Bài giảng thực hành vi sinh công nghiệp ngành công nghệ sinh học

Bài 1: Xác định khả năng lên men rượu của nấm menBài 2: Xác định khả năng lên men lactic của vi khuẩn lacticBài 3: Xác định khả năng lên men acetic của vi sinh vậtBài 3: Phương pháp thu nhận và xác định hoạt tính enzyme từ vi sinh vậtBài 4: Phương pháp thu nhận và xác định hoạt tính enzyme từ vi sinh vậtBài 5: Xác định tổng vi khuẩn hiếu khí và coliform

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÀI GIẢNG THỰC HÀNH VI SINH CÔNG NGHIỆP BIÊN SOẠN: Kỹ sư CNSH: Nguyễn Hoàng Khang Mục lục Bài 1: Xác định khả lên men rượu nấm men Bài 2: Xác định khả lên men lactic vi khuẩn lactic Bài 3: Xác định khả lên men acetic vi sinh vật Bài 3: Phương pháp thu nhận xác định hoạt tính enzyme từ vi sinh vật Bài 4: Phương pháp thu nhận xác định hoạt tính enzyme từ vi sinh vật Bài 5: Xác định tổng vi khuẩn hiếu khí coliform BÀI 1: XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG LÊN MEN RƯỢU CỦA NẤM MEN 1.1 Nguyên tắc trình lên men rượu Đây q trình chuyển hố đường thành rượu, CO kèm theo giải phóng lượng với tham gia nấm men số vi sinh vật khác, số vi khuẩn nấm mốc (nấm sợi) Nấm men thường sử dụng trình lên men rượu lồi Saccharomyces Phương trình tóm tắt q trình lên men rượu biểu diễn sau: C12H12O6 C2H5OH CO2 +113.4 KJ Phần thí nghiệm giúp sinh viên biết cách lên men rượu, chọn khử trùng môi trường lên men, nhân chọn giống nấm men, xác định có mặt sản phẩm ethanol Co2 tạo thành trình lên men 1.2 Vật liệu hố chất Mơi trường lên men: nước ép trái ( nho, dâu, dứa…) nước mạch nha Men giống Saccharomyces thạch nghiêng Dung dịch Ba(OH)2 10% Dung dịch NaOH 0.1N Iodine tinh thể hay bột Acid sulfuric đậm đặc Dung dịch K2Cr2O7 1% Dung dịch AgNO3 amoniac Dung dịch xanh methylene 1.3 Tiến hành trình lên men rượu Làm môi trường lên men từ nước ép trái cây: Nho, dâu, dứa, mơ vv… từ nước mạch nha Điều chỉnh độ pH= 4-6 Thanh trùng dịch ép trái theo phương pháp Tyndal khử trùng nồi áp suất 0.75 atm 20 phút Để môi trường nguội tới 30oC cấy men giống vào tỉ lệ 2- % thể tích dịch men Đặt bình có dịch lên men vào tủ ấm 280C, sau 1-2 ngày lấy 1.4 Xác định đặc trưng trình a Xác định đối tượng vi sinh vật tham gia Làm tiêu giọt ép, giọt treo hay nhộm đơn để thấy hình dạng tế bào nấm men b Xác định chất lượng men giống trước lên men Xác định tỉ lệ tế bào nảy chồi dịch men giống phương pháp đếm số lượng tế bào nảy chồi khung đếm Goriaep Xác định tỉ lệ tế bào sống chết tiêu nhuộm sống nấm men ( để phân biệt loại tế bào này) Xác định số lượng tế bào/1ml dịch men giống phương pháp đếm số lượng tế bào khung đếm Goriaep Yêu cầu Số lượng tế bào nảy chồi đạt: 10-15% Chỉ đếm tế bào nảy chồi có tế bào bé hay ½ tế bào mẹ Tỉ lệ tế bào chết: không qua 4% Số lượng tế bào ml dịch men giống: 12-14 triệu c Xác định tốc độ trình lên men thơng qua lượng CO2 tạo thành  Nguyên tắc Dựa vào phương trình tổng quát trình lên men: C6H12O6 C2H5OH +CO2 + 27kcal Lượng đường phân giải trình lên men nhiều lượng CO2 tạo lớn Tốc độ trình lên men lượng CO bay từ thể tích mơi trường định khỗng thời gian xác định  Cách tiến hành - Để xác định lượng CO tạo trình lên men, người ta sử dụng dụng cụ chế tạo theo nguyên tắc bình lên men Smith - Dụng cụ gồm phận sau: + Một bình cầu chứa 50ml dịch lên men 10ml dịch men giống + Miệng hình cầu có đậy nút cao su + Bình cầu nối với lọ thuỷ tinh miệng rộng qua ống thuỷ tinh uốn cong Một đầu ống thuỷ tinh nằm phần dịch men bình cầu Đầu ống nhúng vào ống nghiệm chứa đầy nước ép ngược lọ thuỷ tinh - Đặt dụng cụ lên men vào tủ ấm có nhiệt độ 32- 35OC - Sau thời gian, quan sát thấy bọt khí CO theo ống thuỷ tinh đầy mực nước ống nghiệm xuống - Lượng nước bị đẩy xuống nhiều chứng tỏ lượng CO2 tạo lớn - Có thể xác định thể tích lượng CO cách thay ống nghiệm thường ống nghiệm có vạch chia từ 1-25ml - Căn vào thể tích mực nước hạ xuống ta biết thể tích CO tạo thành trình lên men thời điểm cần xác định ( sau lên men 24h, 48h…) Phương pháp dùng để định lượng CO trình lên men d Định tính CO2 tạo thành  Nguyên tắc Dựa phản ứng cho CO qua dung dịch Ba(OH)2 nước vôi làm cho dung dịch bị đục  Cách tiến hành - Cho vào ống nghiệm + 5ml dịch lên men + ml dung dịch Ba(OH)2 - Dùng kẹp gỗ kẹp ống nghiệm đun nhẹ đèn cồn - Để lắng ta thấy có kết tủa trắng BaCO tạo thành theo phản ứng CO2 + Ba(OH)2 BaCO3 + H2O e Các phản ứng định tính rượu etylic  Nguyên tắc chung Dựa vào phản ứng đặc trưng rượu etylic với chất để xác định có mặt rượu q trình lên men  Cách tiến hành - Phản ứng tạo thành ifdoform + Cho vào ống nghiệm chất sau: 5ml dịch lên men 5ml NaOH 0.1N 0.1g iot tinh thể hay dạng bột + Đun nóng ống nghiệm hay ngâm ống nghiệm vào nồi cách thuỷ 60OC iot tan hết màu + Để nguội xuất tinh thể indoform màu vàng CHI Sự tạo thành CHI3 có mặt rươu etylic dịch lên men - Phản ứng với K2Cr2O7 + Cho vào ống nghiệm (thí nghiệm) • 2ml dịch lên men • Thêm 1-2 ml H2SO4 đậm đặc • Nhỏ giọt K2Cr2O7 1% xuất màu xanh lục + Cho vào ống nghiệm (đối chứng) • 2ml dịch chưa lên men • 1-2 ml H2SO4 đậm đặc • Nhỏ giọt K2Cr2O7 1% Quan sát chuyển màu ống nghiệm giải thích kết BÀI 2: XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG LÊN MEN LACTIC CỦA VI KHUẨN LACTIC 2.1 Nguyên tắc trình lên men lactic Lên men lactic q trình chuyển hố đường thành acid lactic sản phẩm khác Tuỳ thuộc vào sản phẩm tạo thành mà trình lên men lactic chia làm loại: lên men đồng hình lên men dị hình Trong trình lên men đồng hình, sản phẩm acid lactic Ngồi cịn lượng nhỏ acid bay hơi, rượu ethaol sản phẩm khác Ở trình lên dị hình, acid lactic, khơng phải sản phẩm chủ yếu mà cịn nhiều sản phẩm khác như: acid acetic, ethanol, CO2, H2, tạo thành đáng kể Các vi khuẩn tham gia q trình chủ yếu lồi vi khuẩn thuộc giống Streptococcus, Lactobacillus,… Phần thực tập nhằm giúp sinh viên biết cách lên men cải chua, làm quen với số vi khuẩn lactic xác định có mặt sản phẩm acid lactic tạo thành q trình lên men 2.2 Vật liệu hố chất - Dưa cải bẹ - Đường - Dung dịch H2SO4 10% - Thuốc thử uphenmen - NaCl - Dung dịch KmnO4 2% 2.3 Tiến hành trình lên men lactic Cách 1: • Nguyên liệu: Dưa cải 0.5 kg - Nước muối 3- 3.5%, 500ml - Đường thìa cà phê • Cách làm - Dưa cải bẹ để héo, rửa sạch: cắt khúc, để - Pha 500ml dung dịch NaCl 3- 3.5% bổ sung thêm vào thìa cà phê đường - Xếp dưa vào lọ thuỷ tinh ém chặt - Đổ nước muối có đường vào từ từ cho ngập dưa - Lên men nhiệt độ 28- 30 OC 2-3 ngày - Vi khuẩn lactic sống bề mặt rau tác nhân trình Cách 2: - Cho vào bình tam giác 150ml sữa tươi khử trùng + thìa cà phê sữa chua khuấy thật nhuyễn - Lắc bình để men giống tan - Để ủ ấm 30- 35 OC – 4h ta sữa (chua) đông tụ 2.4 Xác định đặc trưng trình a Xác định đối tượng vi sinh vật Làm tiêu giọt ép từ nước dua cải chua để quan sát hình dạng, xếp tế bào vi khuẩn lên men lactic Làm tiêu nhỏ giọt treo để quan sát chuyển động vi khuẩn lactic từ dịch sữa chua Yêu cầu nhận biết dạng cầu khuẩn trực khuẩn vi khuẩn lên men lactic b Xác định có mặt acid lactic trình lên men phản ứng định tính  Nguyên tắc chung - Dựa phản ứng màu đặc trưng acid lactic với số hợp chất khác để xác định có mặt chúng q trình lên men lactic  Cách tiến hành Phản ứng chuyển acid lactic thành acetaldehyde: mơi trường acid với có mặt KmnO4, acid lactic chuyển thành acetaldehyde làm đen giấy lọc có tẩm AgNO3 amoniac + Cho vào ống nghiệm: ml dịch lên men, ml H2SO4 10% + Đặt lên miệng ống nghiệm miếng giấy lọc tẩm dung dịch AgNO amoniac + Đun sôi ống nghiệm, thêm giọt KmnO4 2% + Quan sát đổi màu miếng giấy lọc, ghi nhận kết Phản ứng với phenol: Acid lactic phản ứng với nhân phenol có thuốc thử unphenmen làm cho màu thuốc thử chuyển từ xanh tím sang vàng + Cho vào ống nghiệm ml dịch lên men, vài giọt thuốc thử unphenmen + Quan sát đổi màu thuốc thử, ghi nhận kết Định lượng acid lactic phương pháp chuẩn độ: + Cho vào ống nghiệm: + 10 ml nước dưa + 20 ml nước cất + 1-2 giọt phenolphtalein - Lắc thật kỹ để trộn chất + Chuẩn độ dung dịch NOH 0.1 N + Cách tính: Khối lượng acid lactic ( 10 ml dịch lên men)= Số ml NaOH 0.1N (dùng để chuẩn độ) x 0.009g (1ml dung dịch NaOH tương đương 0.009g acid lactic BÀI 3: XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG LÊN MEN ACETIC CỦA VI SINH VẬT 3.1 Nguyên tắc trình lên men acetic Lên men acetic chuyển hố hiếu khí ethanol thành acid acetic Vi sinh vật tham gia vào trình đa dạng, chủ yếu loài vi khuẩn thuộc giống Acetobacter Những tế bào vi khuẩn kết thành chuỗi, Gram âm, không tạo bào tử, khơng có khả di động hồn tồn hiếu khí Khi phát triển, vi khuẩn thường tạo bề mặt dịch lên men lớp váng nhầy màu xám trắng gọi giấm Các loại Acetorbacter sử dụng nhiều công nghiệp A aceti, A pasteurianum A orlenase A.aceti trực khuẩn ngắn, hình que, xếp thành duỗi, khơng di động, có khả chui độ rượu cao, tế bào có màu vàng nhộm với dung dịch Lugol A.pasteurianum trực khuẩn hình que, có xếp thành sợi dài, tạo thành lớp váng khô nhăn nheo, tế bào có màu xanh nhộm với dung dịch Lugol A orleanse tế bào hình que, nhỏ, khơng di động, chụi độ rượu cao Phương trình tổng quát trình biễu diễn sau: CH3CH2OH + O2 CH3COOH + H2O + 117 KJ 3.2 Vật liệu hoá chất Bia chai Ethanol 96% Acid acetic N Dung dịch Lugol, hay xanh methylene, hay Fushin H2SO4 đậm đặc Dung dịch NaOH 20% Dung dịch FeCl3 3.3 Tiến hành thí nghiệm lên men actic - Cho vào dung cụ thuỷ tinh có miệng rộng, thể tích 100ml + 30- 40 ml bia + 0.5 ml ethanol (chất giàu lượng) + 3-5 ml acid acetic 1N để acid hố mơi trường - Để dụng cụ ngồi khơng khí vài đậy vài màng mỏng, cho vào tủ ấm 25- 30OC - Sau 2-3 ngày miệng dụng cụ thấy xuất lớp váng vi khuẩn acetic bề mặt môi trường 3.3 Xác định đặc trưng trình lên men acetic a Xác định thành phần loài vi sinh vật tham gia - Làm tiêu để quan sát vi khuẩn acetic từ lớp màng trắng dấm - Tiến hành nhuộm đơn tiêu xanh methylen Fuchsin, Lugol - Quan sát tiêu bảng vật kính dầu (x 100) b Các phản ứng định tính acid acetic  Nguyên tắc - Dựa vào phản ứng đặc trưng acid acetic với chất khác để xác định có mặt acid trình lên men  Cách tiến hành - Phản ứng tạo thành ethy acetate + Cho vào ống nghiệm chất sau 3ml dịch lên men 1ml NaOH 20% Vài giọt dung dịch FeCl35% + Lắc ống nghiệm đun nóng đèn cồn Nếu dung dịch có acid acetic có màu đỏ thẩm sắt acetate tạo thành c Phản ứng định lượng acetic - Cho vào bình tam giác 10ml dịch lên men + 1-2 giọt dung dịch phenolphatalein 0.1% - Chuẩn độ dung dịch NaOH 0.1N - Tính số gram acid acetic 10ml dịch lên men (Biết 1ml NaOH 0.1N tương đương với 0.006g acid acetic) BÀI 4: PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME TỪ VI SINH VẬT 4.1 Thu nhận enzyme vi sinh vật thô phương pháp nuôi cấy bề mặt 4.1.1 Nguyên tắc Trong trình phát triển vi sinh vật, enzyme luôn tổng hợp để tham gia vào q trình đồng hố q trình dị hố Dưới phần thực nghiệm tiến hành để thu nhận chế phẩm enzyme thô 4.1.2 Nguyên liệu hoá chất Giống vi sinh vật dùng thí nghiệm nấm sợi Aspergilus oryzae Nấm sợi sinh tổng hợp enzym amylase, protease cellulase tuỳ theo chất cảm ứng mà ta đưa vào Môi trường bán rắn bản: Cám 70% Trấu 25% Các nguyên liệu chứa chất cảm ứng để tổng hợp enzyme tương ứng 5% Độ ẩm môi trường 60-56% Thiết bị tiệt trùng Các dụng cụ thuỷ tinh dùng ni cấy gồm đĩa Petri, bình tam giác 250 ml, bình tam giác 1000ml Khay dụng cụ đan tre Tủ ấm 4.3.1 Cách tiến hành Chuẩn bị 50g môi trường bình tam giác có dung tích 250ml, 10g mơi trường vào hộp Petri Nếu cần có hàm lượng protease cao, cho thêm 5% bột đầu nành, cần có hàm lượng pectinase cao cho thêm 5% bột cà rốt, để làm chất cảm ứng Dùng nước máy tạo độ ẩm môi trường từ 60-65%, đem tiệt trùng 121OC 30 phút Chuẩn bị 3-5 ống nghiệm nước vô khuẩn Bằng thao tác vô trùng, thực tủ cấy vô trùng, đổ 10ml nước vô trùng vào ống nghiệm giống Dùng đũa thuỷ tinh vô khuẩn khuấy nhẹ để bào tử nấm sợi Aspergillus hoà nước Dùng pipet vô khuẩn hút lấy ml cho vào đãi Petri có chứa mơi trường vơ khuẩn để nguội đổ tồn 10ml nước hồ bào tử vào bình tam giác có mơi trường trùng làm nguội Lắc để mơi trường bình tam giác trộn với bào tử xoay để môi trường đĩa Petri trộn với bào tử Bao gói đĩa Petri đậy nút bơng bình tam giác để vào tủ ấm có nhiệt độ ổn định 37OC Ni thời gian 36 Nếu thí nghiệm thực với mục đích kiểm tra khả sinh tổng hợp enzyme sau 36 ni cấy, ta thu chế phẩm enzym thô 10 Nếu thí nghiệm thực với mục đích thu nhận lượng chế phẩm thơ nhiều ta ni chúng bình tam giác 1000ml với lượng mơi trường 200- 250g Hoặc ta nuôi chúng khay nhôm dụng cụ đan tre nứa Chiều dày môi trường nuôi khay khoãng 3-5 cm tốt 11 Khi nấm sợi bắt đầu chớm tạo bào tử thời gian ezym tạo nhiều Ta nên thu nhận chế phẩm thô giai đoạn 12 Chế phẩm thô sau thu nhận đem sấy nhiệt độ 40OC có quạt thơng gió để bảo quản dùng lâu dài 4.2 Thu nhận chế phẩm enzym bán tinh kiết 4.2.1 Nguyên tắc Trong ứng dụng, tuỳ theo trường hợp khác người ta dùng chế phẩm enzyme thô, chế phẩm enzym bán tinh kiết hay chế phẩm enzym tinh kiết Chế phẩm bán tinh khiết chế phẩm người ta loại nước, thành phần môi trường, sinh khối vi sinh vật chất hoà tan Trong chế phẩm cịn chứa lượng protein khơng hoạt động số thành phần nhỏ khác Để thu nhận chế phẩm enzym bán tinh khiết ( gọi chế phẩm enzym dạng tủa), người ta thường dùng tác nhân gây tủa protein Như vậy, thành phần tủa thu gồm có protein không hoạt động protein enzyme Trong protein enzyme chứa enzyme ta cần thu nhận enzyme không cần thu nhận 4.2.2 Nguyên liệu, dụng cụ hoá chất Chế phẩm enzyme thô ( thu từ nuôi cấy theo phương pháp bề mặt nuôi cấy theo phương pháp chìm) Cồn 96% Các dụng cụ để nghiền chế phẩm thô, lọc Tủ lạnh Đũa thuỷ tinh, cốc thuỷ tinh, phễu lọc Lò sấy 4.2.3 Cách tiến hành Để kết tủa enzym, người ta dùng loại dung mơi như: cồn, aceton, muối trung tính (như ammoium sulpate),… Trong thí nghiệm này, ta dùng cồn tác nhân tạo tủa cồn dễ kiếm cho kết tốt Cồn giữ tủ lạnh OC trước làm tủa enzym Chế phẩm enzym thô từ canh trường nuôi cấy theo phương pháp bề mặt nghiền mịn máy nghiền bi Nếu khơng có máy nghiền bi người ta giả cói, chày sứ với trợ giúp cát thạch anh bột thuỷ tinh Cát thạch anh bột thuỷ tinh rửa sấy thật khô trước sử dụng, cho vào giã với canh trường nuôi cấy bề mặt Cát hay bột thuỷ tinh làm tăng khả phá tế bào vi sinh vật mà không làm thay đổi chất enzym nên thường sử dụng thí nghiệm thu nhận enzym từ canh trường nấm sợi Sau nghiền canh trường ni cấy bề mặt, cho vào lượng nước gấp 4-5 lần khối lượng canh trường để hoà tan protein- enzym từ khối canh trường Tiến hành lọc thu dịch lọc Bảo quản dịch lọc tủ lạnh 4OC Không nên sấy nhiệt độ cao enzym dễ hoạt tính 4.3 Các phương pháp kiễm tra hoạt tính enzym vi sinh vật 4.3.1 Phương pháp kiểm tra hoạt tính amylase Phương pháp Wolhgemuyh - Phương pháp xác định lượng enzym phân giải hồn tồn lượng tinh bột với chất thị màu - Một đơn vị Wolhgemuth lượng enzym mà sau 30 phút 30OC, có ion clorine phân giải mg tinh bột đến sản phẩm không tạo màu với iodine - Hoạt tính enzym biểu diễn số đơn vị Wolhgenmuth 1ml dịch môi trường 1ml dung dịch chiết enzym a Thiết bị, vật liệu hố chất - Bình tam giác hay bình cầu - Ống nghiệm - Máy ly tâm hay máy lọc - Pipet tự động - Dung dịch enzym: nghiền cẩn thận phần mơi trường thạch có chứa vi sinh vật, cân 20g - 100g cho vào bình tam giác hay bình cầu, thêm 500-1000ml dung dịch NaCl 1%, lắc liên tục từ 1-2 máy lắc nhiệt độ phòng Lọc hay ly tâm để thu dịch chiết suốt Nếu môi trường nuôi cấy dịch thể, cần ly tâm sinh khối sử dụng phần chất lỏng suốt thu để phân tích - Dung dịch tinh bột 0.1% - Dung dịch NaCl 0.02% b Cách tiến hành - Chuẩn bị 10 ống nghiệm, cho vào ống 1ml dung dịch NaCl 0.1% - Thêm vào ống thứ 1ml enzym lắc đều, lấy ml chuyển sang ống thứ 2, lại lắc lấy 1ml chuyển snag ống thứ 3, Cứ ống thứ 10 Sau cùng, lấy 1ml ống thứ 10 bỏ Cho vào ống 2ml dung dịch tinh bột 0.1%, lắc đều, giữ 30OC 30 phút Làm lạnh, cho vào giọt dung dịch iodnie 0.02N Ghi nhận ống có độ pha lỗng lớn mà khơng tạo màu với iodine - Ví dụ: Các ống từ đến khơng tạo màu, ống thứ trở có màu hoạt tính enzyme 1ml dung dịch enzyme 16 x = 32 đơn vị Trong đó, 16 độ pha loãng dung dịch enzyme ống thứ 4; số mg tinh bột ống nghiệm 4.3.2 Phương pháp kiễm tra hoạt tính protease 4.3.2.1 Xác định hoạt độ chế phẩm protease từ vi sinh vật (phương pháp Anson cải tiến) Hoạt độ riêng chế phẩm biểu diễn đơn vị hoạt động thuỷ phân chế phẩm 1mg protein a Thiết bị, vật liệu hoá chất Máy đo mật độ quang Máy lắc ống nghiệm ( vortex mier Ống nghiệm Dung dịch Na2CO3 6% Dung dịch acid trichloracetic (TAC) 5% Dung dịch hemoglobin biến tính 2% dung dịch casein 2% Thuốc thử Folin- Ciocalteu Dung dịch tyrosine chuẩn 1mol/ml b Cách tiến hành Chuẩn bị dụng dịch tyrosine có nồng độ từ 0.01 đến 0.05 mol/ml cách pha loãng dung dịch tyrosine chuẩn bị mol/ml với dung dịch HCL 0.2N Lập đồ thị đường chuẩn biểu diễn phụ thuộc hấp thu theo lượng tyrosine (tính (mol) sau: cho 1ml dung dịch tyrosine pha loãng vào ống nghiệm (số ống nghiệm số dung dịch tyrosine pha loãng), thêm 4ml dung dịch Na2CO3 6% lắc thêm 1ml thuốc thử Foline pha loãng lần, lắc đều, để 30 phút nhiệt độ phòng đem so màu bước sóng 750nm Sử dụng cuvette dày 1cm Chuẩn bị ống nghiệm sạch: ống thí nghiệm ống kiễm tra Cho vào ống thí nghiệm 2ml dung dịch hemoglobin 2% hay casein 2%, để yên từ 5-10 phút để dung dịch đạt 30 OC Cho vào ống 1ml dung dịch enzyme có nhiệt độ 30OC.Giữ ống 30OC 10 phút Khi 10 phút, cho vào 5ml acid trichloracetic 5%, lắc đều, giữ 30 phút 30 OC Lọc lấy 1ml dung dịch lọc cho vào ống nghiệm khác, thêm 4ml dung dịch Na2CO3 6%, lắc đều, thêm 1ml thuốc thử Foline pha loãng lần, lắc đều, để 30 phút nhiệt độ phòng đem so màu với bước sóng 750nm Sử dụng dụng cụ vette dày 1cm Đối với ống kiểm tra: cho vào ống nghiệm 2ml dung dịch hemoglobin 2% hay casein 2%( sử dụng dùng loại chất với ống thí nghiệm), cho 5ml acid trichloracetic 5% vào ngay, lắc cho 1ml enzyme vào Tiến hành bước tương tự Lấy hiệu số giá trị độ hấp thụ quang mẫu thí nghiệm mẫu kiểm tra đối chiếu với đồ thị chuẩn, tính số mol tyrosine tương ứng Tính số đơn vị hoạt động thuỷ phân (HP) 1ml dung dịch enzym đem phân tích để xác định hoạt độ theo cơng thức: HP/ml= (số mol tyrosine x 8)/t (đơn vị) Trong đó, thể tích tồn hỗn hợp phản ứng (2ml dung dịch chất, 1ml dung dịch enzym 5ml dung dịch acid trichloracetic), t thời gian ủ enzyme với chất (10 phút) Tính hoạt độ thuỷ phân chế phẩm: HP/glucoamylase chế phẩm= HP/ml x 1000)/ a ( đơn vị) Trong đó: a- số mg chế phẩm đem phân tích 4.3.2.2 Phương pháp chuẩn độ formol Phương pháp vào tăng nhóm carboxyl hay amin tự dung dịch thuỷ phân protein Protein bị thuỷ phân nhiều số nhóm carboxy hay amin tự dung dịch tăng Trong phương pháp này, formol sử dụng để khố nhóm amin, cịn nhóm carboxy chuẩn độ dung dịch kiềm có nồng độ xác định Từ tính số mg đạm amin tương ứng sở lượng kiềm sử dụng Hoạt độ enzyme tính số mg đạm amin tương ứng sở lượng kiềm sử dụng Hoạt độ enzyme tính số mg đạm amin tạo thành sau điều kiện nhiệt độ pH thích hợp a Vật liệu, hố chất Bể điều nhiệt hay ủ ấm Bình tam giác dung tích 100ml Dung dịch đệm có pH thích hợp cho hoạt động enzyme Dung dịch gelatin 2% Hỗn hợp formol Dung dịch NaOH 0,1N b Cách tiến hành Chuẩn bị hai bình tam giác dung tích 100ml Cho vào bình thứ (bình thí nghiệm) 10ml dung dịch gelatin 2% dung dịch đệm có pH thích hợp, 5ml dung dịch enzyme, lắc đều, giữ 40 OC 1h bể điều nhiệt, lấy bình ra, thêm 10ml hỗn hợp formol chuẩn độ dung dịch NaOH 0.1N xuất mùa xanh da trời Cho vào bình thứ (bình kiểm tra) tương tự cho hổn hợp formol vào với gelatin, lắc cho dung dịch enzyme vào.Ở điều kiện này, enzyme bị kiềm hãm hoàn toàn Tiến hành chuẩn độ song song với bình thí nghiệm xuất màu xanh da trời Hoạt độ phân giải protein 1ml dung dịch enzyme tính sau: H= (a-b) x 1.42/ t x v đơn vị Trong đó: a- Số ml dung dịch NaOH 0.1 N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm b- Số ml dung dịch NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ bình kiểm tra t- thời gian tác dụng enzyme sử dụng (ml) v- thể tích dung dịch enzyme sử dụng (ml) 1.42- số mg đạm amin tương ứng với 1ml dung dịch NaOH 0.1N BÀI 5: XÁC ĐỊNH TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ VÀ COLIFORM 5.1 Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí 5.1.1 Mơi trường hố chất Mơi trường sử dụng Plate Count Agar (PCA) có pH 7.0-0.2 Mơi trường pha chế, phân phối vào bình thuỷ tinh hay ống nghiệm hấp khử trùng 121OC 15 phút Các bình ống nghiệm chứa mơi trường chưa sử dụng bảo quản tủ lạnh -8 OC Trước sử dụng môi trường phải đun chảy làm nguội 45OC bề điều nhiệt Ngoài mơi trường trên, cịn sử dụng mơi trường khác Trytose Glucose Agar, Nutrient Agar Dung dịch nước muối pepton SPW (Saline Peppton Water) dùng pha loãng chứa 8g NaCl 1g pepton 100ml nước Dung dịch chứa bình chứa 0.5-1 lít, hấp khử trùng phân phối thành thể tích xác 9ml vào ống nghiệm vơ trùng 5.1.2 Quy trình phân tích 5.1.2.1 Chuẩn bị mẫu nước trước phân tích Trước tiến hành phân tích, thực việc đồng mẫu sau: mẫu dạng rắn dùng dụng cụ kéo, kẹp khử trùng cân xác 10g (hay 25g) mẫu vào bao PE Tất thao tác cần phải tiến hành điều kiện vô trùng Thêm vào lượng mẫu 90ml (hay 225ml) dung dịch pha loãng SPW Thực đồng mẫu máy dập mẫu (stomacher) Thời gian dập mẫu phụ thuộc vào tính chất lý mẫu, khơng q 2.5 phút Trong trường hợp khơng có máy dập mẫu thực thao tác đồng mẫu sau:xát nhuyễn mẫu điều kiện vơ trùng Cân xác điều kiện vô trùng (225ml) nước SPW hấp khử trùng Lắc thời gian định (ít phút) Đối với mẫu dạng lỏng, hút 10ml (hoặc 25ml) cho vào bình tam giác chứa 90ml (hay 225ml) nước SPW hấp khử trùng lắc Sau làm đồng phương pháp trên, dung dịch mẫu thu có độ pha lỗng 10 lần so với ban đầu Dịch mẫu đồng tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân cách dùng pipet vô trùng ( pipetman với đầu típ vơ trùng), chuyển 1ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng Trộn mẫu ống nghiệm cho đồng máy rung (vortex) hay dùng pipet hút đảo dịch mẫu lên xuống 510 lần Dung dịch mẫu có độ pha lỗng 10-2 Sau sử dụng pipet pipetman có đầu tip chuyển 1ml dịch mẫu vào ống nghiệm thứ chứa dung dịch pha loãng thao tác tương tự để có dịch mẫu với độ pha loãng 10-3 Tiếp tục thực tương tự để có độ pha lỗng thập phân theo độ pha loãng cần thiết Lưu ý pipet đầu tip pipetman nguy bị nhiễm trình thao tác ( chạm tay, chạm mặt ngồi ống nghiệm, mặt ngồi bình chứa, ), cần phải thay pipet đầu tip vô trùng khác 5.1.2.2 Cấy mẫu Chọn hay độ pha loãng liên tiếp dự kiến chứa 22-250 tế bào vi sinh vật 1ml để cấy lên đĩa petri Dùng pipet vô trùng pipetman với đầu típ vơ trùng chuyển 1ml dịch mẫu pha lỗng chọn vào đĩa petri vơ trùng Tương ứng với độ pha lỗng cấy 2-3 đĩa (tức thực 2-3 lần lặp lại) Sau cấy đổ vào đĩa 10-15ml môi trường PCA đun chảy ổn định 45OC Trộn dịch mẫu với mơi trường cách xoay trịn đĩa petri xuôi ngược chiều kim đồng hồ, chiều 3-5 lần sau đổ môi trường Đặt đĩa mặt phẳng ngang cho thạch đông đặc Lật ngược ủ đĩa tủ ấm nhiệt độ 30- 10OC 72 Nhiệt độ thời gian ủ thay đổi theo qui định tiêu chuẩn 5.1.2.3 Cách tính kết Đếm tất số khuẩn lạc xuất đĩa sau ủ Chọn đĩa có số lượng đếm từ 25-250 để tính kết Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí 1g hay 1ml mẫu tính sau: N A (CFU/g hay CFU/ml= N1VF1+…+ Nifi Trong đó: A: số tế bào ( đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn 1g hay 1ml mẫu N: tổng số khuẩn lạc đếm ngược đĩa chọn Ni: số lượng đĩa cấy tai độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào đĩa Fi: độ pha lỗng tương ứng Ví dụ: trường hợp phân tích 1g mẫu cụ thể nhận kết sau: Nồng độ pha loãng Đĩa1 Đĩa 10-3 235 246 10-4 26 21 235 + 246 + 26 A= = 2.4 x 105 (CFU/g) 2x1 x 0.001 + x x 0.001 Các kết tổng số vi khuẩn hiếu khí thường biểu diễn dạng số mũ số thập phân, Trường hợp có khuẩn lạc vi sinh vật mọc loang, mõi vết loang tính khuẩn lạc Nếu số khuẩn lạc chiếm 1/3 đĩa phải ghi nhận điều đánh dấu kết nhận Nếu độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm ngược đĩa > 250, ví dụ nồng độ 10-5 số đếm lớn 250, kết ghi: > 2.5 x 107 CFU/g Nếu độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm đĩa < 25, ví dụ nồng độ 10 -1 số đếm nhỏ 25, kết ghi: < 2,5 x 102 CFU/g Qui trình định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí thực phẩm tóm tắt Chuẩn bị dịch đồng pha lỗng mẫu để có độ pha lỗng 10-1 10-2, 10-3 Chọn nồng độ pha lỗng thích hơp, chuyển 1ml mẫu vào đĩa petri vô trùng (mỗi nồng độ cấy đĩa) Rót vào đĩa 10-15 ml môi trường PAC làm nguội đến 45OC, lắc cho mẫu phân tán vào môi trường, ủ 30OC Chọn đĩa có số khuẩn lạc khoảng 25- 250 khuẩn lạc/ đĩa để điếm Tính kết quả: tổng vi sinh vật hiếu khí mẫu (CFU/g CFU/ml) 5.2 Coliform tổng số 5.2.1 Định nghĩa Coliforms trực khuẩn Gram âm không sinh bào tử, hiếu khí kỵ khí tuỳ ý, có khả lên men lactose sinh acid sinh 37 OC 24-48 Trong thực tế phân tích, Coliforms cịn định nghĩa vi khuẩn có khả lên men sinh khoảng 48h ủ 37 OC môi trường canh Lauryl Sulphate canh Brilliant Green Lactose Bile Salt Nhóm Coliforms diện rộng rãi tự nhiên, ruột, động vật Coliform xem nhóm vi sinh vật thị: số lượng diện chúng thực phẩm, nước hay loại mẫu môi trường dùng để thị khả diện vi sinh vật gây bệnh khác Nhiều nghiên cứu cho thấy số Coliform thực phẩm cao khả diện vi sinh vật gây bệnh khác cao Tuy nhiên, mối liên hệ vi sinh vật gây bệnh vi sinh vật thị nhiều tranh cãi Nhóm Coliform gồm giống là: Escherichia với loài E.coli, Citrobacter, Klebsiella Enterobacter Tính chất sinh hố đặc trưng nhóm thể qua thử nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges- Proskauer (VP) Citrate (iC) thường gọi tóm tắt chung IMViC 5.2.2 Định lượng coliform phương pháp MPN 5.2.2.1 Định nghĩa phương pháp MPN Là phương pháp đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn diện đơn vị thể tích mẫu Phương pháp dùng để định lượng nhóm vi sinh vật ni cấy môi trường lỏng chọn lọc cho kết biểu kiến thích hợp Là phương pháp định lượng dựa kết định tính loạt thí nghiệm lặp lại số độ pha loãng khác (Thông thường, lặp lại lần độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng: 3x3= ống nghiệm) Số lượng ống nghiệm lặp lại cao độ xác phương pháp lớn Qui trình thực phương pháp sau: Cho vào ống nghiệm có chứa mơi trường thích hợp cho tăng trưởng đối tượng vi sinh vật cần định lượng thể tích xác định dung dịch mẫu nồng độ pha loãng liên tiếp - Ủ nhiệt độ thời gian thích hợp - Dựa vào kết biểu kiến chứng minh tăng trưởng vi sinh vật cần kiểm định ống nghiệm (phản ứng dương tính), ghi nhận số lượng độ pha loãng - Sử dụng số liệu dựa vào bảng Mac Crady suy mật độ vi sinh vật trình bày dạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu 5.2.2.2 Nguyên tắc định lượng phương pháp MPN Phương pháp dựa vào nguyên tắc mẫu pha loãng thành dãy thập phân (hai nồng độ khác 10 lần); mẫu có độ pha lỗng thập phân liên tiếp ủ ống nghiệm chứa mơi trường thích hợp có ống bẫy khí Durham Mỗi nồng độ pha lỗng ủ từ đến ống lặp lại Theo dõi sinh đổi màu để định tính diện ống thử nghiệm; ống dương tính Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính nồng độ pha lỗng dựa vào bảng tính MPN để suy số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng diện 1ml mẫu ban đầu A Dụng cụ thí nghiệm - Ống nghiệm chứa môi trường dinh dưỡng - Erlen 100ml, 150ml - Bercher 100ml, 250ml - Đèn cồn, diêm quẹt - Cồn 96 70o - Que cấy - Mẫu phân tích - Autoclave - Pipet pipetman - Giấy thấm - Gịn khơng thấm - Giấy gói - Mẫu thực phẩm phân tích B Mơi trường hố chất - Môi trường lỏng Laryl Sulphate Broth LSB ( canh Laryl Sulphate) - Môi trường lỏng Brillian Green Lactose Bile Salt (canh BGBL) - Môi trường lỏng chuẩn bị ống nghiệm chứa ống Durham úp ngược Sau khử trùng, sử dụng ống nghiệm khơng có bọt khí bên ống Durham - Dung dịch nước muối pepton SPW (Saline Pepton Water) C Quy trình phân tích Chuẩn bị dịch đồng mẫu pha lỗng mẫu để có dịch mẫu có độ pha loãng 10 , 10 , 10-3 (như 2) -1 -2 Tuần tự lấy 1ml dịch mẫu pha loãng 10 -1 vào ống nghiệm giống nhau, ống chứa 10ml canh LSB Thực tương tự với dịch mẫu pha loãng 10 -2 10-3 Đây môi trường xác định MNP hệ dãy nồng độ ống nghiệm lặp lại (3x hay ống nghiệm) Nếu nghi ngờ số lượng Colifom mẫu cao, phải sử dụng mẫu có bậc pha lỗng cao Ủ ống nghiệm 37 OC ± 1OC 24h ± 1h Ghi nhận số ống sinh Vói ống nghiệm khơng sinh hơi, tiếp tục ủ 37OC ± 1OC 24h ± 1h Sau 48h ± 2, loại bỏ ống khơng sịnh hơi, (-) tính Ghi nhận số lượng (+), (-) tính Dùng que cấy vịng cấy chuyển dịch mẫu từ ống LSB (+) sang ống có chứa canh BGBL ủ 37OC ± 1OC 24h ± 1h Ghi nhận số ống có sinh Với ống khơng sinh hơi, tiếp tục ủ 37OC +-1 OC 24h ± 1h Với ống không sinh hơi, tiếp tục ủ 37OC ± 1OC 24h ± 1h Sau 48h ± 2h, loại bỏ ống không sinh hơi, (-) tính Ghi nhận số lượng ống (+), (-) tính Cách đọc kết Ở tất trường hợp nêu trên, từ số lượng ống nghiệm có (+) (sinh hơi/ mơi trường ni cấy bị đục) độ pha loãng mẫu, dùng bảng PMN thích hợp (bảng x tức ống nghiệm) để tính mật độ vi sinh vật mẫu biễu diễn dạng trị số MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha lỗng Ví dụ: Ở nồng độ 10-1 có ống dương tính, 10-2 có ống dương tính, 10 -3 có ống dương tính, ta số ống dương tính , tra bảng MPN cho kết 43 PMN/ml Nếu nồng độ sử dụng khác so bảng tra Ta thực công thức: MPN (tra bảng) x 10-1/ độ pha lỗng thấp nhất= MPN/ml Ví dụ: nồng độ 10-3 có ống dương tính, 10-4 có ống dương tính, 10-5 có ống dương tính, ta số ống dương tính la 0, tra bảng MNP ta 43 MNP/ml Kết quả: 43 (tra bảng) x 10-1/ 10-3= 4300MNP/ml PHỤ LỤC A- MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Môi trường PCA (Plate Count Agar) Peptone 5g Cao nấm men 2.5g Glcose 1g Agar 20g Nước cất 1000ml Khử trùng 121 0C 15 phút Môi trường dịch chiết khoai tây (môi trường PCA: nuôi cấy nấm mốc- nấm sợi) Dịch chiết khoai tây 200ml Glucose 20g Agar 20g Nước cất Dịch chiết khoai tây: 200g khoai tây cắt lát, không giọt vỏ, đun sôi lít nước cất 30 phút Lọc lấy phần lỏng trộn với thành phần khác, đun sôi để hoà tan Hấp tiệt trùng 121OC 15 phút Môi trường giá đâu- đường (nuôi cấy nấm men) Cân 100g giá đậu Thêm 100ml nước Đun sôi 30 phút Lọc lấy phần dịch Thêm nước cho đủ 1000ml Thêm 50g đường Môi trường Sabourand (nuôi cấy nấm men) Pepton 10g Glucose 4g Agar 20g Nước lít pH= 5.6-6.0 Môi trường Hansen (nuôi cấy nấm men) Peptone Glucose K2HPO4 MgSO4.7H2O Agar Nước Môi trường LSB (Lauryl Sulphate Broth): Cân xác 36.5 g mơi trường LSB bổ sung nước cất vừa đủ 1000ml, khuấy đều, phân phối vào ống nghiệm (mỗi ống nghiệm 10ml) hấp khử trùng 12OC 15 phút Thành phần môi trường gồm: Petone 20g Lactose 5g Sodium choloride 5g Monopotassium phosphate 2.75g Disodium phosphate 2.75g Sodium Lauryl sulfate 0.1 g pH 6.8 ± khử trùng 121OC 15 phút MƠI TRƯỜNG BGBL: cân xác 40g mơi trường BGBL bổ sung nước cất vừa đủ 1000ml, khuấy đều, phân phối vào ống nghiệm (mỗi ống 10ml) hấp khử trùng 121OC 15 phút Thành phần môi trường gồm: Peptone 10g Lactose 10g Mật bò 20g Brilliant green 0.0133g O Nước cất 121 C 15 phút B- DUNG DỊCH VÀ THUỐC THỬ Dung dịch muối pepton SPW: dùng pha lỗng mẫu phân tích NaCl 8.5g Pepton 1g Nước cất 1000ml Khử trùng 121OC 15 phút Dung dịch chứa bình chứa 0.5- 10 lit, hấp khử trùng phân phối thành thể tích xác 9ml vào ống nghiệm vô trùng Dung dịch Ba(OH)2 10% Ba(OH)2 10g Nước cất 100ml Thuốc thử uphenmen Phenol 5% 10ml FeCl3 2ml Dung dịch K2Cr2O7 1% K2Cr2O7 1g Nước cất 100ml Dung dịch AgNO3 ammoniac AgNO3 10g Thêm vài ml ammoniac Nước cất lên đến Dung dịch H2SO4 10% H2SO4 đậm đặc Nước cất Dung dịch FeCl3 FeCl3 Nước cất 100ml 60,6 ml lít 5% 5g 100ml Dung dịch Lugol Iodinne tinh thể 1g KI 2g Nước cất 300ml Thuốc thử xanh methylen (Leoffer’s) Dung dịch A Xanh methylen (chất nhuộm 90%) 0.3g Ethanol 95% 30ml Dung dịch B KOH loãng (0.01% (w/v)) 100ml (khoãng viên KOH lít) Trộn A B lại với Dung dịch NaOH 20% NaOH 20g Nước cất 100ml Dung dịch NaOH 1N NaOH 40g Nước cất 1lit Nếu dùng NaOH 0,1N dùng 4g NaOH Dung dịch tinh bột 0.1% Tinh bột 0.1g Nước cất 100ml Trộn tinh bột với khoãng 10ml nước cất, thêm tiếp 80ml nước cất sôi, khuấy đều, để nguội, thêm nước cất đến 100ml Dung dịch iod 0.02% KI 2g Iodine Nước cất 100ml Hoà tan 2g KI 3ml nước cất, thêm 0.25g iodine, lắc cho tan, thêm nước cất đến 100ml Dung dịch NaCl 0.1% NaCl 0.1g Nước cất 100ml ... nhận xác định hoạt tính enzyme từ vi sinh vật Bài 4: Phương pháp thu nhận xác định hoạt tính enzyme từ vi sinh vật Bài 5: Xác định tổng vi khuẩn hiếu khí coliform BÀI 1: XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG LÊN MEN... nhóm vi sinh vật thị: số lượng diện chúng thực phẩm, nước hay loại mẫu môi trường dùng để thị khả diện vi sinh vật gây bệnh khác Nhiều nghiên cứu cho thấy số Coliform thực phẩm cao khả diện vi sinh. .. tạo thành đáng kể Các vi khuẩn tham gia trình chủ yếu loài vi khuẩn thuộc giống Streptococcus, Lactobacillus,… Phần thực tập nhằm giúp sinh vi? ?n biết cách lên men cải chua, làm quen với số vi khuẩn