Phúc trình thực tập vi sinh vật môi trường
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÚC TRÌNH THỰC TẬP VI SINH VẬT MƠI TRƯỜNG Mã học phần: CS107 Người hướng dẫn: Th.s Nguyễn Thị Liên Thành viên nhóm: Nguyễn Trọng Nghĩa B1303590 Nguyễn Thị Ngọc Giàu B1303564 Nguyễn Hữu Toàn B1303538 Cần Thơ, 11/2015 MỤC LỤC Phần 1: QUAN SÁT CÁC VI SINH VẬT TRONG CÁC MẪU NƯỚC Ở NGUỒN TỰ NHIÊN I Giới thiệu vi sinh vật nước II Vật liệu phương pháp thu mẫu quan sát mẫu kính hiển vi 1 Dụng cụ thiết bị Phương pháp lấy mẫu từ nguồn nước Phương pháp lấy mẫu để quan sát kính hiển vi III Kết quan sát kính hiển vi Mẫu nước sông lớn 2 Mẫu nước cửa sông 3 Mẫu nước cống Căn tin ký túc xá khu A 4 Mẫu nước rạch hẻm 51 5 Mẫu nước ao sen Mẫu nước ao cá tra Mẫu nước ao tù Mẫu nước rỉ rác 11 Phần 2: PHÂN LẬP VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI CELLULOSE TỪ ĐẤT 12 I GIỚI THIỆU 12 Giới thiệu chung 12 Cellulose 13 Các vi khuẩn có khả phân giải Cellulose 14 II Vật liệu phương pháp 15 Vật liệu 15 Phương pháp 15 III Kết thảo luận 19 Kết phân lập 20 Đặc điểm tế bào vi khuẩn phân lập kính hiển vi 22 Kết kiểm tra sinh hóa 24 Thảo luận 28 Phần 1: QUAN SÁT CÁC VI SINH VẬT TRONG CÁC MẪU NƯỚC Ở NGUỒN TỰ NHIÊN I Giới thiệu vi sinh vật nước Vi sinh vật có mặt khắp nơi nguồn nước Có nhiều yếu tố tác động đến sựu phân bố vi sinh vật nước hàm lượng muối, chất hữu cơ, pH, nhiệt độ ánh sáng Ngoài ra, tuỳ theo loại thủy vực mà có vai trị khác nhau, khiến cho phân bố vi khuẩn nấm sơng, hồ, biển có số khác biệt đặc trưng Trong nước vi sinh vật phân bố nhiều vùng duyên hải (littoral zone), vùng nước nông (limnetic zone) vùng nước sâu (profundal zone), vùng đáy ao hồ (benthic zone) Số lượng số loại vi sinh vật nước phụ thuộc vào nhiều yếu tố, hàm lượng chất hữu có nước, hóa chất độc hại, tia tử ngoại, pH mơi trường, yếu tố có tính chất định đến tăng khối lượng vi sinh vật chất dinh dưỡng Trong nước có nhiều loại vi sinh vật: vi khuẩn, tảo nguyên sinh động vật chủ yếu vi khuẩn Nói chung, nước số vi khuẩn khơng bào tử chiếm ưu thế, cịn bùn số vi khuẩn có bào tử lại chiếm ưu II Vật liệu phương pháp thu mẫu quan sát mẫu kính hiển vi Dụng cụ thiết bị: kính hiển vi, lam kính, lam men, ống hút pipet, chai lọ, bình tam giác Phương pháp lấy mẫu từ nguồn nước Những dụng cụ lấy mẫu nhằm để phân tích vi sinh vật nước chai lọ súc rửa cẩn thận rửa lại nước cất phải khử trùng trước lấy mẫu Mẫu lấy vào dụng cụ lấy mẫu không lấy đầy chai mà phải chừa khoảng khơng khí chai chứa mẫu để đảm bảo mẫu trộn trước phân tích Sau lấy mẫu xong phải đóng chặt nút chai lại Lấy mẫu nước nguồn sông suối cách cầm chai lấy mẫu tay, gần vị trí đáy chai, đưa cổ chai xuống nước đưa sâu xuống mặt nước Trong trường hợp lấy mẫu xa bờ thuyền cần lấy mẫu nước trước mũi thuyền Lấy mẫu nước thải sinh hoạt: Mẫu nước phải lấy trực tiếp từ đường ống Lấy mẫu nước từ ao, hồ: Mẫu lấy không gần bờ xa bờ, không sâu không cạn Phương pháp lấy mẫu để quan sát kính hiển vi - Hút giọt nước từ mẫu cho lên lam kính dùng lamen đậy lại (tránh tạo bọt khí) - Đặt lên kính hiển vi quan sát mẫu vật kính 10X, sau chuyển qua vật kính 40X (có thể điều chỉnh độ sáng phù hợp để quan sát mẫu rõ hơn), sau di chuyển sang thị trường khác để tìm kiếm nhóm vi sinh vật khác có mẫu - Quan sát ghi nhận nhóm lồi quan sát mẫu III Kết quan sát kính hiển vi Mẫu nước sơng lớn Hình Mẫu nước sơng lớn + Đặc điểm: nước có màu trắng đục, khơng có mùi + Các vi sinh vật quan sát được: Tập đồn Volvox Hình Tập đồn Volvox vật kính 40X Mẫu nước cửa sơng Hình Mẫu nước cửa sơng + Đặc điểm: nước có màu trắng khơng mùi + Các vi sinh vật quan sát được: vi khuẩn hình cầu kết cặp Hình Vi khuẩn hình cầu kết đơi vật kính 40X 3 Mẫu nước cống Căn tin ký túc xá khu A Hình Mẫu nước cống Căn tin KTX khu A + Đặc điểm: nước có màu trắng đục có mùi + Các vi sinh vật quan sát được: Vi khuẩn hình que, tảo mắt, nguyên sinh động vật Hình Tảo mắt vật kính 40X Hình Vi khuẩn hình que vật kính 40X Mẫu nước rạch hẻm 51 Hình Mẫu nước rạch hẻm 52 + Đặc điểm: nước có màu trắng xanh, khơng mùi + Các vi sinh vật quan sát được: tập đoàn Volvox, vi khuẩn Hình Tập đồn Volvox vật kính 40X Hình 10 Vi khuẩn vật kính 40X Mẫu nước ao sen Hình 11 Mẫu nước ao sen + Đặc điểm: nước có màu trắng không mùi + Các vi sinh vật quan sát được: trùng roi, Phacus Hình 12 Phacus kính hiển vi vật kính 40X II Vật liệu phương pháp Vật liệu - Nguồn đất: mẫu đất vùng rễ bắp - Môi trường nuôi cấy: PDA môi trường phân lập: CMC Thành phần môi trường CMC Khối lượng 1g 1g 0,5g 0,001g 10g 20g - Hóa chất (NH4)2SO4 K2HPO4 MgSO4.7H2O NaCl CMC Agar Thêm nước cất cho đủ lít chỉnh pH=7 - Hóa chất để kiểm tra thủy phân CMC: Congo Red dung dịch muối NaCl 1M - Dụng cụ thiết bị: cân, máy khuấy từ, bình tam giác, tủ ủ, tủ cấy vô trùng, que trải, que cấy, đĩa petri, đèn cồn, micropipette, lam kính,… Phương pháp a) Phương pháp phân lập 15 Cân khoảng 10g đất Cho vào bình tam giác có chứa 90 ml nước cất vô trùng Lắc 30 phút Để yên 15 phút để đất lắng xuống đáy bình Mẫu đất sau lắc 30 phút để yên Pha loãng mẫu với tỉ lệ 1: (50µl mẫu :50µl nước) để yên để mẫu lắng Dùng micropipette lấy 50µl phần dịch trải lên môi trường Mẫu sau pha loãng Ủ 30oC khoảng 2-3 ngày Chọn khuẩn lạc đơn cấy chuyển lên môi trường Cấy chuyển ròng Khuẩn lạc sau cấy trải khuẩn lạc chọn để cấy chuyển (khuẩn lạc khoanh tròn) Quan sát mẫu KHV ghi nhận đặc điểm tế bào khả chuyển động chúng Mơ tả hình dạng khuẩn lạc (kích thước, hình dạng, màu sắc, dạng bìa, độ nổi, bề mặt khuẩn lạc) 16 b) Phương pháp kiểm tra khả thủy phân CMC vi khuẩn phân lập Lấy sinh khối khuẩn lạc phân lập Chia đĩa petri làm ba chấm sinh khối thành điểm môi trường CMC Ủ ngày 30oC Nhuộm môi trường với dung dịch Congo Red 15 phút Rửa lại đĩa môi trường dung dịch NaCl 1M Quan sát hình thành vịng halo xung quanh khuẩn lạc c) Kiểm tra sinh hóa Thử nghiệm catalase Lấy sinh khối khuẩn lạc môi trường thạch sau 24-48 h ủ Rồi chuyển lên miếng, sau nhỏ giọt H2O2 3% Quan sát hình thành bọt khí ghi nhận kết + Dương tính: có hình thành bọt khí + Âm tính: Khơng có hình thành bọt khí 17 Hình Phân biệt kết thử nghiệm catalase Thử nghiệm oxidase Nhỏ 3-4 giọt nước cất vô trùng lên lam để giấy lọc có tẩm thuốc thử oxydase lấy sinh khối dùng que cấy trải lên giấy lọc quan sát màu sau 10s + Dương tính: xuất màu xanh đậm + Âm tính: khơng xuất màu Hình Phân biệt kết thử nghiệm oxidase d) Nhuộm gram Trình tự nhuộm Gram thực sau: - Lấy 10µl nước cất vơ trùng nhỏ lên kính mang vật - Dùng que cấy khử trùng đèn cồn lấy vi sinh vật trải mỏng vi sinh vật kính mang vật - Hơ mẫu vật lửa đèn cồn nhằm mục đích cố định vi sinh vật kính mang vật - Nhỏ từ đến hai giọt Crytal violet lên kính mang vật có chứa mẫu vi sinh vật cố định, trải Crystal violet que cấy để phút - Rửa lại nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô nước 18 - Nhỏ từ 1-2 giọt dung dịch Iod trải que cấy để phút - Rửa lại nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô - Rửa lại cồn 70°C thật nhanh để tầy màu từ đầu đến cuối kính mang vật sai giọt cồn cuối khơng cịn màu tím - Rữa lại nước cất vơ trùng vài giây, chậm nhẹ cho khô - Nhỏ từ 1-2 giọt Fucshin trải que cấy sau để khơ phút - Rữa lại nước cất vô trùng giọt nước cuối không màu Fushin - Dùng giấy thấm chậm nhẹ cho kính mang vật khơ nước - Quan sát mẫu kính hiển vi quang học có độ phóng đại 400 lần ghi nhận Gram vi khuẩn Nếu vi khuẩn có màu tím xanh Crystal violet mẫu Gram dương, có màu hồng đỏ Fushin mẫu Gram âm Hình Phân biệt kết nhuộm Gram III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sau khoảng tuần tiến hành cấy chuyển ta thu kết sau: 19 Trong phần ta quy ước: (1) Kết phân lập kiểm tra sinh hóa Nguyễn Hữu Toàn (2) Kết phân lập kiểm tra sinh hóa Nguyễn Thị Ngọc Giàu (3) Kết phân lập kiểm tra sinh hóa Nguyễn Trọng Nghĩa Kết phân lập (1) (2) (3) Hình Kết phân lập Hình dạng khuẩn lạc Nguyễn Hữu Tồn (1) 20 Hình Hình dạng khuẩn lạc phân lập Nguyễn Hữu Toàn Miêu tả hình dạng khuẩn lạc: Hình dạng khuẩn lạc: hình trịn Dạng bìa: bìa ngun Độ nổi: mơ Màu sắc: trắng đục Kích thước khuẩn lạc: 0,2 cm Bề mặt khuẩn lạc: trơn, nhầy, ướt Nguyễn Thị Ngọc Giàu (2) Hình Hình dạng khuẩn lạc phân lập Nguyễn Thị Ngọc Giàu Miêu tả hình dạng khuẩn lạc: Hình dạng khuẩn lạc: hình trịn Dạng bìa: nguyên Độ nổi: phẳng 21 Màu sắc: trắng đục Kích thước khuẩn lạc: 0,4 cm Bề mặt khuẩn lạc: khơ Nguyễn Trọng Nghĩa (3) Hình 10 Hình dạng khuẩn lạc phân lập Nguyễn Trọng Nghĩa Miêu tả hình dạng khuẩn lạc: Hình dạng khuẩn lạc: hình trịn Dạng bìa: bìa nguyên Độ nổi: mô Màu sắc: đỏ tươi Kích thước khuẩn lạc: 0,15 cm Bề mặt khuẩn lạc: trơn, láng, bóng Nhận xét: từ hình dạng đặt điểm khuẩn lạc sau phân lập ta thấy ba chủng vi khuẩn phân lập ba chủng vi khuẩn khác Đặc điểm tế bào vi khuẩn phân lập kính hiển vi Nguyễn Hữu Tồn (1) 22 A B Hình 11 Hình ảnh chụp từ kính hiển vi với độ phóng đại 400 lần chủng (1) Đặc điểm tế bào Hình dạng: hình ovan Chuyển động: không Dạng tế bào: đơn kết cặp Nguyễn Thị Ngọc Giàu (2) A B Hình 12 Hình ảnh chụp từ kính hiển vi với độ phóng đại 400 lần chủng (2) Đặc điểm tế bào Hình dạng: hình que ngắn 23 Chuyển động: không Dạng tế bào: kết đôi kết ba Nguyễn Trọng Nghĩa A B Hình 13 Hình ảnh chụp từ kính hiển vi với độ phóng đại 400 lần chủng (3) Đặc điểm tế bào Hình dạng: hình cầu Chuyển động: khơng Dạng tế bào: đơn Kết kiểm tra sinh hóa a) Kết nhuộm gram Nguyễn Hữu Toàn 24 Hình 14 Kết nhuộm Gram chủng (1) Nguyễn Thị Ngọc Giàu Hình 15 Kết nhuộm Gram chủng (2) Nguyễn Trọng Nghĩa 25 Hình 16 Kết nhuộm Gram chủng (3) Nhận xét: qua màu sắc kết nhuộm gram ba mẫu ta xác định ba chủng vi khuẩn gram âm b) Kết thử nghiệm catalase oxidase Kết thử nghiệm catalase (1) (2) (3) Hình 17 Kết thử nghiệm catalase Nhận xét: ba chủng dương tính với catalase Kết thử nghiệm oxidase 26 (1) (2) (3) Hình 18 Kết thử nghiệm oxidase Nhận xét: ba mẫu không đổi màu nên chủng đầu âm tính với oxidase c) Khả thủy phân CMC vi khuẩn Nguyễn Hữu Tồn (1) Hình 19 Kết thí nghiệm khả thủy phân CMC mẫu (1) Nguyễn Thị Ngọc Giàu (2) 27 Hình 20 Kết thí nghiệm khả thủy phân CMC mẫu (2) Nguyễn Trọng Nghĩa (3) Hình 21 Kết thí nghiệm khả thủy phân CMC mẫu (3) Nhận xét: từ kết cho thấy Chủng (1) có khả thủy phân CMC Chủng (2) (3) khơng có khả thủy phân CMC Thảo luận Do trình phân lập diễn thời gian ngắn khó khăn để phân lập dòng phân hủy cellulose đất có nhiều vi khuẩn khác vi khuẩn cố định đạm, phân giải lân, phân hủy cellulose,… tùy thuộc vào loại đất 28 vùng rễ mà phân loại nhiều dịng hay dòng phân hủy cellulose Tuy nhiên thời gian thực tập, nhóm có bạn phân lập dịng vi khuẩn có khả phân giải cellulose 29 ... trường, yếu tố có tính chất định đến tăng khối lượng vi sinh vật chất dinh dưỡng Trong nước có nhiều loại vi sinh vật: vi khuẩn, tảo nguyên sinh động vật chủ yếu vi khuẩn Nói chung, nước số vi. .. hiển vi 22 Kết kiểm tra sinh hóa 24 Thảo luận 28 Phần 1: QUAN SÁT CÁC VI SINH VẬT TRONG CÁC MẪU NƯỚC Ở NGUỒN TỰ NHIÊN I Giới thiệu vi sinh vật nước Vi sinh vật có... vi sinh vật quan sát được: Tập đồn Volvox Hình Tập đồn Volvox vật kính 40X Mẫu nước cửa sơng Hình Mẫu nước cửa sơng + Đặc điểm: nước có màu trắng không mùi + Các vi sinh vật quan sát được: vi