TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHOA NGOẠI NGỮ- SƯ PHẠM BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN VI SINH ĐẠI CƯỚNG Thành viên nhóm: (lớp DH14SP,nhóm C5-S7) Trần Hoàng Nam Nguyễn Thị Thanh Vân Phạm Thị Huỳnh Như Nguyễn Mạch Trúc Vy 14132048 14132107 14132205 14132265 BÀI 1 Phương pháp khử trùng A.Mục đích: Làm chết hoàn toàn mầm mống vi sinh vật, kể vi sinh vật có bào tử Đây khâu quan trọng Khi nghiên cứu vi sinh vật, cần thiết phải khử trùng môi trường, dụng cụ, thiết bị để tránh phát triển lẫn lộn hệ vi sinh vật ngoại lai vào giống vi sinh vật nghiên cứu B.Các phương pháp khử trùng: • • • Phương pháp vật lí: o Nhiệt khô: Tủ sấy ( 1800C/30phút, hay 1600C/ giờ) ; đèn cồn o Nhiệt ướt: Nồi hấp Autoclave ( 1210C/15-20p atm) Phương pháp hóa học: cồn (70), javel, chlorin Màng lọc Môi trường dinh dưỡng A.Nguyên tắc: Tùy theo mục đích khảo cứu mà ta điều chế loại môi trường cho hợp lí B.Một số loại môi trường dinh dưỡng phổ biến: • • • • • Môi trường phân lập: loại môi trường chọn lọc dạng đặc dùng để tách rời khuẩn lạc đơn dòng nhằm thu dòng Môi trường tăng sinh: môi trường tăng sinh chọn lọc, có khả ức chế ngăn chặn phát triển nhóm vi sinh vật, đồng thời cho phép phát triển nhóm khác quần thể vi sinh vật nuôi cấy Môi trường đếm tế bào Môi trường thử phản ứng sinh hóa:dùng để xác định vài tính chất sinh hóa dòng vi khuẩn phân lập Môi trường bán lỏng: dùng để khảo sát tính di động vi khuẩn Phân lập giống khiết A.Mục đích: Để nghiên cứu hình thái, tính chất sinh lí, sinh hoá vi sinh vật B.Các phương pháp phân lập giống khiết Cách 1: Lấy mẫu bệnh-> nghiền thành dịch-> đem tran Cách 2: Chia đáy hộp Petri làm phần -> khử trùng que cấy -> cấy ria từ phần sang phần 2, xoay hộp thach 900,cấy ria từ phần sang phần 3, xoay hộp thạch 900, cấy ria từ phần sang phần Khi cấy xong ủ nhiệt độ 370C, đặt ngược hộp thạch đáy lên trên, nắp Phương pháp cấy chuyền vi sinh vật A.Mục đích: • • Bảo tồn vi khuẩn nuôi tinh khiết Li trích vi khuẩn có nước, mẫu đất, mẫu thực phẩm, mẫu bệnh lí B.Phương pháp cấy: • • • • • Lau bàn rửa tay, khử trùng cồn Tay phải cầm que cấy (như cầm bút), khử trùng que cấy phần cán (phần đưa vào ống nghiệm) Tay trái cầm ống nghiệm có chứa vi khuẩn xuôi theo lòng ống bàn tay, tay phải lấy ngón út kẹp nút lôi ra, khử trùng miệng ống nghiệm Cho dây cấy khử trùng ( nguội) vào nơi có vi khuẩn, khử trùng miệng ống nghiệm đậy nút lại Thực phương pháp cấy qua môi trường mới, cấy xong khử trùng lại que cấy trước bỏ xuống giá ống nghiệm BÀI Cách sử dụng kính hiển vi A.Cách điều chỉnh ánh sáng • Mục đích: Làm cho tiêu chiếu sáng thích hợp *Lưu ý: o Khi quan sát kính hiển vi để có ánh sáng thích hợp ta chỉnh nút ánh sáng có kính B.Cách chỉnh thấy rõ ảnh: Bước 1: Dùng ốc chỉnh nhanh đưa ống kính lên cao, xoay vật kính định dùng vào trục Bước 2: Đặt tiêu lên bàn kính kẹp chặt lại Điều chỉnh vùng định xem vào Nhỏ dầu lên tiêu bản( để tránh tượng ánh sáng qua lăng kính bị khúc xạ,tán sắc tập trung nhiều ánh sáng rọi vào kính để làm rõ vật Bước 3: Mắt không nhìn vào thị kính mà nghiêng đầu bên nhìn vào vật kính, xoay ốc điều chỉnh nhanh để hạ vật kính 100x xuống, đưa gần sát tiêu bản( 0.12mm) , động tác phải tiến hành từ từ, cẩn thận để khỏi vỡ tiêu vỡ vật kính Bước 4: Mắt nhìn vào thị kính, dùng ốc điều chỉnh nhanh từ từ đưa vật kính lên thấy ảnh vật dừng lại dùng ốc vi cấp điều chỉnh cho ảnh rõ Bước 5: Khi quan sát ảnh vật tay điều chỉnh ốc vi cấp, tay xê dịch tiêu để chọn vùng quan sát rõ *Lưu ý: o o Khi quan sát tuyết đối không dùng ốc thứ cấp để chỉnh Khi quan sát kính hiển vi nên tập cho quen nhìn mắt C Cách giữ gìn kính hiển vi: • • • • Giữ kính hệ thống quang học luôn Không đụng vào mặt kính Khi không dùng kính nữa, đừng để phiến kính bàn kính, tắt đèn giảm độ sáng đèn xuống thấp Luôn lau dầu ( sử dụng nhỏ tiêu bản) sau sử dụng xong vật kính nhúng dầu Nếu dầu trở nên khô cứng, ta phải tẩy chúng giấy có tẩm xylen ( • • • • • cồn) ,sau lau giấy khô Cẩn thận: nhiều xylen làm bong lớp keo gắn thấu kính Cẩn thận sử dụng kính Khi cầm kính hiển vi tay nắm chặt thân kính tay đỡ chân kính Khi mắt nhìn vào thị kính, không hạ xuống để tránh trường hợp bể lam kính làm hỏng vật kính Khi sử dụng phải đặt kính chỗ thăng Khi không dùng kính hiển vi nữa, phải đậy kính lại cất vào hộp đựng kính có đặt chất chống ẩm Phương pháp thử phản ứng sinh hóa A.Phản ứng simmon citrat • • Nguyên tắc: Một số vi khuẩn có khả citra nguồn gốc cacbon môi trường tổng hợp vô Khi citrat bị biến dưỡng đến giai đoạn cuối CO2 có cân ion môi trường bị kiềm hóa, chuyển từ màu xanh biến sang mau xanh dương đậm Môi trường: Môi trường thạch Simmons citrat( dạng đông khô) điều chế theo thể thạch nghiêng Thành phần môi trường chứa thị màu xanh bromtymol • Kết quả: (Sau ủ 370C 48h ) o Kết dương (+) : vi khuẩn mọc mặt thạch nghiêng với đổi sang màu xanh dương hoàn toàn, chút hay không o Kết âm (-): vi khuẩn không mọc thạch không đổi màu môi trường B.Phản ứng môi trường KIA • Nguyên tắc: phản ứng dùng để phân biệt loại vi trùng thuộc họ Enterobacreiaceae Môi trường KIA thường dùng để khả sát lên men đường glucose, lactose, khả sinh khí H2S, khí H2, CO2 vi khuẩn môi trường có thị màu phenol red dùng để phát khả lên men đường vi khuẩn Đây môi trường đặc, chuẩn bị ống nghiệm thể nghiêng sâu • Kết quả: o Phần sâu phần nghiêng giữ màu đỏ: lactose âm (Lac ( K)), Glucose âm( Glu-( K)), kí hiệu (K/K) + o Phần sâu bị acid hóa đổi màu vàng, phần nghiêng giữ màu đỏ: Lac ( K), Glu ( A), kí hiệu: K/A + + o Phần nghiêng sâu đổi màu vàng: Lac ( A), Glu ( A), kí hiệu: A/A o Có khả sinh khí, nứt thạch o Khi có màu đen xuất vùng nối hai phần nghiêng sâu: vi khuẩn có khả khử sulphat có môi trường, tạo thành khí H2S *Ghi chú: K (kiềm) ; A(acid); Glu+ (lên men Glucose) ;Lac+ (lên men Lactose) Glu- ( không lên men); Lac-( không lên men) C.Phản ứng Indol • Nguyên tắc: số vi khuẩn có khả thủy giải tryptophan môi trường thành indol Nhân pyrol indol kết hợp với p-dimetylamino benzaldehyt thuốc thử Kovacs tạo thành phức chất dạng quinon màu đỏ tía măt thoáng môi trường • Kết quả: sau ủ 370C 48h, nhỏ 3-5 giọt thuốc thử Kovacs vào o Phản ứng Indol dương (+): vòng màu đỏ sẫm xuất bề mặt môi trường o Phản ứng Indol âm: bề mặt môi trường giữ nguyên màu vàng thuốc thử Kết thí nghiệm nhóm, sau cấy vi sinh vật, ủ 370C 48h Phản ứng sinh hóa Phản ứng simmon Citrate Phản ứng môi trường KIA Tên vi khuẩn Bacillus (+) Glu-, Lac- , Sinh H2S (+) , Nứt thạch (-) (-) Streptococus (-) Glu- , Lac- , Sinh H2S (-) Nứt thạch (+) (-) Phản ứng Indol Nhuộm tế bào vi sinh vật quan sát hình thái vi sinh vật Mỗi tế bào vi khuẩn mọc tên trường thạch dinh dưỡng phát triển thành khuẩn lạc có tính đặc trưng cho loài Để định danh phân loại vi khuẩn ta dựa vào: hình dạng, kích thước, màu sắc, bề mặt khuẩn lạc,… A.Cách quan sát nấm mốc: • Phương pháp nhuộm đơn: Bước 1: Phết mẫu Đặt giọt vô trùng lên phiến kính Dùng que cấy lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc môi trường thạch, hòa giọt nươc trải mỏng lên mặt lam, để khô Bước 2: Cố định mẫu Hơ nhẹ phiến kính qua lửa đèn cồn 3-4 lần Bước 3: Nhuộm màu Nhỏ vài giọt thuốc nhuộm đơn xanh metilen 0.1% Rửa nước làm khô Bước 4: Quan sát với vật kính dầu B.Phương pháp nhuộm Gram • Nguyên tắc: o Nhuộm Gram phương pháp quan trọng để phân loại vi khuẩn o Khi nhuộm vi khuẩn với thuốc tím crystal violet dung dịch lugol, sau tẩy màu cồn 95% có trường hợp phản ứng với thuốc nhuộm xảy nhóm vi khuẩn: TH1: Nếu vi khuẩn giữ chặt màu tím vi khuẩn G+ TH2: Nếu vi khuẩn bị màu sau tẩy cồn, nhuộm bổ sung với dung dịch Fuschin vi khuẩn có màu hồng, vi khuẩn G• • Cách nhuộm Gram o Dàn mỏng vi trùng thành vết bôi, để khô không khí o Cố định nhẹ lửa đèn cồn( tránh làm nóng quá) o Nhuộm tiêu crystal violet( tím kết tinh) phút, rửa nước o Nhuộm lugol phút, rửa nước, o Tẩy cồn khoảng 30 giây (nhúng lên xuống 3-4 lần) o Nhuộm bổ sung 10-30s fuschin, rửa nước o Làm khô, soi kính với vật kính dầu Kết thí nghiệm Nấm men: cầu khuẩn E Coli: trực khuẩn, màu hồng G- Bacillus: trực khuẩn, màu xanh tím, G+ Staphilococcus: trực Bài khuẩn,màu xanh tím, G+ Streptococus: cầu khuẩn, màu hồng G- BÀI Đếm tế bào vi sinh vật Mục đích: đánh giá số lượng vi sinh vật thể tích hay trọng lượng mẫu xác định • Có cách đếm tế bào vi sinh vật • Cách 1: đếm trực tiếp phòng đếm hồng cầu ( dùng để đếm nấm men) Cách 2: đếm gián tiếp số lượng vi sinh vật cách đếmkhuẩn lạc mọc môi trường đặc Cách 3: phương pháp pha loãng tới hạn • • Các bước đếm nấm men phòng đếm hồng cầu o Lấy 1g nấm men đem hòa với 99ml nước cất vô trùng ( nước muối sinh lí) bình tam giác o Chuẩn bị ống nghiệm có chứa 9ml nước cất vô trùng( nước muối sinh lí) đặt giá đỡ Đánh dấu ống 1, ống 2, ống o Cách tiến hành thí nghiệm: o Lắc cho mẫu vật tan bình , sau lấy ống hút 1ml mẫu cho vào ống nghiệm o Tại ống nghiệm 1, lắc đầu cho mẫu vật vừa cho vào tan đều, dùng ống hút 1ml mẫu ống nghiệm cho vào ống nghiệm o ống nghiệm làm tương tự lấy ống hút 1ml mẫu cho vào ống o Đặt kính lên lưới đếm o Dùng ống hút vô trùng lấy mẫu từ ống nghiệm 3, cho giọt vào mép kính Đặt phóng đếm lên bàn kính hiển vi để yên 3-5 phút sau tiên hành đếm tế bào ô lớn( gồm ô góc ô trung tâm) Kết thí nghiệm: Số tế bào/ml = = = 6900 (tế bào) Trong đó: A: số tế bào ô lớn b: số ô ô lớn ( 16 ô x = 80 ô con) 103: số chuyển mm3 thành ml ( 1000mm3=1ml) 10+n: độ pha loãng mẫu Cách làm nút Làm nút bông không thấm nước, loại sợi dài • Mục đích: Ngăn ngừa chất từ môi trường nuôi cấy vào miệng tránh nhiễm tạp từ miệng vào môi trường Yêu cầu: Nút gọn, đậy kín ống nghiệm, không làm chặt mà không làm lỏng quá, nút không dư nhiều bên ngoài, mà cầm phần phía bên ngoài,lắc nhẹ ống nghiệm, ống nghiệm không bị rơi Gói dụng cụ Mục đích: Việc xử lí bao gói dụng cụ có liên quan trực tiếp đếnkết thực hành thí nghiệm, để tránh tạp chất, tránh cho dụng cụ bị nhiễm bẩn Yêu cầu: o Bao gói phải đạt tiêu chuẩn khử trùng thuận tiện sử dụng,tránh tượng nứt vỡ hay bị tạp nhiễm sau hấp o Các dụng cụ bao gói phải thật khô, sạch, tránh vỡ hấp đề tên dụng cụ đề ngày đem hấp để tiện theo dõi sử dụng • Cách thực hiện: o Đối với ống nghiệm đựng môi trường có nút cần bọc chặt phía đầu nút lại o Chai lọ được bọc chặt phần nút giấy o Pipet gói phía đầu nhỏ giọt, cuộn giấy dần theo kiểu xoáy trôn ốc hết phía đầu có nút Các pipet gói từ đến vài o Các đĩa Petri gói thành chồng 10 ( phần đầu hướng phần nắp lớn đĩa Petri ngoài) o Các dụng cụ khác tùy theo yêu cầu mà có bao gói cho thích hợp Sử dụng trang thiết bị • Yêu cầu: o Thực nội quy phòng thí nghiệm, quy định mà giáo viên đưa o Sử dụng cách cẩn thận trang thiết bị phòng thí nghiệm o Quan sát số thiết bị máy móc phòng thí nghiệm tủ sấy, nồi hấp biết sử dung thành thạo kính hiển vi, Biết công dụng sử dụng tốt thiết bị phòng thí nghiệm: dụng cụ ngâm đo thủy tinh, giá gỗ, chậu rửa hóa chất, … o Biết rửa dụng cụ sau thực hành thí nghiệm • • •