Báo cáo Thực Hành Vi Sinh Học Đại Cương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BÁO CÁO THỰC HÀNH VI SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG Nhóm: I Sinh viên thực hiện: Giảng viên hướng dẫn: TP.HCM, ngày 25 tháng năm 2020 MỤC LỤC HÌNH ẢNH CỦA BÀI BÁO CÁO BÀI 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG, PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG 1.1 Các thiết bị PTN vi sinh 1.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 1.3 Phương pháp khử trùng BÀI 2: PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ CẤY TRUYỀN VI SINH VẬT 2.1 Phân lập 2.2 Phương pháp cấy truyền .8 2.3 Kết thực hành BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN VÀ QUAN SÁT TẾ BÀO VSV.10 3.1 Quan sát đại thể 10 3.2 Quan sát vi thể 10 BÀI 4: ĐẾM TRỰC TIẾP NẤM MEN BẰNG BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU 13 4.1 Giới thiệu buồng đếm hồng cầu .13 4.2 Quy trình đếm nấm men 13 4.3 Tính kết 13 4.4 Ưu điểm phương pháp đếm trực tiếp tế bào nấm men BĐHC 14 4.5 Nhược điểm pp đếm trực tiếp nấm men BĐHC .14 4.6 Ứng dụng đếm trực tiếp nấm men BĐHC 14 BÀI 5: KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH SINH HĨA CỦA VSV 15 5.1 Mục đích 15 5.2 Yêu cầu thực phản ứng sinh hóa 15 5.3 Một số phản ứng 15 HÌNH ẢNH CỦA BÀI BÁO CÁO Hình 2.3 Kết thực hành Phương pháp phân lập • Nấm men – M6 phân lập đĩa petri môi trường Sab Vi khuẩn Phương pháp cấy truyền • Vi khuẩn – Bacillus cereus cấy truyền ống nghiệm mơi trường TSA (trái) • Nấm men – M6 cấy truyền ống nghiệm môi trường PDA (phải) Hình 3.2 Quan sát vi thể: • Nấm men – M6 quan sát kính hiển vi Hình 5 10 Nấm men BÀI 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG, PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG 1.1 Các thiết bị PTN vi sinh Thiết bị Nồi hấp tiệt trùng Cân Tủ ủ Bếp khuấy từ Kính hiển vi Tủ sấy Máy ly tâm Máy đồng mẫu Mục đích Khử trùng mơi trường dụng cụ Cân hóa chất, mơi trường Ủ, nuôi cấy vi sinh vật nhiệt độ mong muốn.  Nấu môi trường giúp quấy môi trường Quan sát vi sinh vật Sấy khô khử trùng dụng cụ ( thủy tinh, kim loại ) Ở nhiệt độ 160 độ C thời gian tiếng, nhiệt độ 180 độ C thời gian 30 phút Thu sinh khối Đồng mẫu ( chất rắn ) Stomacher 400 Máy đếm khuẩn lạc Đếm khuẩn lạc Tủ lạnh Máy rung ống nghiệm Lò vi sóng 1.2 Bảo quản hợp chất môi trường, vi sinh vật mẫu Dùng đồng chất lỏng ống nghiệm Làm lỏng môi trường Môi trường nuôi cấy VSV 1.2.1 Khái niệm: Mơi trường nơi có điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển, cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng, có nồng độ pH thích hợp 1.2.2 Yêu cầu môi trường dinh dưỡng nuôi cấy VSV Môi trường cần phải đủ lượng đủ chất đảm bảo phát triển vủa vi sinh vật trạng thái tốt 1.2.3 Phân loại 1.2.3.1 Phân loại môi trường theo công dụng Phân lập, cấy truyền… 1.2.3.2 Phân loại môi trường theo thành phần hố học 1.2.3.3 Phân loại mơi trường theo trạng thái vật lý Ảnh hưởng agar tới trạng thái vật lý môi trường: Trạng thái Hàm lượng agar/lit Công dụng môi trường vật lý Đặc Hơi sệt sệt ( bán 15-20 g/l lỏng ) Lỏng 4-5 g/l Phân lập, nhân giống Kiểm tra khả di động vi sinh vật g/l Nhân giống 1.2.4 Công thức môi trường Môi trường P.D.A (Potato Dextrose Agar): dùng để ni cấy men, mốc Thơn có Khoai tây: 200 g Dextrose: 40 g Agar: 20 g H2O: L pH: 4.5 - 121 /15’/ 0.1 Mpa công thức mơi trường: • • • • Tên mơi trường: P.D.A (Potato Dextrose Agar) Công dụng: nuôi cấy men, mốc pH: 4.5 – Chế độ khử trùng: 121 /15’/ 0.1 Mpa • Thành phần hóa học: Khoai tây: 200 g g tin Dextrose: 40 g Agar: 20 g 1.2.5 Các bước để nấu môi trường Chuẩn bị môi trường Bước 1: Cân, đong ( ống đong ) môi trường theo công thức Bước 2: Đun ( cần ), kiểm tra pH Bước 3: Phân phối môi trường vào dụng cụ vô trùng Bước 4: Khử trùng theo yêu cầu 1.3 Phương pháp khử trùng 1.3.1.Khử trùng môi trường  Phương pháp khử trùng môi trường: nhiệt ẩm, lọc, dùng tia U.V  Khử trùng môi trường phương pháp nhiệt ẩm: Phương Nhiệt độ/ thời gian pháp Nhiệt ẩm Nhiệt độ: 121 Nguyên lý khả diệt VSV Dựa vào nước bão hòa Thời gian: khoảng 10-15 phút nhiệt độ cao, áp suất cao 1.3.2 Khử trùng dụng cụ • Dụng cụ thủy tinh: sử dụng nhiệt ẩm ( nồi hấp tiệt trùng ), nhiệt khơ ( tủ sấy ) • Dụng cụ nhựa: sử dụng nhiệt ẩm ( nồi hấp tiệt trùng ) • Khử trùng phòng thí nghiệm: phun độc, đèn UV BÀI PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ CẤY CHUYỀN VSV 2.1 Phân lập 2.1.1.Khái niệm Chuyển từ quần thể qua khuẩn lạc 2.1.2.Mục đích phân lập Tạo dòng 2.1.3.Phương pháp phân lập Phương pháp phân lập vi sinh vật: Lưu ý : Dán nhãn ghi tên giống vi sinh vật, tên môi trường nuôi cấy, ngày cấy vào thành ống nghiệm tên người thực nghiệm đĩa pitre  Với nấm men, vi khuẩn : dùng que cấy vòng Bước 1:Hơ nóng khử trùng que cấy đèn cồn Bước 2: Dùng que cấy lấy vi sinh vật ống môi trường nuôi cấy nấm men vi khuẩn Bước 3: Một tay mở nắp đĩa pêtri vừa đủ que cấy vào ( để kế bên đèn cồn để không bị nhiễm vi sinh vật từ mơi trường ngồi ) Sau lướt que cấy lên mặt thạch theo phương pháp sau: VSV Que cấy Men Que , VK cấy Phương pháp vòng 2.2 Phương pháp cấy chuyền 2.2.1.Khái niệm Truyền vi sinh vật từ môi trường sang môi trường khác 2.2.2.Mục đích Giúp bảo quản, nhân giống khảo sốt sinh hóa 2.2.3 Phương pháp cấy chuyền Phương pháp cấy chuyền VSV: + Lưu ý : Dán nhãn ghi tên giống vi sinh vật, tên môi trường nuôi cấy, ngày cấy vào thành ống nghiệm tên người thực nghiệm đĩa pitre Bước 1:Hơ nóng khử trùng que cấy đèn cồn Bước 2: Dùng que cấy lấy vi sinh vật ống môi trường nuôi cấy nấm men vi khuẩn Bước 3: Tay khác lấy ống môi trường để nuôi cấy hơ qua ống đèn cồn để khử trùng (để kế bên đèn cồn để không bị nhiễm vi sinh vật từ môi trường ngồi ) Sau đưa que cấy chứa vi sinh vật vô môi trường theo phương pháp sau: VSV Môi trường Que cấy Q Kế ue t 2.3 Lỏng Phương pháp cấy Thạch nghiêng vò ng Men, VK Q Thạch nghiêng sâu ue cấy Thạch đứng thẳ ng Q ue Thạch nghiêng Mốc cấy mó c thực hành Hình trang ( HÌNH CHUNG ) Hình ảnh kết của:  Phương pháp phân lập nấm men – M6 môi trường SAD đĩa petri  Phương pháp cấy truyền nấm men – M6 môi trường PAD ống nghiệm thạch nghiêng  Phương pháp cấy truyền vi khuẩn – Bacillus cereus môi trường TSA ống nghiệm thạch nghiêng BÀI PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN VÀ QUAN SÁT TẾ BÀO VSV 3.1 Quan sát đại thể • Quan sát khuẩn lạc mắt để thấy đặc điểm khuẩn lạc màu sắc, • hình dạng, đường kính, độ vun, bóng, nhăn, có sợi Việc quan sát đại thể khuẩn lạc điển hình mơi trường phân lập chọn lọc giúp • dự đốn VSV Mô tả khuẩn lạc cuả VSV phân lập Bài 2: Khuẩn lạc nấm men - M6, mơi trường Sab Hình dạng: tròn Bờ, mép khuẩn lạc: bóng Đường kính: Màu sắc: trắng đục 3.2 Quan sát vi thể Làm tiêu quan sát tiêu kính hiển vi (KHV) để thấy được: Hình dạng, cách xếp, kích thước tế bào Ví dụ: Hình ảnh quan sát nấm men - M6: Hình trang ( hình chung ) 3.2.1 Làm tiêu nấm mốc (phương pháp giọt ép) 3.2.2 Làm tiêu phương pháp nhuộm đơn 3.2.3 Làm tiêu phương pháp nhuộm kép Bước 1: Ghi tên VSV Làm vết bôi Bước 2: Cố định vết bôi: hơ lửa đèn cồn đến vết bôi khô Mục đích cố định vết bơi: + Giết chết VSV + Giúp VSV dễ bắt màu thuốc nhuộm + Gắn chặt VSV lame + Giúp VSV không bị trôi rửa nước Bước 3: Nhuộm màu Nhỏ thuốc nhuộm Gentiant Violet (Crystal violet) Để phút Rửa nước Nhỏ Lugol Để phút Rửa nước Tấy cồn Rửa nước Nhỏ thuốc nhuộm Fuschin (hoặc Safranin) Để 30 giây Rửa nước 10 Bước 4: Quan sát KHV vật kính 100 (vật kính dầu) Vẽ hình quan sát Miêu tả hình dạng tế bào, cách xếp tế bào, tế bào bắt màu thuôc nhuộm 11 Bài tập nhà: So sánh phương pháp nhuộm đơn nhuộm kép Nhuộm đơn Giống Quy trình Nhuộm kép Đều phải cố định vết bôi nhuộm để quan sát tiêu kính hiển vi Chỉ cần nhuộm màu lần (sử Phải nhuộm màu lần Đầu tiên nhỏ dụng loại thuốc thuốc nhuộm Gentiant Violet nhuộm sau: Gentiant violet, (Crystal violet) Sau nhỏ Lugol Fuschin, Xanh metylen, Xanh Nhuộm them lần thuốc coton) nhuộm Fuschin (hoặc Safranin) Khác Giúp phân biệt hai nhóm vi Mục khuẩn (gram dương gram đích âm) dựa khác đặc điểm thành tế bào Giúp ta quan sát phân biệt cấu trúc tế bào dễ dàng so với việc nhuộm đơn 3.2.2.1 Tại phải nhỏ dầu xem kính lên tiêu quan sát KHV vật kính 100? Vì dầu soi kính hiển vi dầu suốt, có số khúc xạ cao, nên hỗ trợ làm tăng độ phân giải hình ảnh, cho chất lượng hình ảnh quan sát rõ nét 3.2.2.2 Giải thích chế bắt màu tím VK Gram + màu hồng VK Gram- ? Vi khuẩn Gram dương Gram âm có cấu tạo vách tế bào khác nhau, thực nhuộm chúng bắt màu thuốc nhuộm khác + Vi khuẩn Gram (+): có màu tím + Vi khuẩn Gram (-): có màu hồng - Với vi khuẩn Gram dương: chúng có lớp vách tế bào peptidoglycan dày, dạng lưới có khả bắt màu tím thuốc nhuộm tím gentian tinh thể Cũng lớp vách dày nên việc tẩy cồn khó khăn vi khuẩn giữ màu tím thuốc nhuộm tím Gentian - Với vi khuẩn Gram âm: lớp vách peptidoglycan mỏng có thêm lớp màng lipopolysaccharide phía ngồi, tẩy cồn cồn hòa tan lớp màng lớp vách mỏng bị cồn tẩy dễ dàng nên khơng giữ màu tím thuốc nhuộm mà bắt màu thuốc nhuộm sau dung dịch Fushin kiềm BÀI ĐẾM TRỰC TIẾP NẤM MEN BẰNG BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU 4.1 Giới thiệu buồng đếm hồng cầu Buồng đếm hồng cầu phiến kính thuỷ tinh hình chữ nhật, có khắc lưới đếm Lưới đếm hình vng, có cạnh 1mm gồm 25 vng lớn, vng lớn có 16 vng nhỏ; ô vuông lớn chia cắt đường kẻ song song, chiều cao đường khắc lưới đếm 0,1 mm S lưới đếm = S ô vuông nhỏ = 1/ 400 S ô vuông lớn = 1/25 V ô vuông nhỏ = 1/ 4000 4.2 Quy trình đếm nấm men Bước Pha lỗng dịch mẫu Bước Đưa dịch mẫu vào lưới đếm Bước Đếm tế bào nấm men Quan sát lưới đếm vật kính 10, chuyển qua vật kính 40 để đếm tế bào ô vuông lớn theo vị trí đường chéo góc Ghi lại kết Cách đếm: Đếm tất tế bào ô vuông lớn tế bào nằm cạnh liên tiếp 4.3 Tính kết A: Tổng tế bào đếm ô vuông lớn V: thể tích ô vuông nhỏ 10–n: nồng độ pha loãng đếm 1000: hệ số chuyển mm3 thành mL Số tế bào ô vuông lớn: Ô 1: 10 Ô 2: 18 Ô 3: 19 Ô 4: 26 Tổng: A = 87 tế bào Kết quả: Số tế bào /ml = = = = 435000 4.4 Ưu điểm pp đếm trực tiếp tế bào nấm men BĐHC Đếm dễ dàng, nhanh, tiết kiệm thời gian 4.5 Nhược điểm phương pháp đếm trực tiếp nấm men BĐHC Tỉ lệ sai số cao: 10% 4.6 Ứng dụng đếm trực tiếp nấm men BĐHC Dùng để đếm tế bào hồng cầu máu, nấm men vẽ đường cong sinh trưởng BÀI KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH SINH HỐ CỦA VSV 5.1 Mục đích Góp phần định danh VK 5.2 u cầu thực phản ứng sinh hoá Yêu cầu VSV: • Còn non (nếu già vsv chuyển hóa chậm) • Dòng thuần, khơng bị tạp nhiễm • Đọc kết thời gian quy định ( thời gian đọc kết quả: sau 24 – nuôi cấy) 5.3 Một số phản ứng Đối với vi khuẩn E.coli Một số phản ứng sinh hoá bản: Phản Mục ứng đích CIT Kiểm tra vi (số 6) khuẩn có Simmon sử dụng citrate citrate nguồn carbohydra te môi trường chất vô tổng hợp Môi trường Cách thực -Tên: Simmons citrate Cấy vi agar sinh vật -pH:6.9+/- 0.2, 25 vào ống -Chỉ thị màu: nghiệm Bromothymol Blue (môi -Đặc điểm đổi màu: trường +ph7 (kiềm):xanh theo dương đường zich -Thành phần tỷ lệ zag Sau Nguyên lý Đọc kết Khi vi khuẩn sử dụng Dương citrate, muối tính ammonium chuyển Dung dịch thành ammoniac, màu xanh tăng tính kiềm biển, cho Sự chuyển đổi pH thấy vi (pH>7.6) dẫn tới sinh vật chuyển chất thị sử Bromthymol dụng blue chuyển từ xanh citrate thành xanh da trời ESC (số 7) hay không chất quan trọng: + Sodium Citrate (dehydrate) – nguồn carbohydrate :2g +Bromothymol Blue: 0,08g Giúp phân -Tên môi trường: Kligler biệt Iron Agar (KIA) loài - pH : 7.4 +/- 0.2 25ºC bacillus -Chỉ thị màu: Phenol đường Red ruột -Đặc điểm đổi màu: +pH=7.4 (kiềm): màu đỏ +pH7(kiềm): màu đỏ -Thành phần tỷ lệ chất quan trọng: +Dextrose: 5g Cấy vi sinh vật vào môi trường Sau ủ 24 37 Xác định khả sử dụng Sodium malonate nguồn carbon cùa vi sinh vật kết tạo môi trường -Tên môi trường: Malonate broth -pH: 6.7 ± 0.2, 25 ° C -Chỉ thị màu: Bromthymol blue – chất thị pH -Đặc điểm đổi màu: +pH 6.7 (axit): màu xanh +pH>7 (kiềm): màu xanh dương -Thành phần tỷ lệ chất quan trọng: Cấy vi sinh vật vào mơi trường Sau ủ 24 37 xuất vòng thấy xuất đỏ chứng tỏ vi sinh vòng vật E.coli tròn đỏ cho thấy vi sinh vật E.coli Vi sinh vật lên men Âm tính glucose sau Dung dich chuyển hoá axit màu vàng pyruvic để tạo thành cam acetyl-methyl bề mặt carbinol (acetoin) môi Sau ta cho trường naphtol, cho thêm (như màu KOH 40% thuốc acetion chuyển thành thử), cho diacetyl (do KOH) thấy vi sau chuyển sinh vật thành phức hợp E.coli màu đỏ (do naphtol) Escherichia coli (âm tính), Klebsiella– Enterobacter (dương tính) Malonate phá vỡ tạm Âm tính thời chu trình Krebs Dung dịch khiến vi sinh vật màu xanh không phát triển cho trừ vi sinh thấy vi vật phải sử dụng sinh vật malonate nguồn không sử carbon để phát triển dụng malonate kiềm + Natri malonate nguồn carbon nhất: 3g + Bromo thymol màu xanh: 0,025g ... 5.2 Yêu cầu thực phản ứng sinh hóa 15 5.3 Một số phản ứng 15 HÌNH ẢNH CỦA BÀI BÁO CÁO Hình 2.3 Kết thực hành Phương pháp phân lập • Nấm men – M6 phân lập đĩa petri môi trường Sab