kêphia - Nấm men quan sát kính hiển vi thường có dạng hình cầu hay hình trứng Tế bào có kích thước lớn, có khả nảy chồi Khuẩn lạc cho màu trắng sữa - Chọn khuẩn lạc nấm men riêng rẽ cấy vào mơi trường thích hợp khoai tây đường cám hay môi trường Sabouraud) 3.4 Xác đinh trình phân giải xenluloza vi sinh vật + Q trình phân giải hiếu khí xenlulơza - Cho vào ống nghiệm - ml mơi trường Vinogratxki có thành phần sau KNO3 : 2,5g KH2PO4 : 1,0g MgSO4 : 0,5g NaCl : FeSO4 : 0,5g 0,01g Mn2(SO4)3: 0,01g Nước cất: 200 ml - Nhúng vào dung dịch ống nghiệm dải giấy lọc (20 x 1,5 cm) - Dùng kẹp sắt kẹp đầu dải giấy vào miệng ống nghiệm - Cho vào ống nghiệm cục đất nhỏ (nguồn vi sinh vật) đặt ống nghiệm vào tủ ấm, giữ 300 C - 15 ngày - Các vi sinh vật phân giải xenlulôza phát triển, tiết men xenlulaza làm cho giấy bị phân huỷ, hố nhày có màu vàng, hồng, lục, chất nhày có màu sắc khuẩn lạc vi khuẩn - Xác định đối tượng vi sinh vật tham gia q trình phân giải xenlulơza hiếu khí Để quan sát hình thái vi sinh vật hiếu khí tham gia vào q trình phân giải ta làm tiêu từ chất nhày bề mặt giấy lọc - Nhuộm đơn vết bôi Fuchsin - Quan sát tiêu kính hiển vi với vật kính dầu (x 100) + Nhẹ nhàng lướt que cấy mặt thạch theo kiểu � Hình chữ chi � Hình vịng xoắn � Hình vạch ngang song song 1.3 Phương pháp cấy thạch đứng: Phương pháp dùng để cấy vi sinh vật kị khí - Sử dụng que cấy hình kim - Sau lấy giống vi sinh vật, dùng que cấy đâm sâu vào phần khối thạch hình trụ - Đâm sát đáy ống nghiệm đâm thành đường: đường giữa, đường sát thành ống tuỳ yêu cầu - Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để không gây nứt, vỡ môi trường 1.4 Phương pháp cấy đĩa pêtri: Có thể cấy đĩa pêtri theo cách sau: * Dùng que cấy đầu tròn thực theo trình tự sau: - Để đĩa pêtri lên bàn - Dùng que cấy lấy canh trường vi sinh vật theo thứ tự yêu cầu phương pháp chung - Tay trái mở nắp đĩa pêtri vừa đủ que cấy vào - Nhẹ nhàng nhanh chóng lướt que cấy lên mặt thạch theo kiểu sau: + Theo hình chữ chi toàn mặt thạch + Theo đường song song + Theo hình chữ chi góc * Dùng pipet: Thường áp dụng để định lượng vi sinh vật cấy lượng nhiều giống Có cách: - Cách 1: + Trộn dịch cấy vào thạch cách hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống nghiệm có mơi trường thạch nhiệt độ 500 C + Đậy nút lại, lắc nhẹ cho vi sinh vật phân phối môi trường + Đổ thạch vào đĩa pêtri khử trùng + Xoay tròn đĩa pêtri cho thạch dàn đáy hộp + Để yên cho thạch đông đặc lại đặt vào tủ ấm nhiệt độ thích hợp - Cách 2: + Hút 0,1 ml dịch cấy, nhỏ vào đĩa pêtri có mơi trường đặc + Dùng que gạt phân phối giọt dịch khắp mặt thạch đĩa + Cất vào tủ ấm với nhiệt độ thời gian thích hợp tuỳ lồi vi sinh vật III Các phương pháp nuôi vi sinh vật : Để đảm bảo phát triển vi sinh vật, sau cấy xong phải quan tâm đến điều kiện nuôi dưỡng chúng Các điều kiện bao gồm: - Nhiệt độ: Tuỳ loài vi sinh vật khác nhau, chọn nhiệt độ tối thích cho phát triển chúng trì ổn định nhiệt độ - Độ ẩm: Để trì độ ẩm q trình ni cần: - Đảm bảo đủ lượng nước làm môi trường - Trong điều kiện cần thiết phun nước vơ khuẩn vào phịng ni để nước bốc tủ ấm - Ôxi (O2): - Đối với vi sinh vật hiếu khí: + Cung cấp thường xuyên đầy đủ O2 + Lớp mơi trường ni cấy có độ dày vừa phải + Các bình chứa mơi trường lắc thường xun q trình ni để cung cấp thêm oxi cho vi sinh vật + Nếu nuôi cấy mơi trường có khối lượng lớn phải tiến hành sục khí thường xuyên hay định kỳ - Đối với vi sinh vật kị khí: Hạn chế tiếp xúc với oxi cách; Đổ lên bề mặt môi trường parafin, dầu vazơlin; Cấy trích sâu vào mơi trường đặc Ni cấy bình hút chân khơng Ni ống nghiệm đặc biệt sau rút hết khơng khí hàn kín lại Đun sơi mơi trường thời gian để loại hết O2 Để nguội 450C Dùng ống hút cấy vi sinh vật vào đáy ống nghiệm Làm nguội thật nhanh đổ vazơlin lên bề mặt để hạn chế tiếp xúc với O2 - Kết việc nuôi cấy: Sau nuôi thời gian nhiệt độ thích hợp cho loại vi sinh vật ta thấy: - Trong môi trường lỏng: Vi khuẩn phát triển làm đục môi trường - Trong môi trường đặc thạch nghiêng: + Nấm men, vi khuẩn phát triển tạo nên vệt mặt thạch hay trắng đục + Nấm mốc tạo nên sợi mảnh từ vết cấy - Trong môi trường thạch đứng: Các vi khuẩn kị khí phát triển đáy cột môi trường IV BẢO QUẢN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT THUẦN KHIẾT 4.1 Các phương pháp bảo quản giống vi sinh vật Phương pháp cấy truyền định kỳ lên môi trường mới: - Phương pháp áp dụng để bảo quản tất loại vi sinh vật - Ưu điểm: Phương pháp đơn giản, dễ làm, thời gian bảo quản không lâu - Nhược điểm: Tốn môi trường, công sức thời gian Phẩm chất ban đầu giống bị thay đổi nhiều nguyên nhân khó xác định cụ thể trình cấy truyền Phương pháp giữ giống mơi trường thạch có lớp dầu khống: - u cầu phương pháp sử dụng dầu khoáng parafin lỏng hay vazơlin phải trung tính, có độ nhớt cao, không chứa sản phẩm độc với vi sinh vật vô trùng - Cách bảo quản: + Khử trùng dầu khoáng cách hấp 120 0C 2h Sau sấy khơ tủ sấy (170 C) - 2h; để nguội + Đối với vi sinh vật kị khí : + Hạn chế tiếp xúc với ôxi cách : * Đổ lên bề mặt mơi trường parafin, dầu vazơlin * Cấy trích sâu vào mơi trường đặc * Ni cấy bình hút chân không * Nuôi ống nghiệm đặc biệt sau hút lên khơng hàn kín lại * Đun sôi môi trường thời gian để loại hết O2 Để nguội 450 C Dùng ống hút cấy vi sinh vật vào đáy ống nghiệm Làm nguội thật nhanh đổ vazơlin lên bề mặt để hạn chế tiếp xúc với O2 + Đổ lên bề mặt môi trường có vi sinh vật phát triển tốt lượng dầu cách mép ống nghiệm cm + Dùng parafin đặc hàn kín miệng ống, bình ni VSV - Ưu điểm: Phương pháp đơn giản hiệu cao nhờ khả làm chậm trình biến dưỡng hô hấp nên vi sinh vật phát triển chậm lại Môi trường không bị nước khô Phương pháp giữ giống đất, cát, hạt * Trên đất, cát: Dùng để bảo quản chủng tạo bào tử tiềm sinh (hoặc bào tử vơ tính) với thời gian bảo quản từ đến nhiều năm - Cách bảo quản: + Đất, cát đem rây để lấy hạt ngâm HCl hay H2SO4 đậm đặc - 12h để loại bỏ axit hữu cát + Rửa kỹ giữ điều kiện vô trùng + Sấy khô giữ điều kiện vô trùng + Đổ đầy cát vào ống nghiệm có vi sinh vật phát triển môi trường thạch lắc thật + Rót tồn cát lẫn vi sinh vật vào ống nghiệm khác + Hàn kín miệng ống nghiệm bảo quản lâu * Trên hạt: Dùng để bảo quản chủng có dạng hình sợi sinh bào tử khơng Thời gian bảo quản tới năm - Cách bảo quản: + Hạt ngũ cốc (lúa, bobo) rửa + Nấu cho hạt vừa nứt, để nước + Cho vào ống nghiệm hạt ngũ cốc nói + Phủ mặt hạt lớp thấm nước nấu hạt ngũ cốc + Cấy giống vi sinh vật lớp cho mọc thật dầy + Giữ nhiệt độ 15 – 200 C Phương pháp đông khô: Phương pháp làm cho tế bào nước trạng thái tự Đồng thời làm giảm, chí làm ngừng hẳn q trình phân chia vi sinh vật Nhờ chúng có khả chịu nhiều tác động ngoại cảnh - Phương pháp dùng nhiều sản xuất, thời gian bảo quản lên tới vài chục năm BÀI : CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MÀU VÀ QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT I Phương pháp làm tiêu tạm thời : 1.1 Cách làm tiêu giọt ép - Dùng que cấy ống hút lấy giống vi sinh vật để làm vết bơi - Đặt kính lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh không tạo thành bọt khí Muốn để mép kính tiếp xúc với phiến kính từ từ hạ kính xuống - Đưa tiêu lên quan sát kính hiển vi 1.2 Cách làm tiêu giọt treo Loại tiêu dùng để theo dõi sinh sản, hình thành bào tử, khả di động phản ứng tế bào vi sinh vật với loại kích thích - Dùng phiến kính đặc biệt có phần lõm hình trịn - Bơi vazơlin quanh phần lõm phiến kính - Cho giọt canh trường lên kính - Thận trọng xoay ngược kính cho giọt canh trường xuống phía đặt lên phần lõm phiến kính 1.3 Cách làm tiêu tạm thời có nhuộm màu a Nguyên tắc : Phương pháp sử dụng thuốc nhuộm không độc với vi sinh vật pha loãng nồng độ đảm bảo cho tế bào vi sinh vật sống hoạt động sau nhuộm màu b Cách nhuộm : + Nhỏ giọt thuốc nhuộm xanh mêtylen 0,001% lên phiến kính + Nhỏ giọt canh trường vi sinh vật với thuốc nhuộm + Đậy kính lên giọt dịch + Quan sát tiêu vật kính (x 10) (x 40) II Phương pháp làm tiêu cố định : 2.1 Các bước tiến hành làm tiêu cố định Làm vết bôi : Cố định vết bôi : Các cách cố định : + Cố định nhiệt : + Cố định hoá chất : � Cách phức tạp không gây biến dạng tế bào, không gây biến đổi cấu trúc tế bào không làm đứt tiên mao � Người ta thường dùng hố chất rượu axêtơn để cố định vết bơi � Cách cố định : Có thể thực cách sau : o Nhúng vết bôi vào rượu Với rượu 950 ngâm vết bôi từ – 15 phút Với rượu mêtylíc ngâm khoảng - phút o Ngâm vết bôi vào dung dịch axêtôn phút o Nhỏ vài giọt rượu 90 - 950 lên vết bôi Đốt cháy dập tắt Làm vài lần để khô 2.3 Nhuộm màu tiêu cố định a Nguyên tắc : - Sử dụng thuốc nhuộm có khả thẩm thấu qua màng tế bào kết hợp với thành phần khác tế bào thành hợp chất màu đặc trưng bền vững - Tuỳ theo mục đích nghiên cứu khả bắt màu khác thành phần tế bào mà chọn loại thuốc nhuộm cách nhuộm cho phù hợp - Có cách nhuộm : + Nhuộm đơn : Chỉ dùng loại thuốc nhuộm tiêu + Nhuộm kép : Dùng đồng thời hay nhiều loại thuốc nhuộm tiêu b Cách nhuộm : - Đặt tiêu lên cầu thuỷ tinh (đặt nằm ngang miệng khay nhân, thuỷ tinh) - Nhỏ vào vết bôi vài giọt Fuchsin Ziehl, để yên từ - phút - Rửa vết bơi cách nghiêng phiến kính, dùng bình xịt cho dịng nước chảy nhẹ qua vết bơi đến nước chảy khơng cịn màu - Dùng giấy thấm khô tiêu hơ nhẹ tiêu đèn cồn - Quan sát tiêu vật kính (x 40) chuyển sang vật kính (x 100) dùng dầu soi III Quan sát đặc điểm sinh học nhóm vi sinh vật : 3.1 Quan sát đặc điểm sinh học vi khuẩn (Bacteria) Người ta thường làm tiêu giọt ép giọt treo để quan sát hình thái vi khuẩn sau ni cấy chúng nhiệt độ 370C sau 24 - 48h 3.2 Quan sát đặc điểm sinh học xạ khuẩn (Actinomycetes) Các đặc điểm sinh học đặc trưng cần quan sát - Hình dạng bào tử - Đặc điểm cuống sinh bào tử - Phương thức hình thành chuỗi bào tử Cách quan sát - Làm tiêu giọt ép với Streptomyces griseus cấy thạch nghiêng 3.3 Quan sát đặc điểm sinh học nấm mốc (Molds) Các đặc điểm sinh học đặc trưng cần quan sát: - Đặc điểm sợi nấm: Màu sắc, có vách ngăn hay khơng có vách ngăn - Đặc điểm quan sinh sản: hình dạng, cách xếp phận quan sinh sản - Hình dạng, cấu tạo, cách xếp bào tử Cách quan sát: - Làm tiêu nấm mốc không nhuộm màu - Vẽ hình nhận xét hình dạng chung sợi nấm; vị trí, hình dạng, cách xếp bào tử, thể bình, cuống thể bình, cuống bào tử đính giống nấm mốc - Thao tác sử dụng kính hiển vi soi - Làm tiêu nấm mốc nhuộm màu: 3.4 Quan sát đặc điểm sinh học nấm men (Yeasts) Những đặc điểm sinh học đặc trưng cần quan sát - Hình thái, kích thước tế bào nấm men - Sự nảy chồi nấm men - Hình dạng, số lượng bào tử túi bào tử Cách quan sát: - Làm tiêu nhuộm đơn nấm men cấy môi trường dịch thể với xanh mêtylen Loeffler - Quan sát nảy chồi nấm men IV PHƯƠNG PHÁP NHUỘM KÉP - QUAN SÁT CẤU TẠO TẾ BÀO VI SINH VẬT 4.1 Các phương pháp nhuộm kép - Quan sát cấu tạo tế bào sinh vật: - Nhuộm kép phương pháp nhuộm người ta sử dụng hay nhiều loại thuốc nhuộm tiêu - Nguyên tắc việc nhuộm kép + Các cấu trúc khác nhau, chí phần khác cấu trúc thường có tính chất lý học, hố học khả bắt màu khác + Việc sử dụng đồng thời loại thuốc nhuộm tiêu cho phép ta quan sát phân biệt cấu trúc dễ dàng 1.Phương pháp nhuộm Gram : a Nguyên tắc : - Dựa khả bắt màu tế bào chất màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh iơt mà hình thành nên hai loại phức chất khác + Loại phức chất thứ giữ nguyên màu thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi xử lý cồn Vi sinh vật có phức chất thuộc loại gram dương + Loại phức chất thứ hai khơng cịn giữ màu thuốc nhuộm nên màu xử lý cồn bắt màu thuốc nhuộm bổ sung Vi sinh vật có phức chất thuộc loại gram âm b Cách tiến hành : - Làm tiêu : + Dùng que cấy lấy nước vô trùng để làm vết bơi phiến kính (hai đầu phiến kính) + Dùng que cấy lấy chút khuẩn lạc chúng làm vết bôi theo thứ tự sau: � Bên trái phiến kính Bacillus subtilis � Bên phải phiến kính Escherichia coli � Ở phiến kính Bac.subtilis trộn lẫn với E coli + Để khơ vết bơi khơng khí cố định nhẹ đèn cồn - Nhuộm tiêu + Đặt miếng giấy lọc lên vết bơi + Nhuộm tiêu thuốc nhuộm tím kết tinh qua giấy lọc 1phút + Nhuộm lugol phút + Rửa nước + Tẩy cồn 30 giây, để nghiêng tiêu nhỏ từ từ giọt cồn tan hết màu + Rửa nước + Nhuộm bổ sung Fuchsin hay Safranin từ 10 - 30 giây + Làm khô soi tiêu với vật kính dầu - Kết quả: + Vết bơi Bac sublitis màu tím - gram dương + Vết bơi Bac sublitis + E.Coli có màu hồng lẫn màu tím + Vết bơi E.Coli màu hồng - gram âm BÀI : CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO VI SINH VẬT Trong loại mẫu vật nào, muốn biết số lượng chung nhóm vi sinh vật số lượng riêng nhóm thành phần, cần phải đếm số lượng tế bào chúng Để xác định số lượng vi sinh vật đất, nước, khơng khí dịch ni cấy … người ta sử dụng nhiều phương pháp khác Trong có phương pháp dùng nhiều : - Phương pháp xác định trực tiếp số lượng tế bào phiến kính có khung đếm Goriaep (phịng đếm hồng cầu) - Phương pháp xác định gián tiếp số lượng tế bào cách đếm số lượng khuẩn lạc mọc mơi trường thạch Nói chung phương pháp phải tiến hành theo bước sau : I Chuẩn bị mẫu : Để xác định gián tiếp trực tiếp tế bào vi sinh vật 1.1 Lấy mẫu : Tuỳ theo loại vật phẩm cần xác định mà ta lấy mẫu để nghiên cứu với số lượng khối lượng khác cho phù hợp Yêu cầu việc lấy mẫu - Lấy mẫu có tính chất đại diện - Lượng mẫu lấy vừa phải, đủ để phân tích đặc tính lý, hố, sinh học - Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô trùng - Lấy mẫu xong phải phân tích khơng để q 24h - Mẫu lấy phải có nhãn ghi ký hiệu ghi vào sổ đặc điểm mẫu nơ i thu mẫu 1.2 Pha lỗng mẫu : Chuẩn bị số bình tam giác chứa 90ml nước cất vô trùng, số ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng số ống hút (1ml) vô trùng a Mẫu trạng thái lỏng : - Pha loãng mẫu theo dãy thập phân b Nếu mẫu nghiên cứu trạng thái đặc (như đất, lương thực, thực phẩm) - Chuẩn bị bình hình nón có dung tích 250 ml + Bình chứa 90ml nước cất vơ trùng + Bình vơ trùng khơng chứa - Khử trùng cối chày sứ cách cho cồn vào đốt lên Sau để nguội - Cân g đất (hoặc mẫu) cho vào cối sứ nghiền nát mẫu - Dùng tồn nước bình để chuyển tồn mẫu sang bình - Lắc phút, để lắng 30 giây tiếp tục pha loãng mẫu mẫu trạng thaí lỏng - Tuỳ theo ước đoán số lượng vi sinh vật mẫu mà pha lỗng nhiều hay II Phương pháp định lượng vi sinh vật : Sự diện vi sinh vật định lượng nhiều phương pháp khác đếm số lượng tế bào trực tiếp kính hiển vi, định lượng gián tiếp thơng qua mức độ cản ánh sáng (độ đục) , đếm số khuẩn lạc mọc môi trường xác định, định lượng cách thống kê phương pháp pha loãng tới hạn ( phương pháp MPN) 2.1 Phương pháp cấy gạt : a Phương pháp cấy gạt (hộp trải) - Tiến hành pha loãng mẫu theo phương pháp nêu - Ghi vào đáy đĩa Petri có mơi trường thạch thông tin : Nồng độ pha lỗng Ngày cấy - Dùng pipet vơ khuẩn lấy 0,1 md dịch huyền phù cho vào đĩa thạch (tương đương với giọt dịch) Số tế bào cấy bề mặt thạch phải dàn khơng nên vượt q vài trăm Lưu ý : dùng thể tích mẫu cấy từ 0,05 - 0,5 ml Tuy nhiên, thể tích mẫu cấy nhỏ sai số xảy lớn Khi tất thể tích 0,1 ml tế bào độ pha loãng khác chuyển lên bề mặt thạch đĩa Petri, sử dụng que cấy gạt thuỷ tinh để dàn đ ều tế bào bề mặt thạch Lưu ý que cấy gạt thuỷ tinh phải vô khuẩn trước đưa vào đĩa Petri tiếp theo, cách nhúng vào cồn, vẩy nhẹ để loại lượng cồn dư bám que cấy, đốt cháy phần cồn lại que cấy lửa đèn cồn Làm nguội que cấy cách nhẹ vào bề mặt thạch, dàn lượng chất lỏng chứa tế bào Nếu thể tích chất lỏng đem cấy q nhiều, tế bào trôi dạt chất lỏng, sau tế bào phân chia, hai khuẩn lạc xuất phát từ tế bào hình thành Các đĩa thạch chuẩn bị ngày trước cấy thường hấp thu nhanh lượng chất lỏng đem cấy Lớp chất lỏng thạch mỏng, hấp thu xảy nhanh Dưới phần thực nghiệm định lượng số tế bào vi sinh vật có mẫu phương pháp đếm số khuẩn lạc thạch đĩa Cách tiến hành : - Cho giống vi sinh vật vào ống nghiệm chứa nước cất vơ khuẩn nhờ que cấy vịng để tạo huyền phù tế bào Cán hướng dẫn chuẩn bị trước dịch huyền phù tế bào có nồng độ nằm khoảng xác định - Pha loãng dịch huyền phù tế bào nồng độ thích hợp : 10-1 , 10-2 , … 10-n tiến hành cấy mẫu độ pha loãng khác vào cac đĩa Petri (lặp ba, tức cấy mẫu độ pha loãng vào đĩa Petri) theo hai phương pháp Lưu ý phương pháp cấy gạt, cấy 0,1 ml dịch mẫu lên môi trường thạch rắn đổ sẵn, phương pháp đổ đĩa cấy ml dịch mẫu vào đĩa trước thêm môi trường thạch lỏng nguội vào - Đặt đĩa thạch vừa cấy vào tủ ấm cài nhiệt độ 30oC ủ 48 - Kết thúc thời gian ủ, lấy đĩa thạch ra, tiến hành đếm khuẩn lạc tính số lượng tế bào 1ml mẫu theo công thức nêu Mật độ tế bào vi sinh vật mẫu ban đầu tính từ số liệu độ pha lỗng D1 tính theo cơng thức : Mi (CFU/ml) = Ai x Di/V Trong : Ai số khuẩn lạc trung bình/ đĩa Di độ pha lỗng V dung tích huyền phù tế bào cho vào đĩa (ml) Mật độ tế bào trung bình MI mẫu ban đầu trung bình cộng Mi nồng độ pha loãng khác 2.3 Phương pháp định lượng cách thống kê VSV phương pháp pha loãng tới hạn: Phương pháp MPN (Most Probable Number) Phương pháp MPN (phương pháp có số xác suất cao ; số tối khả) gọi phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ Đây phương pháp dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn diện đơn vị thể tích mẫu Đây phương pháp định lượng dựa kết định tính loạt thí nghiệm lặp lại số độ pha loãng khác Thông thường, việc định lượng thực lặp lại lần độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng x = ống nghiệm Quy trình thực định lượng theo phương pháp sau : Cho vào ống nghiệm có chứa mơi trường thích hợp cho tăng trưởng đối tượng vi sinh vật cần định lượng thể tích xác dung dịch mẫu nồng độ pha lỗng bậc 10 liên tiếp (ví dụ 1/10, 1/100, 1/1000) Ủ nhiệt độ thời gian thích hợp Dựa vào kết biểu kiển chứng minh tăng trưởng vi sinh vật cần kiểm định ống nghiệm (thường tượng sinh hơi, đổi màu, đục …), ghi nhận số lượng ống nghiệm dương tính độ pha lỗng Sử dụng số liệu dựa vào bảng Mac Crady suy mật độ vi sinh vật trình bày dạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu Độ xác trị số MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại độ pha loãng ; Bảng tra mpn dùng cho loạt ống nghiệm nồng độ pha loãng liên tiếp Số lượng ống Số Số lượng ống Số dương tính MPN/100 dương tính MPN/1 Số mo mẫu sử ml Số mo mẫu sử 00 ml dụng dụng ... LẬP VI SINH VẬT I Khái niệm : Phân lập vi sinh vật trình tách riêng loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu đư a dạng khiết Đây khâu có ý nghĩa quan trọng vi? ??c nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật Vi sinh. .. loại môi trường II Phương pháp làm môi trường Làm môi trường để thực vi? ??c phân lập, nhân giống, giữ giống vi sinh vật, đồng thời để nuôi cấy nghiên cứu đặc điểm sinh học chúng 2.1 Nguyên tắc vi? ??c... vi sinh vật khiết: Quá trình phân lập vi sinh vật dạng khiết: Với hầu hết loại mẫu nghiên cứu, trình phân lập vi sinh vật dạng khiết gồm bước sau: - Tạo khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật