Phúc trình thực tập vi sinh vật môi trường

Phúc trình thực tập vi sinh vật môi trường

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

  

PHÚC TRÌNH THỰC TẬP

VI SINH VẬT MÔI TRƯỜNG

Mã học phần: CS107

Người hướng dẫn: Thành viên nhóm:

Th.s Nguyễn Thị Liên Nguyễn Trọng Nghĩa B1303590

Nguyễn Thị Ngọc Giàu B1303564 Nguyễn Hữu Toàn B1303538

Cần Thơ, 11/2015

MỤC LỤC

Phần 1: QUAN SÁT CÁC VI SINH VẬT TRONG CÁC MẪU NƯỚC Ở NGUỒN

TỰ NHIÊN 1

I Giới thiệu vi sinh vật trong nước 1

II Vật liệu và phương pháp thu mẫu và quan sát mẫu dưới kính hiển vi 1

1 Dụng cụ và thiết bị 1

2 Phương pháp lấy mẫu từ các nguồn nước 1

3 Phương pháp lấy mẫu để quan sát dưới kính hiển vi 2

III Kết quả quan sát dưới kính hiển vi 2

1 Mẫu nước sông lớn 2

2 Mẫu nước ở cửa sông 3

3 Mẫu nước cống Căn tin ký túc xá khu A 4

4 Mẫu nước rạch hẻm 51 5

5 Mẫu nước ở ao sen 7

6 Mẫu nước ở ao cá tra 8

7 Mẫu nước ao tù 9

8 Mẫu nước rỉ rác 11

Phần 2: PHÂN LẬP VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI CELLULOSE TỪ ĐẤT 12

I GIỚI THIỆU 12

1 Giới thiệu chung 12

2 Cellulose 13

3 Các vi khuẩn có khả năng phân giải Cellulose 14

II Vật liệu và phương pháp 15

1 Vật liệu 15

2 Phương pháp 15

III Kết quả và thảo luận 19

1 Kết quả phân lập 20

3 Kết quả các kiểm tra sinh hóa 24

4 Thảo luận 28

Phần 1: QUAN SÁT CÁC VI SINH VẬT TRONG CÁC MẪU NƯỚC Ở NGUỒN

TỰ NHIÊN

I Giới thiệu vi sinh vật trong nước

Vi sinh vật có mặt ở khắp nơi trong các nguồn nước Có nhiều yếu tố tác động đến sựu phân bố của vi sinh vật trong nước như hàm lượng muối, chất hữu cơ, pH, nhiệt độ và ánh sáng Ngoài ra, tuỳ theo loại thủy vực mà nó có vai trò khác nhau, khiến cho sự phân

bố vi khuẩn và nấm trong các sông, hồ, biển có một số khác biệt đặc trưng

Trong nước vi sinh vật được phân bố nhiều ở vùng duyên hải (littoral zone), vùng nước nông (limnetic zone) và ngay cả ở vùng nước sâu (profundal zone), vùng đáy ao hồ (benthic zone)

Số lượng và số loại vi sinh vật trong nước phụ thuộc vào nhiều yếu tố, nhất là hàm lượng chất hữu cơ có trong nước, các hóa chất độc hại, tia tử ngoại, pH môi trường, những yếu tố có tính chất quyết định đến sự tăng khối lượng vi sinh vật như các chất dinh dưỡng

Trong nước có nhiều loại vi sinh vật: vi khuẩn, tảo và nguyên sinh động vật nhưng chủ yếu vẫn là vi khuẩn

Nói chung, trong nước số vi khuẩn không bào tử chiếm ưu thế, còn trong bùn thì

số vi khuẩn có bào tử lại chiếm ưu thế

II Vật liệu và phương pháp thu mẫu và quan sát mẫu dưới kính hiển vi

1 Dụng cụ và thiết bị: kính hiển vi, lam kính, lam men, ống hút pipet, chai lọ, bình

tam giác

2 Phương pháp lấy mẫu từ các nguồn nước

Những dụng cụ lấy mẫu nhằm để phân tích vi sinh vật trong nước là các chai lọ đã được súc rửa cẩn thận và rửa lại bằng nước cất và phải được khử trùng trước khi lấy mẫu

Mẫu lấy vào các dụng cụ lấy mẫu không được lấy đầy chai mà phải chừa một khoảng không khí trong chai chứa mẫu để đảm bảo mẫu được trộn đều trước khi phân tích Sau khi lấy mẫu xong phải đóng chặt nút chai lại

Lấy mẫu nước ở các nguồn sông suối bằng cách cầm chai lấy mẫu trong tay, gần vị trí đáy chai, đưa cổ chai xuống nước và đưa sâu xuống dưới mặt nước Trong trường hợp lấy mẫu xa bờ khi đi trên thuyền thì cần lấy mẫu nước ở trước mũi thuyền

Lấy mẫu nước thải sinh hoạt: Mẫu nước phải lấy trực tiếp từ các đường ống chính Lấy mẫu nước từ ao, hồ: Mẫu lấy không được quá gần bờ hoặc quá xa bờ, không quá sâu cũng không quá cạn

3 Phương pháp lấy mẫu để quan sát dưới kính hiển vi

- Hút một giọt nước từ từng mẫu cho lên lam kính và dùng lamen đậy lại (tránh tạo bọt khí)

- Đặt lên kính hiển vi và quan sát mẫu ở vật kính 10X, sau đó chuyển qua vật kính 40X (có thể điều chỉnh độ sáng phù hợp để quan sát mẫu rõ hơn), sau đó di chuyển sang các thị trường khác nhau để tìm kiếm các nhóm vi sinh vật khác có trong mẫu

- Quan sát và ghi nhận từng nhóm hoặc từng loài quan sát được ở từng mẫu

III Kết quả quan sát dưới kính hiển vi

1 Mẫu nước sông lớn

Hình 1 Mẫu nước sông lớn + Đặc điểm: nước có màu trắng hơi đục, không có mùi

+ Các vi sinh vật quan sát được: Tập đoàn Volvox

Hình 2 Tập đoàn Volvox ở vật kính 40X

2 Mẫu nước ở cửa sông

Hình 3 Mẫu nước cửa sông + Đặc điểm: nước có màu trắng trong và không mùi

+ Các vi sinh vật quan sát được: vi khuẩn hình cầu kết cặp

Hình 4 Vi khuẩn hình cầu kết đôi ở vật kính 40X

3 Mẫu nước cống Căn tin ký túc xá khu A

Hình 5 Mẫu nước cống Căn tin KTX khu A + Đặc điểm: nước có màu trắng đục và có mùi hôi

+ Các vi sinh vật quan sát được: Vi khuẩn hình que, tảo mắt, nguyên sinh động vật

Hình 6 Tảo mắt ở vật kính 40X

Hình 7 Vi khuẩn hình que ở vật kính 40X

4 Mẫu nước rạch hẻm 51

Hình 8 Mẫu nước rạch hẻm 52 + Đặc điểm: nước có màu trắng trong hơi xanh, không mùi

+ Các vi sinh vật quan sát được: tập đoàn Volvox, vi khuẩn

Hình 9 Tập đoàn Volvox ở vật kính 40X

Hình 10 Vi khuẩn ở vật kính 40X

5 Mẫu nước ở ao sen

Hình 11 Mẫu nước ao sen

+ Đặc điểm: nước có màu trắng trong và không mùi

+ Các vi sinh vật quan sát được: trùng roi, Phacus

Hình 12 Phacus dưới kính hiển vi ở vật kính 40X

Hình 13 Trùng roi xanh ở vật kính 40X

6 Mẫu nước ở ao cá tra

Hình 14 Mẫu nước ao cá tra + Đặc điểm: màu trắng trong hơi xanh và không mùi

+ Các vi sinh vật quan sát được: Euglena

Hình 15 Euglena ở vật kính 40X

7 Mẫu nước ao tù

Hình 16 Mẫu nước ao tù + Đặc điểm: nước có màu vàng xanh và không mùi

+ Các vi sinh vật quan sát được: tập đoàn Volvox, tảo silic

Hình 17 Tảo silic ở vật kính 40X

Hình 18 Tập đoàn Volvox ở vật kính 40X

8 Mẫu nước rỉ rác

Hình 19 Mẫu nước rỉ rác + Đặc điểm: nước có màu nâu và có mùi hôi

+ Các vi sinh vật quan sát được: vi khuẩn

Hình 20 Vi khuẩn trong nước rỉ rác ở vật kính 40X

Phần 2: PHÂN LẬP VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI CELLULOSE TỪ

ĐẤT

I GIỚI THIỆU:

1 Giới thiệu chung

Khoảng một nửa hợp chất carbon trong sinh khối (biomass) trên mặt đất là cellulose, chiếm tới 35 – 50% khối lượng khô sinh khối thực vật Tất cả sản phẩm sinh khối sẽ được khoáng hóa nhờ hệ thống enzyme được cung cấp bởi vi sinh vật Hệ thống enzyme phân giải cellulose thường chậm và không hoàn toàn Tuy nhiên, trong khoảng thời gian ngắn (48 giờ) hệ vi sinh vật trong dạ cỏ bò có thể phân giải 60– 65% cellulose Hơn thế nữa, nhờ hệ thống vi sinh vật trong đường ruột mà loài mối có thể tiêu hóa đến 90% cellulose của gỗ Còn trong hệ thống sinh học phức tạp như rễ cây hoặc những mảnh

vỡ thực vật trong đất, cellulose có thể được phân hủy trong khoảng thời gian lâu hơn 1T (Schwarz, 2001)1T Hệ vi sinh vật phân giải cellulose có thể lên men hiếu khí hoặc kỵ khí, bình nhiệt hoặc ái nhiệt, bao gồm nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn được tìm thấy nhiều trong đất, nước, đường tiêu hóa một số động vật… nơi cung cấp lượng cellulose dồi dào

để vi sinh vật phân giải và phát triển

Đồng bằng sông Cửu Long là vùng chuyên canh cây lúa, hàng năm sinh ra một lượng rơm rạ khổng lồ Với phế phẩm giàu cellulose này, một lượng rất ít được sử dụng để trồng nấm hay làm thức ăn gia súc, phần lớn được xử lý theo phương pháp truyền thống là đốt trực tiếp trên đồng ruộng, điều này gây ra nhiều hậu quả như góp phần ô nhiễm không khí, phá hủy hệ sinh thái đất và đất ngày càng bạc màu Một biện pháp nhằm tận dụng rơm rạ có hiệu quả hơn đó là sử dụng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose giúp phân giải rơm rạ thành phân hữu cơ bón cho đất, góp phần cải thiện độ phì nhiêu đất

Hình 1 Một số hình ảnh lãng phí chất hữu cơ

2 Cellulose

Cellulose là hợp chất cao phân tử được trùng hợp (polyme hóa) từ các gốc glucose bằng cầu nối β-1,4-glycosid nhờ vào khả năng tự dưỡng dưới ánh sáng của thực vật Vì vậy, cellulose là hợp chất phổ biến nhất trong tự nhiên Cellulose có cấu trúc mạch thẳng dạng sợi rất bền, khó bị phân hủy Hằng ngày một lượng lớn cellulose

β-D-từ xác bả thực vật, cây cối chết, cành lá rơi rụng rác sinh hoạt….tích lũy trong đất Nếu không có nhóm vi sinh vật phân giải cellulose thì lượng hữu cơ này tràng ngập trái đất trong thời gian ngắn

Muốn phân hủy cellulose sinh vật cần phải có enzyme cellulase Con người và phần lớn động vật không có enzyme này nên không phân hủy được cellulose Riêng động vật nhai lại có thể phân hủy được cellulose nhờ hệ vi sinh vật trong dạ cỏ

 Cơ chế quá trình phân hủy cellulose

Cellulose là hợp chất không hoà tan, khó bị phân hủy Enzyme phân hủy cellulose nhờ hệ enzyme cellulase gồm 4 enzyme

 Enzyme1: cellobiohyrolase cắt đứt liên kết hydro

 Enzyme 2: endoglucanase cắt đứt các liên kết β-1,4 bên trong phân tử tạo thành những chuỗi carbon dài

 Enzyme 3: exoglucanase phân cắt các chuỗi carbon dài thành các disaccharide là cellobiose

 Enzyme 4: β-glucosidase thuỷ phân cellobiose thành glucose

3 Các vi khuẩn có khả năng phân giải Cellulose

Các dòng vi khuẩn hiếu khí thường gặp là Pseudomonas, Cellulomonas,

Hình 3 Các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose Các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose kém hơn nấm vì thường chúng tiết ra không đủ loại enzyme nên thông thường mỗi loài vi khuẩn tiết ra một hay 2 loại enzyme và kết hợp với các dòng khác mới phân hủy hết được cellulose

II Vật liệu và phương pháp

1 Vật liệu

- Nguồn đất: mẫu đất vùng rễ của bắp

- Môi trường nuôi cấy: PDA và môi trường phân lập: CMC

- Thêm nước cất cho đủ 1 lít và chỉnh pH=7

- Hóa chất để kiểm tra thủy phân CMC: Congo Red và dung dịch muối NaCl 1M

- Dụng cụ và thiết bị: cân, máy khuấy từ, bình tam giác, tủ ủ, tủ cấy vô trùng, que trải, que cấy, đĩa petri, đèn cồn, micropipette, lam kính,…

2 Phương pháp

a) Phương pháp phân lập

Ủ ở 30 o C trong khoảng 2-3 ngày

Chọn khuẩn lạc đơn cấy chuyển lên môi trường

Mô tả hình dạng khuẩn lạc (kích thước, hình dạng, màu sắc,

dạng bìa, độ nổi, bề mặt của khuẩn lạc)

Quan sát mẫu dưới KHV và ghi nhận các đặc điểm của tế

bào và khả năng chuyển động của chúng

Mẫu đất sau khi đã lắc 30 phút và để yên

Mẫu sau khi pha loãng

Khuẩn lạc sau khi cấy trải và khuẩn lạc được chọn để cấy chuyển (khuẩn lạc

được khoanh tròn)

b) Phương pháp kiểm tra khả năng thủy phân CMC của vi khuẩn phân lập

c) Kiểm tra sinh hóa

 Thử nghiệm catalase

Lấy sinh khối khuẩn lạc trên môi trường thạch sau 24-48 h ủ Rồi chuyển lên miếng, sau

đó nhỏ một giọt H2O2 3% Quan sát sự hình thành bọt khí và ghi nhận kết quả

+ Dương tính: khi có hình thành bọt khí

+ Âm tính: Không có sự hình thành bọt khí

Lấy sinh khối khuẩn lạc đã phân

lập

Chia đĩa petri làm ba và chấm sinh khối thành 3

điểm trên môi trường CMC

Ủ trong 3 ngày ở 30 o C

Nhuộm môi trường với dung dịch Congo Red

trong 15 phút

Rửa lại đĩa môi trường bằng dung dịch NaCl 1M

Quan sát sự hình thành vòng halo xung quanh

khuẩn lạc

Hình 4 Phân biệt kết quả thử nghiệm catalase

 Thử nghiệm oxidase

Nhỏ 3-4 giọt nước cất vô trùng lên lam để giấy lọc có tẩm thuốc thử oxydase lấy sinh khối và dùng que cấy trải đều lên giấy lọc quan sát màu sau 10s

+ Dương tính: xuất hiện màu xanh đậm

+ Âm tính: không xuất hiện màu

Hình 5 Phân biệt kết quả thử nghiệm oxidase

d) Nhuộm gram

Trình tự nhuộm Gram được thực hiện như sau:

- Lấy 10µl nước cất vô trùng nhỏ lên giữa kính mang vật

- Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn đèn cồn lấy một ít vi sinh vật rồi trải

mỏng vi sinh vật trên kính mang vật

- Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn nhằm mục đích cố định vi sinh vật trên kính

mang vật

- Nhỏ từ một đến hai giọt Crytal violet lên kính mang vật có chứa mẫu vi sinh vật

đã cố định, trải đều Crystal violet bằng que cấy và để 2 phút

- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô nước

- Nhỏ từ 1-2 giọt dung dịch Iod rồi trải đều bằng que cấy và để trong một phút

- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô

- Rửa lại bằng cồn 70°C thật nhanh để tầy màu từ đầu đến cuối kính mang vật sai cho đến khi giọt cồn cuối cùng không còn màu tím nữa

- Rữa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô

- Nhỏ từ 1-2 giọt Fucshin rồi trải đều bằng que cấy sau đó để khô 1 phút

- Rữa lại bằng nước cất vô trùng cho đến giọt nước cuối cùng không còn màu của Fushin

- Dùng giấy thấm chậm nhẹ cho kính mang vật khô nước

- Quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại 400 lần và ghi nhận Gram của vi khuẩn Nếu vi khuẩn có màu tím xanh của Crystal violet là mẫu Gram dương, có màu hồng đỏ của Fushin là mẫu Gram âm

Hình 6 Phân biệt kết quả nhuộm Gram

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Sau khoảng 1 tuần tiến hành cấy chuyển ta thu được kết quả như sau:

Trong phần này ta quy ước:

(1) Kết quả phân lập và kiểm tra sinh hóa của Nguyễn Hữu Toàn

(2) Kết quả phân lập và kiểm tra sinh hóa của Nguyễn Thị Ngọc Giàu

(3) Kết quả phân lập và kiểm tra sinh hóa của Nguyễn Trọng Nghĩa

1 Kết quả phân lập

(3) Hình 7 Kết quả phân lập

1 Hình dạng khuẩn lạc

 Nguyễn Hữu Toàn (1)

Hình 8 Hình dạng khuẩn lạc phân lập được của Nguyễn Hữu Toàn

Miêu tả hình dạng của khuẩn lạc:

Hình 9 Hình dạng khuẩn lạc phân lập được của Nguyễn Thị Ngọc Giàu

Miêu tả hình dạng của khuẩn lạc:

 Hình dạng khuẩn lạc: hình tròn

 Dạng bìa: nguyên

 Màu sắc: trắng đục

 Kích thước khuẩn lạc: 0,4 cm

 Bề mặt khuẩn lạc: khô

 Nguyễn Trọng Nghĩa (3)

Hình 10 Hình dạng khuẩn lạc phân lập được của Nguyễn Trọng Nghĩa

Miêu tả hình dạng của khuẩn lạc:

Nhận xét: từ hình dạng và đặt điểm của các khuẩn lạc sau khi phân lập thì ta thấy rằng ba

chủng vi khuẩn phân lập được là ba chủng vi khuẩn khác nhau

2 Đặc điểm tế bào vi khuẩn phân lập được dưới kính hiển vi

 Nguyễn Hữu Toàn (1)

Hình 11 Hình ảnh chụp từ kính hiển vi với độ phóng đại 400 lần ở chủng (1)

3 Kết quả các kiểm tra sinh hóa

a) Kết quả nhuộm gram

 Nguyễn Hữu Toàn

Hình 14 Kết quả nhuộm Gram ở chủng (1)

 Nguyễn Thị Ngọc Giàu

Hình 15 Kết quả nhuộm Gram ở chủng (2)

 Nguyễn Trọng Nghĩa

Hình 16 Kết quả nhuộm Gram ở chủng (3)

Nhận xét: qua màu sắc của kết quả nhuộm gram ở ba mẫu trên ta có thể xác định cả ba

chủng trên đều là vi khuẩn gram âm

b) Kết quả thử nghiệm catalase và oxidase

 Kết quả thử nghiệm catalase

Hình 17 Kết quả thử nghiệm catalase

Nhận xét: cả ba chủng đều dương tính với catalase

 Kết quả thử nghiệm oxidase

(1) (2) (3)

Hình 18 Kết quả thử nghiệm oxidase

Nhận xét: cả ba mẫu đều không đổi màu nên cả 3 chủng đầu âm tính với oxidase

c) Khả năng thủy phân CMC của vi khuẩn

 Nguyễn Hữu Toàn (1)

Hình 19 Kết quả thí nghiệm khả năng thủy phân CMC mẫu (1)

 Nguyễn Thị Ngọc Giàu (2)

Hình 20 Kết quả thí nghiệm khả năng thủy phân CMC mẫu (2)

 Nguyễn Trọng Nghĩa (3)

Hình 21 Kết quả thí nghiệm khả năng thủy phân CMC mẫu (3)

Nhận xét: từ kết quả cho thấy rằng

 Chủng (1) có khả năng thủy phân CMC

 Chủng (2) và (3) không có khả năng thủy phân CMC

4 Thảo luận

Do quá trình phân lập diễn ra trong một thời gian ngắn rất khó khăn để phân lập được đúng những dòng phân hủy cellulose do trong đất có khá nhiều vi khuẩn khác nhau như vi khuẩn cố định đạm, phân giải lân, phân hủy cellulose,… và tùy thuộc vào loại đất