Nội dung:Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật trong một mẫu thực phẩm Bài 2: Xác định khả năng chuyển hóa hydratcacbon của VSVBài 3: Xác định khả năng thủy phân protein và khả năng sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật
THỰC HÀNH VI SINH VẬT ỨNG DỤNG NỘI DUNG Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật mẫu thực phẩm Bài 2: Xác định khả chuyển hóa hydratcacbon VSV Bài 3: Xác định khả thủy phân protein khả sinh tổng hợp enzym vi sinh vật Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật mẫu thực phẩm I Khái quát chung công tác xác định số lượng VSV Mục tiêu: Giúp cho người nghiên cứu biết mật độ vi sinh vật có mẫu thực phẩm bao nhiêu, phục vụ cho công tác nghiên cứu (tỷ lệ tiếp giống…), cho công tác công bố chất lượng thực phẩm Các phương pháp xác định: + Phương pháp xác định trực tiếp + Phương pháp xác định gián tiếp Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật mẫu thực phẩm II Phương pháp xác định trực tiếp số lượng vi sinh vật Nguyên tắc - Sử dụng khung đếm Goriaep (buồng đếm hồng cầu) CẤU TẠO CỦA BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU Đây phiến kính dày, phần phiến kính có khắc lưới vng với diện tích 1mm CẤU TẠO CỦA BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU - Lưới khắc chia thành 25 ô vuông lớn diện tích vng lớn 1/25 mm - Mỗi ô vuông lớn lại chia thành 16 ô vuông nhỏ Số ô vuông nhỏ lưới khắc 400 diện tích vuông nhỏ 1/400 mm - Chiều sâu ô 1/10 mm Phương pháp xác định trực tiếp số lượng vi sinh vật Cách tiến hành - Xác định số lượng tế bào nấm men men bánh mì khơ - Pha lỗng mẫu đến nồng độ 10 -4 - Nhỏ giọt dịch huyền phù có vi sinh vật vào khung đếm đậy kín kính, di chuyển nhẹ khung đếm làm dịch chiếm đầy khoang - Đặt khung đếm vào bàn kẹp tiêu kính hiển vi, chọn vật kính 10x 40x từ từ dùng ốc chỉnh thô đưa bàn kẹp tiêu lên để buồng đếm gần chạm vào vật kính - Dùng ốc vi chỉnh từ từ đưa tiêu xuống để tìm ảnh lấy nét Tiến hành đếm số tế bào ô vuông lớn 20 ô vuông nhỏ Phương pháp xác định trực tiếp số lượng vi sinh vật Tính kết quả: n - N = a 10 10 /h.s - -n Trong N: số tế bào gram men bánh mì; a số tế bào trung bình hình vng lưới nồng độ pha lỗng 10 , h chiều sâu khung đếm; n độ pha lỗng dịch huyền phù; s diện tích hình vng lưới - Lưu ý: số tế bào ô lớn không vượt 20, số tế bào ô nhỏ không vượt 10 Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật mẫu thực phẩm III Phương pháp xác định gián tiếp số lượng vi sinh vật thông qua phương pháp đếm khuẩn lạc Nguyên tắc: Mẫu đồng pha lỗng đến nồng độ thích hợp cấy mơi trường thạch chọn lọc cho nhóm, lồi VSV Xác định số lượng khuẩn lạc bề mặt thạch sau thời gian nuôi tủ ấm Cách đếm: lấy bút chì kẻ đường vng góc đáy hộp petri Đếm số khuẩn lạc góc theo thứ tự từ trái qua phải, từ xuống Phương pháp xác định gián tiếp số lượng vi sinh vật Cách tiến hành: - Yêu cầu xác định số lượng tế bào nấm men men bánh mì khơ - Chuẩn bị mơi trường Hansen: + Thành phần môi trường: Đường saccarose: 30g/l; Pepton 10 g/l; K2HPO4: 3g/l; MgSO4.7H2O: g/l; Agar: 20g/l; Nước: 1000ml + Chuẩn bị 200ml môi trường, khử trùng 121 C/15 phút Sau để nguội, đổ vào đĩa petri khử trùng 10 Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật mẫu thực phẩm V Đặt thí nghiệm cho Thí nghiệm thủy phân protein Chuẩn bị 5g thịt vụn + 150ml nước vào bình tam giác 250ml Đun sôi cách thủy 10 phút Để nguội, kiểm tra pH giấy thử pH Kẹp miếng giấy thử pH miệng bình tam giác để kiểm tra bay khí NH Ủ nhiệt độ phòng ngày 14 Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật mẫu thực phẩm V Đặt thí nghiệm cho 2.Thí nghiệm thử khả sinh tổng hợp enzyme amilase - Chuẩn bị môi trường: + Thành phần môi trường: NaNO3: 3g/l; K2HPO4: 1g/l; KCl: 0,5g/l; MgSO4.7H20: 0,5g/l; FeSO4: 0,1g/l; Tinh bột tan: 15g/l; Agar: 20g/l; Nước: 1000ml (Chú ý: Tinh bột tan hòa nước ấm cho tan thành dạng hồ đổ vào môi trường) + Chuẩn bị 200ml môi trường, khử trùng 121 C/15 phút Sau để nguội, đổ vào đĩa petri khử trùng - Cấy chấm điểm nấm mốc Aspergillus Penecillium vào đĩa: giống nấm mốc cấy vào đĩa 15 Bài 2: Xác định khả chuyển hóa hydratcacbon vi sinh vật - Quan sát trạng thái bình lên men: - Quan sát tế bào nấm men: Làm tiêu tươi không nhuộm, quan sát vật kính 40X, xác định hình dạng, cách xếp tế bào nấm Quá trình lên men rượu: men - Xác định tỷ lệ nấm men nảy chồi: Làm tiêu tươi không nhuộm, quan sát vật kính 40X, đếm tổng số tế bào nấm men số tế bào nấm men nảy chồi trường kính để tính Cách làm tiêu tươi không nhuộm: Nhỏ giọt dung dịch chứa VSV vào phiến kính, dùng lam kính đậy lại 16 PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC Bài 1: -8 -6 -8 Tổ 1: Chuẩn bị dãy pha loãng đến nồng độ 10 ; cấy nồng độ (10 đến 10 ) vào đĩa môi trường Hansen ; đếm số tế bào nấm men nồng độ 10 -4 ô lớn, tính kết Tổ 2: Chuẩn bị 200 ml môi trường Hansen; đổ môi trường Hansen vào đĩa; đếm số tế bào nấm men nồng độ 10 -4 20 nhỏ, tính kết Tổ 3: Chuẩn bị 200 ml môi trường thử khả STH enzym amilase; đổ môi trường thử khả STH enzym amilase vào đĩa; đếm số tế bào nấm men nồng độ 10 -4 lớn, tính kết Tổ 4: Đặt TN TN thủy phân protein 3; cấy chủng nấm mốc vào đĩa môi trường thử khả STH enzym amilase; đếm số tế bào nấm men nồng độ 10 -4 20 ô nhỏ, tính kết 17 Bài 2: Xác định khả chuyển hóa hydratcacbon vi sinh vật - Quá trình lên men rượu: Xác định tỷ lệ nấm men sống: Làm tiêu tươi nhuộm đơn safranin, quan sát vật kính 40X, đếm tổng số tế bào nấm men số tế bào nấm men sống trường kính để tính Cách làm tiêu tươi nhuộm đơn: Nhỏ giọt dung dịch chứa VSV vào phiến kính, nhỏ tiếp giọt thuốc nhuộm safarnin, trộn đều, dùng lam kính đậy lại, đếm vòng phút Lưu ý: Tế bào nấm men sống không bắt màu, tế bào nấm men chết bắt màu thuốc nhuộm 18 Bài 2: Xác định khả chuyển hóa hydratcacbon vi sinh vật - - Quá trình lên men lactic : Quan sát trạng thái bình lên men: Xác định lượng axit lactic tạo thành: Cân 10g sữa chua vào bình tam giác 250ml, thêm 20ml nước, thêm 1-2 giọt phenolphtalein, chuẩn độ dung dịch NaOH 0,1N 1ml NaOH 0.1N = 0,009g lactic - Quan sát vi khuẩn lactic: làm 01 tiêu cố định nhuộm Gram để quan sát: hình dạng, cách xếp, loại Gram chủng vi khuẩn lactic sữa chua 19 Bài 2: Xác định khả chuyển hóa hydratcacbon vi sinh vật - - Quá trình lên men axetic : Quan sát trạng thái bình lên men Xác định lượng axit axetic tạo thành: Hút 10ml dịch lên men axetic vào bình tam giác 250ml, thêm 20ml nước, thêm 1-2 giọt phenolphtalein, chuẩn độ dung dịch NaOH 0,1N 1ml NaOH 0.1N = 0,006g axetic - Quan sát vi khuẩn axetic: làm 01 tiêu cố định nhuộm Gram để quan sát: hình dạng, cách xếp, loại Gram chủng vi khuẩn axetic dịch lên men 20 Các bước nhuộm gram Các bước nhuộm Gram - Cố định vết bôi: Đặt giọt nước cất lên phiến kính, lấy vòng que cấy tròn sinh khối vi sinh vật hòa vào giọt nước cất (hoặc lấy giọt dung dịch chứa vi sinh vật đặt lên phiến kính), dàn mỏng, hong khơ - Nhỏ dd Crystal violet (tím) thấm ướt hết giấy lọc Để từ – phút ( nếu vi khuẩn lấy từ canh lỏng để phút, lấy từ thạch dinh dưỡng để phút ) Rửa nước (trong giây), hong khô. - Tẩy lugol: Nhỏ dung dịch lugol (KI + I2) trùm lên vết thuốc nhuộm, giữ phút, đổ dung dịch lugol - Tẩy cồn 96: 15 – 30 giây (vi khuẩn lấy từ canh lỏng tẩy 15 giây, từ thạch dinh dưỡng tẩy 30 giây ) Rửa nước, thấm (hong) khô Tẩy cồn bằng cách để nghiêng tiêu bản, cho cồn chảy từ từ mép trên phiến kính Quan sát mép giọt cồn vừa mất màu tím. 22 Các bước nhuộm Gram - Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi, nhuộm lần cách nhỏ dung dịch safranin kiềm loãng (màu hồng) để phút Rửa nước, thấm (hong) khô tiêu bản. - Quan Vi sát khuẩn G vật (+) bắt kính màu dầu, tím độ Crystal phóng violet, đại vi 100 khuẩn lần. G bắt màu hồng - Chú ý: Trước lần nhỏ thuốc nhuộm lên tiêu bản, phải đặt miếng giấy lọc phủ lên vết bôi. Sau lần nhuộm phải rửa nước thấm (hong) khô tiêu bản. 23 (–) Bài 3: Xác định khả thủy phân protein khả sinh tổng hợp enzym vi sinh vật - - Xác định khả thủy phân protein VSV Quan sát tượng Xác định định tính : So sánh giá trị pH thời điểm đặt thí nghiệm thời điểm đọc kết - Quan sát vi khuẩn gây thối rữa protein: Làm 01 tiêu cố định nhuộm Gram từ dịch thủy phân để xác định: Hình dạng loài vi khuẩn, so sánh tỷ lệ vi khuẩn G(+) G(-) tiêu 24 Bài 3: Xác định khả thủy phân protein khả sinh tổng hợp enzym vi sinh vật Xác định khả sinh tổng hợp emzym amilaza - Thuốc thử: Dùng dung dịch Lugol (I2 KI) đổ vào đĩa thạch có chứa tinh bột tan ni nấm mốc - Xác định định tính khả sinh enzym amilase VSV: Xác định đường kính khuẩn lạc: d (mm) Xác định đường kính vòng mơi trường bị thủy phân: D (mm) Hiệu số D – d đại lượng định tính để xác định khả sinh enzym vi sinh vật So sánh khả sinh enzym amilase loài nấm mốc sử dụng 25 Bài 3: Xác định khả thủy phân protein khả sinh tổng hợp enzym vi sinh vật Xác định khả sinh tổng hợp emzym amilaza - Quan sát nấm mốc: + Làm 01 tiêu tươi khơng nhuộm: để quan sát hình dạng hệ sợi nấm (có vách ngăn hay khơng, có phân nhánh hay không?), màu bào tử + Làm 01 tiêu tươi nhuộm đơn safranin: để quan sát phận sinh bào tử nấm mốc (bào tử trần hay bào tử nang, bào tử trần dạng bàn tay xòe hay dạng hoa hướng dương ) 26 PHÂN CƠNG CÔNG VIỆC Bài + 3: Tổ 1: Đếm số khuẩn lạc nấm men 1, tính kết quả; làm tiêu tươi không nhuộm nấm men; tiêu cố định nhuộm Gram vi khuẩn lactic sữa chua; tiêu cố định nhuộm Gram vi khuẩn axetic Tổ 2: Xác định lượng axit lactic tạo thành sữa chua; ; làm tiêu tươi nhuộm đơn nấm men; tiêu cố định nhuộm Gram vi khuẩn lactic nước dưa chua; tiêu cố định nhuộm Gram vi khuẩn axetic Tổ 3: Xác định lượng axit axetic tạo thành; ; làm tiêu tươi không nhuộm nấm mốc Aspergillus; tiêu cố định nhuộm Gram vi khuẩn lactic sữa chua; tiêu cố định nhuộm Gram vi khuẩn thủy phân protein Tổ 4: Xác định hiệu số D – d hai chủng nấm mốc; Xác định lượng axit axetic tạo thành; làm tiêu tươi nhuộm đơn nấm mốc Aspergillus; tiêu cố định nhuộm Gram vi khuẩn lactic nước dưa chua; tiêu cố định nhuộm Gram vi khuẩn thủy phân protein 27 PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC Bài + 3: Tổ 1: Đếm số khuẩn lạc nấm men 1, tính kết quả; làm tiêu tươi khơng nhuộm nấm men; tiêu cố định nhuộm Gram vi khuẩn lactic sữa chua; tiêu cố định nhuộm Gram vi khuẩn axetic Tổ 2: Xác định lượng axit lactic tạo thành sữa chua; ; làm tiêu tươi nhuộm đơn nấm men; tiêu cố định nhuộm Gram vi khuẩn lactic nước dưa chua; tiêu cố định nhuộm Gram vi khuẩn axetic Tổ 3: Xác định lượng axit axetic tạo thành; ; làm tiêu tươi không nhuộm nấm mốc Aspergillus; tiêu cố định nhuộm Gram vi khuẩn lactic sữa chua; tiêu cố định nhuộm Gram vi khuẩn thủy phân protein Tổ 4: Xác định hiệu số D – d hai chủng nấm mốc; Xác định lượng axit axetic tạo thành; làm tiêu tươi nhuộm đơn nấm mốc Aspergillus; tiêu cố định nhuộm Gram vi khuẩn lactic nước dưa chua; tiêu cố định nhuộm Gram vi khuẩn thủy phân protein 28 ... sinh vật mẫu thực phẩm Bài 2: Xác định khả chuyển hóa hydratcacbon VSV Bài 3: Xác định khả thủy phân protein khả sinh tổng hợp enzym vi sinh vật Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật mẫu thực phẩm... nghiên cứu biết mật độ vi sinh vật có mẫu thực phẩm bao nhiêu, phục vụ cho công tác nghiên cứu (tỷ lệ tiếp giống…), cho công tác công bố chất lượng thực phẩm Các phương pháp xác định: + Phương... tích 1mm CẤU TẠO CỦA BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU - Lưới khắc chia thành 25 ô vuông lớn diện tích ô vuông lớn 1/25 mm - Mỗi ô vuông lớn lại chia thành 16 ô vuông nhỏ Số ô vuông nhỏ lưới khắc 400 diện