Thực tập vi sinh đại cương

Thực tập vi sinh đại cương

Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C

2.Ý nghĩa của việc kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí:

Tổng số vi sinh vật hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệsinh của thực phẩm,đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật,nguy cơ hưhỏng ,thời hạn bảo quản của sản phẩm,mức độ vệ sinh trong quá trình chếbiến và bảo quản thực phẩm

Sự tăng trưởng vi sinh vật trong thực phẩm dẫn đến biến đổi chấtlượng : 106 tế bào/g(ml) là ranh giới để phân biệt thực phẩm có dấu hiệu hưhỏng hay không.Một vài trường hợp vsv=106 tế bào/g(ml) chưa có dấu hiệu

hư hỏng rõ ràng về mặt hóa học.Đặc biệt ở sữa khi có 105 tế bào/g(ml) sữa bịchua: 106-107tế bào/g(ml) sữa có mùi hôi;108 tế bào/g(ml) tất cả thực phẩm

có mùi hôi không chấp nhận được;109-1010tế bào/g(ml) thực phẩm thay đổicấu trúc

3.Quy trình kiểm tra:

Trang 2

1ml(10 -1 )+ 9ml nước 1ml(10 -1 )+ 9ml nước nước vô trùng nước vô trùng

Bước 2 : pha loãng mẫu

Chuẩn bị các ống nghiệm và pipet vô trùng.Dùng pipet 10ml vô trùnglấy 9 ml NaCl vô trùng vào các ống nghiệm Dùng micropipet 1ml vô trùnglấy 1ml từ nồng độ 10-1 đưa vào ống nghiệm thứ nhất Tiến hành rung lắcống nghiệm bằng máy rung ống nghiệm votex, thu được nồng độ 10-2 .Làmtương tự với các nồng độ kế tiếp

Lưu ý khi pha loãng mẫu:

Trang 3

-Nồng độ pha loãng phụ thuộc vào tình trạng vệ sinh của thựcphẩm,thời gian bảo quản, điều kiện bảo quản,kinh nghiệm người kiểmnghiệm…

-Tiến hành thao tác bên ngọn lửa đèn cồn.Các ống nghiệm,pipet phải

vô trùng.Sử dụng 1 micropipet 1ml/ 1 nồng độ pha loãng mẫu để tránh hiệntượng sai số

-Mỗi lần lấy mẫu phải lắc đều

Bước 3: nuôi cấy dịch mẫu

Nuôi cấy ít nhất ở 3 nồng độ pha loãng mẫu liên tiếp

Dùng micropipet 1ml vô trùng lấy 1ml dịch mẫu cho vào đĩa,ít nhất 2đĩa/nồng độ

Chuẩn bị môi trường đã tiệt trùng,để nguội 450C,đổ môi trường vàocác đĩa đã chứa 1ml dịch mẫu Xoay nhẹ đĩa theo vòng tròn nhằm trộn đềudịch mẫu với môi trường để thu được những khuẩn lạc tách rời.Khi môitrường đông lại,lật ngược đĩa,ủ trong trong tủ ổn nhiệt Memmert

Nếu muốn kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí,dùng môi trường P.C.Ahoặc N.A

Nếu muốn kiểm tra tổng số men, mốc dùng môi trương P.D.A hoặcSabouraund

Thời gian ủ vi khuẩn hiếu khí 24-48h/30-370C.Thời gian ủ men,mốc72h/30-370C

Bước 4: đếm số khuẩn lạc /đĩa/các nồng độ(25-250 khuẩn lạc/đĩa)

Trang 4

Bước 5: tính kết quả theo công thức

n = c/(n1+0.1n2)*d

n : tổng số tế bào / ml (g) mẫu thực phẩm(cfu/g(ml))

c : tổng số khuẩn lạc đếm được

n1 : số đĩa đếm được ở nồng độ thư nhất

n2 : số đĩa đếm được ở nồng độ thư hai

d : nồng độ pha loãng thứ nhất được đếm

Meat extract :2.5g D(+) glucose :1.0g

Nước cất vừa đủ :1000ml

pH sau thanh trùng : 7.0 0.2Hấp thanh trùng ở 1210C/15 phút4.3.Môi trường Sabouraund

Coliform và Feacal coliform (coliform phân) là nhóm vi sinh vật dùng

để chi thi khả năng có sư hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh trong thựcphẩm Nhóm coliform gồm những vi sinh vật hiếu khi và ki khi tùy ý, gram -, không bào tư , hình que, lên men đường lactose và sinh hơi trong môitrường lỏng, dựa vào nhiệt dộ tăng trưởng, nhóm này được chia thành 2nhóm nhỏ là coliform và coliform phân có nguồn gốc tư phân các loài độngvật Trên thực tế kiểm nghiệm coliform phân được quan tâm nhiều hơncoliform Coliform phân có nguồn gốc tư ruột người và các động vật máunóng bao gồm các giống escherichia, kebsiella, enterobater Khi coliformphân hiện diện ơ một số lượng lớn trong mẫu thi mẫu có khả năng chứa các

vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong phân.Chỉ tiêu tổng coliform không thíchhợp để làm chỉ tiêu chỉ thị cho việc nhiễm bẩn nguồn nước bởi phân Tuynhiên việc xác định số lượng Feacal coliform có thể sai lệch do có một số visinh vật (không có nguồn gốc từ phân) có thể phát triển ở nhiệt độ 44oC Do

đó số lượng E coli được coi là một chỉ tiêu thích hợp nhất cho việc quản lýnguồn nước

Trong các thành viên nhóm coliform phân thi E.coli là loài được quantâm nhiều về vệ sinh an toàn thực phẩm

Loài vi sinh vật này phân bố ơ mọi nơi, có trong ruột người và cácđộng vật máu nóng.

*một số hình ảnh về coliform:

Fecal Coliform

375 x 294

Chromocult® Coliform Agar ES

297 x 300

2.Ý nghĩa của việc kiểm tra chỉ tiêu

Coliform được xem là nhóm vi sinh vật chi thị Số lượng hiện diệncủa chúng trong thực phẩm, nước được dùng để chi thi cho khả năng hiệndiện của các vi sinh vật gây bệnh khác Số lượng coliforms cao thi khả nănghiện diện của vi sinh vật gây bệnh khác cao

Colifrorm chịu nhiệt( coliform phân):

Là thành phần trong hệ vi sinh vật đường ruột ơ người và cácđộng vật máu nóng

Được xem là vi sinh vật chi thi mức độ vệ sinh trong quá trìnhchế biến, bảo quản , vận chuyển thực phẩm, nước uống cũng như chithi sư ô nhiễm phân trong môi trường

Lên men đường lactose trong môi trường E.C ơ 44.5oC

Có khả năng sinh indol 24h/44.5oC

Kết quả sinh hóa nghiệm pháp imvic là + +

-3.Quy trình kiểm tra

Phương pháp MPN :

Nguyên tắc:

Mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân , 2 nồng độ kế tiếpnhau khác nhau 10 lần Mẫu được ủ trong môi trường thích hợp có ốngdurham Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại 3 ống Theo dõi sư sinh hơitrong từng ống nghiệm Xác định ống dương tính ơ mỗi nồng độ pha loãng

và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiệndiện trong 1g hoặc 1ml mẫu ban đầu

Sơ đồ quy trình kiểm tra :

1ml(10 -1 )+ 9ml nước 1ml(10 -2 )+ 9ml nước vô trùng nước vô trùng

Bước 2:

Pha loãng mẫu để giảm số lượng vi sinh vật có trong mẫu ban dầu.Lấy 1ml mẫu ơ nồng độ 10-1 cho vào ống nghiệm thư nhất, sau đó cho 9mlnước vô trùng Ta được ống nghiệm có nồng độ 10-2 Sau đó lấy 1ml mẫu ơnồng 10-2 cho vào ống nghiệm thư hai + 9ml nước vô trùng thu được ốngnghiệm có nồng độ 10-3 tương tư như trên ta thu được các ống nghiệm cónồng độ 10-4, 10-5…

Bước 3:

Nuôi cấy dịch mẫu trong môi trường Laury Tryptose (LT) ơ 3 nồng

độ liên tiếp(10-1,10-2,10-3) như sau : Mỗi nồng độ lấy 3 ống nghiệm Cho vàomỗi ống nghiệm 1 ống durham, cho môi trường LT vào 9 ống nghiệm saocho ngập ống durham Ghi 3 nồng độ liên tiếp bên ngoài ống nghiệm(mỗinồng độ 3 ống nghiệm) Tiếp đến cho 1ml dung dịch mẫu ơ nồng độ 10-1

vào 3 ống nghiệm có ghi nồng độ 10-1(chứa môi trường LT),tương tư chocác ống nghiệm ơ những nồng độ tiếp theo (hình 1.1) ủ ơ 37oC/24h

Những lưu ý khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường LauryTrytose (LT):

-Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn.

- Nhớ lắc mẫu trước khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên môi trườngLaury Trytose

- Không lắc những ống có ống durham

Bước 4:

Đọc kết quả các ống Laury Tryptose Có 3 trường hợp xảy ra:

+ ống durham không thay đổi

+ ống durham nổi lên trên

+ ống durham sinh hơi

Đọc kết quả các ống LT dương tính, sau đó cấy chuyền các ống LTdương tính này vào các ống môi trường BGBL 2% bằng cách lấy que cấyvòng nhúng vào môi trường LT dương tính ơ trên,rồi cho vào ống có môitrường BGBL Ghi nồng độ trên sản phẩm U 37oC /24h.

Ống LT + : môi trường đục và ống durham ( ống chuông) nổi hoặc cóbọt khi trong ống chuông (thể tích bọt khi trong ống chuông =1/10 thể tíchống chuông)

Ống LT - : không có hiện tượng gi xảy ra

+ ống BGBL âm tính: không có hiện tượng gi xảy ra

Bước 6:

Tính kết quả:

Tổng số coliform (cfu/g hoặc cfu/ml)= số MPN 10n

n là số nguyên dương của nồng độ pha loãng đầu tiên được nuôi cấy

Mật bò ( bile) và brilliant green ức chế hầu hết các vi khuẩn gram + và

vi khuẩn gram – không phải coliform Brilliant green có nồng độ đặc hiệunhằm ngăn vi khuẩn ki khi lên men lactose sinh trưởng ơ 440C , Tránh đượchiện tượng dương giả, lúc này coliform phát triển làm đục môi trường vàsinh khi trong ống durham do lên men lactose

5.Các thiết bị ,dụng cụ sử cho thí nghiệm

Bình erlen, đèn cồn, que cấy vòng, ống nghiệm ,nồi autoclave, tủ sấy,ống durham , micropipet, mẫu là tương ơt

BÀI 3: KIỂM TRA TỔNG SỐ E.COLI

Escherichia coli là dạng coliform có nguồn gốc từ phân, phát triển

được ở 44ºC, sinh indol (phản ứng ind+), sinh acid (phản ứng MR+),không sinh aceton (phản ứng V.P-) và không sử dụng citrate làm nguồncacbon (phản ứng cit-).Là trực khuẩn gram-, có khả năng gây bệnh tiêuchảy và sinh nội độc tố.Được coi là vi sinh vật chỉ thị cho sự nhiễm phân

và chất lượng vệ sinh thực phẩm

Các chủng E.coli có khả năng gây bệnh ở người :

- Các chủng truyền thống gây tiêu chảy ở trẻ sơ sinh và trẻ em

- Các chủng yếm khí không bắt buộc gây tiêu chảy không thường xuyên

có quan hệ gần gũi với hệ vi sinh vật bình thường ở đường ruột

- Các chủng sinh độc tố bền hoặc không bền với nhiệt hoặc cả hai

- Các chủng gây lây nhiễm đường ruột

1.Mục đích thí nghiệm: Xác định E.coli trong mẫu thực phẩm.

Ở đây, nhóm tiến hành kiểm tra tổng số E.coli trên mẫu tương ớt.

2 Nguyên tắc: mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân, hai nồng độ

kế tiếp nhau khác nhau 10 lần Mẫu được ủ trong môi trường thích hợp cóống durham Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại 3-5 ống Theo dõi sự sinhhơi trong từng ống nghiệm Xác định các ống dương tính ở mỗi nồng độ phaloãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứnghiện diện trong 1g hoặc 1ml mẫu ban đầu

- Các bình chứa mẫu vô khuẩn

- Các lọ phục vụ cho mực đích pha loãng, có nút đậy

- Mẫu thực phẩm kiểm tra

- Ống durham

3.2.Môi trường và hóa chất:

- Môi trường E.C broth

- Môi trường Lauryl tryptose( LT)

- Môi trường endo agar

- Môi trường E.M.B agar (eosin methylene – blue lactose sucrose agar)

- Môi trường N.A (nutrient agar)

4.Tiến hành thí nghiệm:

Bước 1: Lấy mẫu

Tùy loại vật phẩm cần xác định mà ta lấy mẫu với số lượng và khốilượng khác nhau cho phù hợp Khi lấy mẫu cần đảm bảo :

- Mẫu phải có tính đại diện

- Lượng mẫu vừa phải, đủ để phân tích các đặc tính lý hóa,sinh học

- Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô khuẩn

- Mẫu lấy xong phải phân tích ngay không để quá 24 giờ

- Mẫu phải có nhãn ghi kí hiệu, ghi lại những đặc điểm của mẫu và nơithu mẫu

Lấy 10g tương ớt + 90ml NaCl 0.85%, stomacher thu được nồng độ

10-1

Bước 2: Pha loãng mẫu

Sơ đồ tiến hành pha loãng mẫu lỏng:

Mẫu 90ml NaCl vô trùng 10 -2 10 -3 10 -4

(nước vô trùng) vô trùng vô trùng vô trùng

Sơ đồ tiến hành pha loãng mẫu rắn:

Tiến hành tương tự cho các mẫu pha loãng khác

Những điều lưu ý khi pha loãng mẫu:

- Khi pha loãng mẫu nên dùng nước muối vô trùng nhằm tạo môitrường dinh dưỡng cho vi sinh vật, nếu chỉ dùng nước cất vô trùng

vi sinh vậy sẽ chết khi để lâu bên ngoài mà không có môi trườngdinh dưỡng

- Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn Cácdụng cụ phải được vô trùng

- Khuấy trộn đều dung dịch mẫu trước khi pha loãng để vi sinhvật phân tán đều trong mẫu.

- Tế bào ở các độ pha loãng khác nhau cần được lấy với các pipetkhác nhau nhằm tránh các tế bào ở độ pha loãng trước lẫn với các

tế bào ở độ pha loãng sau

- Nồng độ pha loãng còn phụ thuộc:

Đặc điểm của thực phẩm(thời hạn sử dụng, điều kiện bảoquản, quy trình chế biến )

Người kiểm phẩm ( kinh nghiệm, thao tác )

Bước 3 : Nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường Laury Trytose ( LT)

Tiến hành nuôi cấy dịch mẫu trong môi trường Laury Trytose ở 3 nồng độliên tiếp, 3 ống/ nồng độ, 1ml dịch pha loãng/ ống LT Ủ 37ºC/24h

Môi trường Laury Trytose( LT)

24h

quả

Rồi để yên cho thạch đông lại, đem đĩa ủ trong tủ ấm Ủ ở 37oC trong

Sau khoảng thời gian trên lấy đĩa đã ủ ra và đếm khuẩn lạc, tính kết

Những lưu ý khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường LauryTrytose (LT):

- Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn

- Nhớ lắc mẫu trước khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên môi trườngLaury Trytose

- Không lắc những ống có ống durham

Bước 4 : Đọc kết quả các ống Laury Tryptose dương tính( +), cấy chuyền

các ống LT(+) vào các ống môi trường E.C Ủ 44ºC/24h

E.coli phát triển ở 44ºC,ở nhiệt độ này một số vi khuẩn khác đã bịhạn chế khả năng sinh trưởng Hơn nữa môi trường E.C muối mật ức chế cá

vi khuẩn Gr + và các vi khuẩn không thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột

Ống LT + : môi trường đục và ống durham ( ống chuông) nổi hoặc cóbọt khi trong ống chuông (thể tích bọt khi trong ống chuông =1/10 thể tíchống chuông)

Ống LT - : không có hiện tượng gi xảy ra

Từ các ống E.C (+), cấy phân lập trên môi trường endo agar và E.M.Bagar Ủ 37ºC/24h

Những lưu ý khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường endo agar

và E.M.B agar:

Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn

Nhớ lắc mẫu trước khi tiến hành phân lập vi khuẩntrên môi trường endo agar và E.M.B agar

Sau khoảng thời gian trên lấy ra đem nhận diện khuẩn lạc điển hình:

- Môi trường endo agar: khuẩn lạc tròn, bóng, có ánh kim loại

- Môi trường E.M.B agar: khuẩn lạc tròn, bóng, có tâm đen, có ánh kim

Bước 5 : Từ các khuẩn lạc nghi ngờ, cấy truyền sang môi trường N.A Ủ

có khả năng sử dụng simon citrat

Kết quả :

+ + - - : E.coli type I

- + - - : E.coli type II

BÀI:4 KIỂM TRA VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS

1 Đặc điểm của Stapylococcus aureus:

1.1 lịch sử:

Staphylococcus được Ogston phát hiện năm 1881 trong vết thương có

mủ.Năm 1884, Rosenbach tiếp tục nghiên cứu

1.2 Phân bố:

Được phân bố rộng rãi, có nhiều trong sản phẩm động vật nhưthịt, sữa…

Ở người thường có trên da, tóc, khoang mũi

Bị lây nhiễm từ người chế biến, động vật bị nhiễm bệnh

Được xếp vào nhóm vi khuẩn cơ hội(opportunist type) vì sự cómặt rộng rãi và thường xuyên trong mô và chờ đợi điều kiện thuậnlợi để xâm nhập

1.3 Hình dạng tế bào:

Là vk gram+, hình cầu không bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ ý

Trong vết thương và máu thường thấy hình dạng giống chùm nho

1.4 Đặc điểm và điều kiện sinh trưởng:

Phát triển tốt ở các môi trường tổng hợp, đặc biệt phát triển tốt ở môitrường thạch máu hoặc huyết thanh

Nhiệt độ tối thích là 37oC , pHop=7.2

Trên môi trường thạch ,khuẩn lạc có dạng tròn trơn bóng,đục vun mờ

Ở môi trường lỏng, tế bào ở dạng cặn, vòng nhẫn mờ trong ống nghiệm ở bềmặt môi trường

1.5 Đặc điểm sinh hoá:

Lên men đường glucose, lactose, maltose, saccharose, glycerol,manitol

Không lên men salicin, raffinose,inulin

Có khả năng chịu mặn cao

Làm đông tụ sữa

Sinh beta hemolysis trong môi trường thạch máu

Phản ứng indol-,NH3-, thuy phân gelantine, đông huyết tương

1.6 Khả năng gây bệnh:

Gây ngộ độc thực phẩm:

Bệnh gây ra do vi khuẩn tiết độc tố vào thực phẩm, người ăn thựcphẩm đó và bị ngộ độc Không cần có sự hiện diện của vi khuẩn còn sốngtrong thực phẩm mà chỉ cần có độc tố của chúng Loại này thường có tínhchất cục bộ, ít có khả năng truyền nhiễm

Khi xét nghiệm phân người bệnh bị ngộ độc thực phẩm không thấy cóvsv gây bệnh

Sinh ngoại độc tố(vi khuẩn tiết độc tố vào thực phẩm, người ăn thựcphẩm đó bị ngộ độc)

Bản chất của ngoại độc tố là protein nên chúng kém chịu nhiệt (trừ

độc tố của Staphylococcus aureus) và kích thích cơ thể sinh ra kháng thể đặc

hiệu(tính kháng nguyên mạnh) do vậy có thể phát hiện được bằng phản ứngkháng nguyên – kháng thể

Độc tố gây viêm dạ dày, viêm ruột Type A và D gây ngộ độc thựcphẩm cho người

Triệu chứng bệnh:

Khi ăn phải thực phẩm có chứa các độc tố này, sau 30’- 6h (phụ thuộcvào cá thể người bệnh) từ lúc ăn người bị ngộ độc có triệu chứng đau thắtbụng, tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ 6 – 8h, kiệt sức ở mức nghiêm trọng,đau đầu toát mồ hôi, bủn rủn tay chân.Sự phục hồi xảy ra sau 24 – 72 h, nạnnhân không chết nhưng rất đau đớn do các phản ứng cực kỳ dữ dội

Ít thấy vi khuẩn trong phân người bị ngộ độc

Là độc tố bền nhiệt, biện pháp nấu nướng không làm bất hoạt độc tốnày 100oC/30’; 137oC/9’độc tố này vẫn còn hoạt lực

Các loại thực phẩm có chứa nhiều muối như Jambon, kem tổng hợp,nước súp (ít khi được sử lý ở nhiệt độ >40oC) và các loại thuy sản, thựcphẩm đóng hộp thường hay nhiễm loại vsv này