Báo cáo thực tập vi sinh vật đại cương

Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C BÀI 1:QUY TRÌNH KIỂM TRA TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ 1.Định nghĩa: Vi sinh vật hiếu khí vi sinh vật tăng trưởng hình thành điều kiện có oxy phân tử 2.Ý nghĩa việc kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí: Tổng số vi sinh vật hiếu khí diện mẫu thị mức độ vệ sinh thực phẩm,đánh giá chất lượng mẫu vi sinh vật,nguy hư hỏng ,thời hạn bảo quản sản phẩm,mức độ vệ sinh trình chế biến bảo quản thực phẩm Sự tăng trưởng vi sinh vật thực phẩm dẫn đến biến đổi chất lượng : 106 tế bào/g(ml) ranh giới để phân biệt thực phẩm có dấu hiệu hư hỏng hay không.Một vài trường hợp vsv=106 tế bào/g(ml) chưa có dấu hiệu hư hỏng rõ ràng mặt hóa học.Đặc biệt sữa có 105 tế bào/g(ml) sữa bị chua: 106-107tế bào/g(ml) sữa có mùi hơi;108 tế bào/g(ml) tất thực phẩm có mùi khơng chấp nhận được;109-1010tế bào/g(ml) thực phẩm thay đổi cấu trúc 3.Quy trình kiểm tra: Trang Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C 1ml(10-1)+ 9ml nước 1ml(10-1)+ 9ml nước nước vô trung ̀ Stomacher 10gr thực phâm ̉ nước vô trung ̀ 10-2 10-3 + 90ml NaCl 0.85% (10-1) Bước 1: đồng mẫu Cho 10 g thực phẩm vào 90 ml NaCl 0.85% vô trùng(hoặc H20 vô trùng )vào bao PE vô trùng.Tiến hành đồng máy stomacher 30” thu nồng độ 10-1 Bước : pha lỗng mẫu Chuẩn bị ống nghiệm pipet vơ trùng.Dùng pipet 10ml vô trùng lấy ml NaCl vô trùng vào ống nghiệm Dùng micropipet 1ml vô trùng lấy 1ml từ nồng độ 10-1 đưa vào ống nghiệm thứ Tiến hành rung lắc ống nghiệm máy rung ống nghiệm votex, thu nồng độ 10-2 Làm tương tự với nồng độ Lưu ý pha loãng mẫu: Trang Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C -Nồng độ pha lỗng phụ thuộc vào tình trạng vệ sinh thực phẩm,thời gian bảo quản, điều kiện bảo quản,kinh nghiệm người kiểm nghiệm… -Tiến hành thao tác bên lửa đèn cồn.Các ống nghiệm,pipet phải vô trùng.Sử dụng micropipet 1ml/ nồng độ pha loãng mẫu để tránh tượng sai số -Mỗi lần lấy mẫu phải lắc Bước 3: ni cấy dịch mẫu Ni cấy nồng độ pha loãng mẫu liên tiếp Dùng micropipet 1ml vơ trùng lấy 1ml dịch mẫu cho vào đĩa,ít đĩa/nồng độ Chuẩn bị môi trường tiệt trùng,để nguội 450C,đổ môi trường vào đĩa chứa 1ml dịch mẫu Xoay nhẹ đĩa theo vòng tròn nhằm trộn dịch mẫu với môi trường để thu khuẩn lạc tách rời.Khi môi trường đông lại,lật ngược đĩa,ủ trong tủ ổn nhiệt Memmert Nếu muốn kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí,dùng mơi trường P.C.A N.A Nếu muốn kiểm tra tổng số men, mốc dùng môi trương P.D.A Sabouraund Thời gian ủ vi khuẩn hiếu khí 24-48h/30-370C.Thời gian ủ men,mốc 72h/30-370C Bước 4: đếm số khuẩn lạc /đĩa/các nồng độ(25-250 khuẩn lạc/đĩa) Kết thí nghiệm Nồng độ Số khuẩn 10-1 Đĩa Đĩa 48 130 10-2 Đĩa Đĩa 113 lạ c Trang 125 10-3 Đĩa Đĩa 105 120 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Bước 5: tính kết theo cơng thức n = c/(n1+0.1n2)*d n : tổng số tế bào / ml (g) mẫu thực phẩm(cfu/g(ml)) c : tổng số khuẩn lạc đếm n1 : số đĩa đếm nồng độ thư n2 : số đĩa đếm nồng độ thư hai d : nồng độ pha loãng thứ đếm =>n= (113 + 125 + 105 + 120).100 =21045 ≈ 21000 cfu/g(ml) (2 + 0,1.2) 4.Môi trường sử dụng 4.1.Môi trường Nutrient Agar Peptone :5.0g Meat extract :3.0g Agar :12.0g Nước cất :1000ml pH sau trùng : 7.0 ± 0.2 Hấp trùng 1210C/15 phút 4.2.Môi trường Plate Count agar Peptone :5.0g Meat extract :2.5g D(+) glucose :1.0g Agar :14.0g Nước cất vừa đủ :1000ml pH sau trùng : 7.0 ± 0.2 Hấp trùng 1210C/15 phút 4.3.Môi trường Sabouraund Trang Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Peptone :20g Glucose :40g Agar :20g Nước :1000ml Hấp trùng 1210C/15 phút BAI 2: KIÊM TRA TÔNG SỐ COLIFORM ̀ ̉ ̉ 1.Những kiến thức chung COLIFORM Coliform là nhom trực khuân gram- , không bao tử , hiêu khí hoăc kị ́ ̉ ̀ ́ ̣ khí y, có khả lên men đường lactose, sinh 37oC /24 – 48h ̀ ́ Coliform và Feacal coliform (coliform phân) là nhom vi sinh vât dung ́ ̣ ̀ để chỉ thị khả có hiên diên cua cac vi sinh vât gây bênh thực ̣ ̣ ̉ ́ ̣ ̣ phâm Nhom coliform gôm vi sinh vât hiêu khí và kị khí y, gram ̉ ́ ̀ ̣ ́ ̀ ́ - , không bao tử , hinh que, lên men đường lactose và sinh môi ̀ ̀ trường long, dựa vao nhiêt dộ tăng trưởng, nhom chia ̉ ̀ ̣ ́ ̀ ̀ nhom nhỏ là coliform và coliform phân có nguôn gôc từ phân cac loai đông ́ ̀ ́ ́ ̀ ̣ vât Trên thực tế kiêm nghiêm coliform phân quan tâm nhiêu ̣ ̉ ̣ ̀ coliform Coliform phân có nguôn gôc từ ruôt người và cac đông vât mau ̀ ́ ̣ ́ ̣ ̣ ́ nong bao gôm cac giông escherichia, kebsiella, enterobater Khi coliform ́ ̀ ́ ́ phân hiên diên môt số lượng lớn mâu thì mâu có khả chứa cac ̣ ̣ ̣ ̃ ̃ ́ vi sinh vât gây bênh hiên diên phân.Chỉ tiêu tổng coliform khơng thích ̣ ̣ ̣ ̣ hợp để làm tiêu thị cho việc nhiễm bẩn nguồn nước phân Tuy nhiên việc xác định số lượng Feacal coliform sai lệch có số vi sinh vật (khơng có nguồn gốc từ phân) phát triển nhiệt độ 44oC Do số lượng E coli coi tiêu thích hợp cho việc quản lý nguồn nước Trong cac viên nhom coliform phân thì E.coli là loai ́ ̀ ́ ̀ quan tâm nhiêu về vệ sinh an toan thực phâm ̀ ̀ ̉ Trang Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Loai vi sinh vât phân bố moi nơi, có ruôt người và cac ̀ ̣ ̀ ̣ ̣ ́ đông vât mau nong ̣ ̣ ́ ́ *môt số hinh anh về coliform: ̣ ̀ ̉ Fecal Coliform 375 x 294 Chromocult® Coliform Agar ES 297 x 300 Trang Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C 2.Ý nghĩa việc kiểm tra tiêu Coliform xem là nhom vi sinh vât chỉ thi Số lượng hiên diên ́ ̣ ̣ ̣ ̣ cua chung thực phâm, nước dung để chỉ thị cho khả hiên ̉ ́ ̉ ̀ ̣ diên cua cac vi sinh vât gây bênh khac Số lượng coliforms cao thì khả ̣ ̉ ́ ̣ ̣ ́ hiên diên cua vi sinh vât gây bênh khac cao ̣ ̣ ̉ ̣ ̣ ́ Colifrorm chiu nhiêt( coliform phân): ̣ ̣ • Là phân hệ vi sinh vât đường ruôt người và cac ̀ ̀ ̣ ̣ ́ đông vât mau nong ̣ ̣ ́ ́ • Được xem là vi sinh vât chỉ thị mức độ vệ sinh quá trinh ̣ ̀ chế biên, bao quan , vân chuyên thực phâm, nước uông cung chỉ ́ ̉ ̉ ̣ ̉ ̉ ́ ̃ thị ô nhiêm phân mơi trường ̃ • Lên men đường lactose mơi trường E.C 44.5oC • Có khả sinh indol 24h/44.5oC • Kêt quả sinh hoa nghiêm phap imvic là + + - ́ ́ ̣ ́ 3.Quy trình kiểm tra Phương phap MPN : ́ Nguyên tăc: ́ Mâu pha loang môt day thâp phân , nông độ kế tiêp ̃ ̃ ̀ ̣ ̃ ̣ ̀ ́ khac 10 lân Mâu ủ môi trường thich hợp có ông ́ ̀ ̃ ́ ́ durham Môi nông độ pha loang lăp lai ông Theo doi sinh ̃ ̀ ̃ ̣ ̣ ́ ̃ ông nghiêm Xac đinh ông dương tinh môi nông độ pha loang ́ ̣ ́ ̣ ́ ́ ̃ ̀ ̃ và dựa vao bang MPN để suy số lượng nhom vi sinh vât tương ứng hiên ̀ ̉ ́ ̣ ̣ diên 1g hoăc 1ml mâu ban đâu ̣ ̣ ̃ ̀ Sơ đồ quy trình kiểm tra : Trang Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C 1ml(10-1)+ 9ml nước 1ml(10-2)+ 9ml nước vô trung ̀ nước vô trung ̀ Stomacher 10gr thực phâm ̉ 10-2 + 90ml NaCl 0.85%( 10-1 ) hinh 1.1 ̀ Bước 1: Trang 10-3 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C 10gr thực phâm + 90ml NaCl 0.85% hoăc là nước vô trung, ̉ ̣ ̀ stomacher thu nông độ 10-1 muc đich đông nhât là để phân bố đêu vi ̀ ̣ ́ ̀ ́ ̀ sinh vât ̣ Bước 2: Pha loang mâu để giam số lượng vi sinh vât có mâu ban dâu ̃ ̃ ̉ ̣ ̃ ̀ Lây 1ml mâu nông độ 10-1 cho vao ông nghiêm thứ nhât, sau đó cho 9ml ́ ̃ ̀ ̀ ́ ̣ ́ nước vô trung Ta ông nghiêm có nông độ 10 -2 Sau đó lây 1ml mâu ̀ ́ ̣ ̀ ́ ̃ nông 10-2 cho vao ông nghiêm thứ hai + 9ml nước vô trung thu ông ̀ ̀ ́ ̣ ̀ ́ nghiêm có nông độ 10-3 tương tự ta thu cac ông nghiêm có ̣ ̀ ́ ́ ̣ nông độ 10-4, 10-5… ̀ Bước 3: Nuôi dich mâu môi trường Laury Tryptose (LT) nông ́ ̣ ̃ ̀ độ liên tiêp(10-1,10-2,10-3) sau : Môi nông độ lây ông nghiêm Cho vao ́ ̃ ̀ ́ ́ ̣ ̀ môi ông nghiệm ông durham, cho môi trường LT vao ông nghiêm ̃ ́ ́ ̀ ́ ̣ cho ngâp ông durham Ghi nông độ liên tiêp bên ngoai ông nghiêm(môi ̣ ́ ̀ ́ ̀ ́ ̣ ̃ nông độ ông nghiêm) Tiêp đên cho 1ml dung dich mâu nông độ 10 -1 ̀ ́ ̣ ́ ́ ̣ ̃ ̀ vao ông nghiêm có ghi nông độ 10-1(chứa môi trường LT),tương tự cho ̀ ́ ̣ ̀ cac ông nghiêm nông độ tiêp theo (hinh 1.1) ủ 37oC/24h ́ ́ ̣ ̀ ́ ̀ Những lưu ý tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường Laury Trytose (LT): -Tiến hành gần lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn - Nhớ lắc mẫu trước tiến hành nuôi cấy vi khuẩn mơi trường Laury Trytose - Khơng lắc ống có ống durham Bước 4: Đoc kêt quả cac ông Laury Tryptose Có trường hợp xay ra: ̣ ́ ́ ́ ̉ Trang Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C + ơng durham khơng thay đơi ́ ̉ + ông durham nôi lên ́ ̉ + ông durham sinh ́ Đoc kêt quả cac ông LT dương tinh, sau đó chuyên cac ông LT ̣ ́ ́ ́ ́ ́ ̀ ́ ́ dương tinh vao cac ông môi trường BGBL 2% băng cach lây que ́ ̀ ̀ ́ ́ ̀ ́ ́ ́ vong nhung vao môi trường LT dương tinh trên,rồi cho vao ông có môi ̀ ́ ̀ ́ ̀ ́ trường BGBL Ghi nông độ san phâm Ủ 37oC /24h ̀ ̉ ̉ Ông LT + : môi trường đuc và ông durham ( ông chuông) nôi hoăc có ́ ̣ ́ ́ ̉ ̣ bot khí ông chuông (thể tich bot khí ông chuông =1/10 thể tich ̣ ́ ́ ̣ ́ ́ ơng chng) ́ Ơng LT - : khơng có hiên tượng gì xay ́ ̣ ̉ Bước 5: Đoc kêt quả ông BGBL dương tinh Lâp tỷ lệ cac ông BGBL dương ̣ ́ ́ ́ ̣ ́ ́ tinh nông độ liên tiêp Tra bang Mac Crady tim số MPN tương ứng ́ ̀ ́ ̉ ̀ + ông BGBL dương tinh: môi trường đuc và ông durham ( ông chuông) ́ ́ ̣ ́ ́ nôi hoăc có bot khí ông chuông( thể tich bot khí =1/10 thể tich ông ̉ ̣ ̣ ́ ́ ̣ ́ ́ chuông) + ông BGBL âm tinh: không có hiên tượng gì xay ́ ́ ̣ ̉ Bước 6: Tinh kêt qua: ́ ́ ̉ Tơng sớ coliform (cfu/g hoăc cfu/ml)= sớ MPN × 10n ̉ ̣ n là số nguyên dương cua nông độ pha loang đâu tiên nuôi ̉ ̀ ̃ ̀ ́ Bước 7: Từ kêt quả tinh được, so sanh với tiêu chuân về an toan vệ sinh thực ́ ́ ́ ̉ ̀ phâm ̉ Môi trường sử dụng: Trang 10 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Ơng LT + : mơi trường đuc và ông durham ( ông chuông) nôi hoăc có ́ ̣ ́ ́ ̉ ̣ bot khí ông chuông (thể tich bot khí ông chuông =1/10 thể tich ̣ ́ ́ ̣ ́ ́ ông chuông) ́ Ông LT - : không có hiên tượng gì xay ́ ̣ ̉ Từ ống E.C (+), cấy phân lập môi trường endo agar E.M.B agar Ủ 37ºC/24h Những lưu ý tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường endo agar E.M.B agar: • Tiến hành gần lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn • Nhớ lắc mẫu trước tiến hành phân lập vi khuẩn môi trường endo agar E.M.B agar Sau khoảng thời gian lấy đem nhận diện khuẩn lạc điển hình: - Mơi trường endo agar: khuẩn lạc trịn, bóng, có ánh kim loại - Mơi trường E.M.B agar: khuẩn lạc trịn, bóng, có tâm đen, có ánh kim Bước : Từ khuẩn lạc nghi ngờ, cấy truyền sang môi trường N.A Ủ 37ºC/24h Buớc : làm nghiệm pháp imvic với vi khuẩn cấy bước I : indol M :methyl red V : V.P C : simon citrat Phản ứng sinh hóa kiểm tra có mặt trực khuẩn đường ruột Gr– có khả sử dụng simon citrat Trang 19 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Kết : + + - - : E.coli type I - + - - : E.coli type II BÀI:4 KIỂM TRA VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS Đặc điểm Stapylococcus aureus: 1.1 lịch sử: Staphylococcus Ogston phát năm 1881 vết thương có mủ.Năm 1884, Rosenbach tiếp tục nghiên cứu 1.2 Phân bố: • Được phân bố rộng rãi, có nhiều sản phẩm động vật thịt, sữa… • Ở người thường có da, tóc, khoang mũi • Bị lây nhiễm từ người chế biến, động vật bị nhiễm bệnh • Được xếp vào nhóm vi khuẩn hội(opportunist type) có mặt rộng rãi thường xuyên mô chờ đợi điều kiện thuận lợi để xâm nhập 1.3 Hình dạng tế bào: Là vk gram+, hình cầu khơng bào tử, hiếu khí kỵ khí tuỳ ý Trong vết thương máu thường thấy hình dạng giống chùm nho 1.4 Đặc điểm điều kiện sinh trưởng: Phát triển tốt môi trường tổng hợp, đặc biệt phát triển tốt môi trường thạch máu huyết Nhiệt độ tối thích 37oC , pHop=7.2 Trên mơi trường thạch ,khuẩn lạc có dạng trịn trơn bóng,đục vun mờ Ở môi trường lỏng, tế bào dạng cặn, vịng nhẫn mờ ống nghiệm bề mặt mơi trường Trang 20 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C 1.5 Đặc điểm sinh hố: • Lên men đường glucose, lactose, maltose, saccharose, glycerol, manitol • Khơng lên men salicin, raffinose,inulin • Có khả chịu mặn cao • Làm đơng tụ sữa • Sinh beta hemolysis mơi trường thạch máu • Phản ứng indol-,NH3-, thuỷ phân gelantine, đông huyết tương 1.6 Khả gây bệnh: Gây ngộ độc thực phẩm: Bệnh gây vi khuẩn tiết độc tố vào thực phẩm, người ăn thực phẩm bị ngộ độc Khơng cần có diện vi khuẩn sống thực phẩm mà cần có độc tố chúng Loại thường có tính chất cục bộ, có khả truyền nhiễm Khi xét nghiệm phân người bệnh bị ngộ độc thực phẩm khơng thấy có vsv gây bệnh Sinh ngoại độc tố(vi khuẩn tiết độc tố vào thực phẩm, người ăn thực phẩm bị ngộ độc) Bản chất ngoại độc tố protein nên chúng chịu nhiệt (trừ độc tố Staphylococcus aureus) kích thích thể sinh kháng thể đặc hiệu(tính kháng nguyên mạnh) phát phản ứng kháng nguyên – kháng thể Độc tố gây viêm dày, viêm ruột Type A D gây ngộ độc thực phẩm cho người Triệu chứng bệnh: Khi ăn phải thực phẩm có chứa độc tố này, sau 30’- 6h (phụ thuộc vào cá thể người bệnh) từ lúc ăn người bị ngộ độc có triệu chứng Trang 21 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C đau thắt bụng, tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ – 8h, kiệt sức mức nghiêm trọng, đau đầu tốt mồ hơi, bủn rủn tay chân.Sự phục hồi xảy sau 24 – 72 h, nạn nhân không chết đau đớn phản ứng dội Ít thấy vi khuẩn phân người bị ngộ độc Là độc tố bền nhiệt, biện pháp nấu nướng không làm bất hoạt độc tố 100oC/30’; 137oC/9’độc tố hoạt lực Các loại thực phẩm có chứa nhiều muối Jambon, kem tổng hợp, nước súp (ít sử lý nhiệt độ >40oC) loại thuỷ sản, thực phẩm đóng hộp thường hay nhiễm loại vsv Con đường lây nhiễm chủ yếu thông qua tiếp xúc từ nhà bếp, trình chế biến Biện pháp phịng ngừa: • Kiểm tra sức khoẻ cơng nhân • Khơng lấy sữa từ động vật bị viêm vú • Trử lạnh thực phẩm < 8oC, ngăn ngừa khả sinh độc tố • Hạ pH thực phẩm để ức chế vi khuẩn phát triển • toC = 60oC/ 0.5h phá huỷ tế bào, số bị phân huỷ to= 80oC /0.5h • Hoá chất: fenol 1%, fenol 2%/15’, hgcl 0.5%/1h, formaldehyt 10%/ 10’, gentiant violet1:25.000/5 – 10’, xử lý nhiễm vết thương da người động vật Staphylococcus gây dùng dung dịch gentiant violet 2% Một số hình ảnh Staphylococcus aureus Trang 22 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Ý nghĩa việc kiểm tra vi khuẩn: Sự diện với mật độ cao Sta Aureus thực phẩm thị điều kiện vệ sinh kiểm soát nhiệt độ trình chế biến Quy trình kiểm tra: 3.1 Quy trình kiểm tra định tính Bước 1: đồng mẫu: lấy 10ml thực phẩm (nước Sâm ) cho vào 90 ml nước vô trùng stomacher Bước 2: tăng sinh: hút 1ml dịch đồng đưa vào môi trường MSB có màu đỏ Ủ 37oC/ 24h Sau đọc kết quả: -Ống tăng sinh âm:có mơi trường MSB giữ màu đỏ -Ống tăng sinh dương: Có mơi trường MSB chuyển từ đỏ sang vàng Bước 3: từ ống tăng sinh dương, cấy phân lập lên môi trường baird parker agar (hoặc MSA) Ủ 37oC/24h Bước 4: nhận diện khuẩn lạc điển hình • Trong mơi trường Baird Parker: Sta Aureus có đặc điểm trịn, lồi, có tâm đen, bóng vun có vịng sáng quanh khuẩn lạc • Trong môi trường MSA : môi trường chuyển từ đỏ sang vàng, vi khuẩn trịn, bóng Bước 5: Từ khuẩn lạc điển hình làm phản ứng pastorex, staphylatex, đọc kết Trang 23 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Bước 6: Kết luận 3.2 Quy trình kiểm tra định lượng Bước 1: đồng mẫu: lấy 10ml thực phẩm (nước Sâm ) cho vào 90 ml nước vơ trùng stomacher Bước 2:pha lỗng mẫu tới nồng độ thích hợp Bước 3:ni cấy 0.1 ml dịch mẫu /đĩa đĩa/ nồng độ, tiến hành thao tác que cấy trang Nuôi cấy dịch mẫu môi trường baird parker Ủ 37oC/ 48h Bước 4: nhận diện khuẩn lạc điển hình Đánh dấu khuẩn lạc điển hình khuẩn lạc khơng điển hình cấy chúng từ môi trường BPA sang môi trường TSA.Ủ 37oC/ 24h Bước 5: cấy chuyển VK sang ống nghiệm có chứa 0.3 ml huyết tương thỏ Ủ 37oC Theo dõi kết phản ứng đông huyết tương sau 1,3,6,24h -Phản ứng dương tính :có khối đơng hình thành -Phản ứng âm tính: khơng có khối đơng hình thành, dịch mẩu giống ban đầu Bước 6: tính kết Số lượng Staphylococci coagulase dương tính: cs=(f1*nt*ht)+(f2*na*ha) cs:số lượng Staphylococci coagulase dương tính f: nồng độ pha lỗng mẫu nt:tổng số khuẩn lạc điển hình đĩa na:tổng số khuẩn lạc khơng điển hình đĩa ht=số khuẩn lạc điển hình thử nghiệm cho kết +/ số khuẩn lạc điển hình thử nghiệm Trang 24 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C ha=số khuẩn lạc khơng điển hình thử nghiệm cho kết +/ khuẩn lạc điển hình thử nghiệm Chú ý : số khuẩn lạc nằm khoảng 20 – 200, đếm số khuẩn lạc điển hình khơng điển hình, sau tính kết cơng thức ghi rõ biểu mẫu 3.3 phản ứng sinh hố Saulatex Dùng để định danh giống lồi Sta.aureus Quy trình: Bước 1:lấy dd muối vào tiêu Bước 2: lấy Sta.aureus vào giọt nước muối tiêu , trộn nhuyễn Bước 3: lấy giọt saulatex vào bên cạnh giọt nước muối Bước 4: kéo giọt nước lại trộn với Bước 5: Đọc kết quả: - phản ứng dương tính:có màu trắng sữa,lợn cợn hạt nhỏ -phản ứng âm tính:màu trắng sữa ban đầu Mở Rộng : 4.1 môi trường sử dụng: Môi trường Chapman agar(manitol salt agar): Là môi trường chọn lọc dùng để phát hiện, phân lập định lượng tụ cầu khuẩn gây bệnh tronh thực phẩm sữa, thịt , hải sản…cũng sinh phẩm khác Các thí nghiệm koch cho thấy tụ cầu khuẩn chịu nồng độ muối cao 7.5% Sau Chapman xác minh tượng trên, đồng thời ghi nhận tụ cầu khuẩn gây đơng tụ huyết tương thỏ hình thành khuẩn lạc vàng mơi trường chapman agar, mơi trường có khả Trang 25 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C ức chế hầu hết vi khuẩn khác Nồng độ muối cao ức chế sinh trưởng hầu hết loài vi khuẩn trừ Staphylococcus Vi khuẩn lên men đường manitol sinh axit làm đổi màu thị (fenol red)của môi trường từ đỏ sang vàng Xác định tất loại khuẩn lạc có màu vàng màu trắng vói mơi trường xung quanh có màu vàng Tuy nhiên, có thề lẫn khuẩn lạc giống Bacillus nên cần xác định khuẩn lạc cách quan sát kính hiển vi Tụ cầu khuẩn gây bệnh tạo khuẩn lạc có sắc tố vàng, đồng thời môi trường xung quanh đổi từ đỏ sang vàng tụ cầu khuẩn gây bệnh thường tạo khuẩn lạc nhỏ có màu đỏ không làm thay đổi màu môi trường Sau 48h nuôi cấy, vài chuẩn cầu khuẩn đường ruột Baciilus, Micrococcus Serratia mọc mơi trường Môi trường Baird parker agar Là môi trường dùng để phân lậ p định lượng vi khuẩn Staphylococcus thực phẩm, dược phẩm Công thức môi trường baird parker khai triển năm 1962 nhằm định lượng Staphylocoagulase Năm 1964, Smith Baird Parker chứng minh bổ sung sulfamerthzine vào môi trường ức chế sinh trưởng vi khuẩn proteus Năm 1971, Tardio Baer quan sát 18 môi trường phân lập chọn lọc thử nghiệm mơi trường B.P gây ức chế môi trường khác Thành phần môi trường có lithium chloride tellurite có tác dụng ức chế quần thể vi khuẩn thường diện Staphylococci pyruvate glycine kích thích phát triển Staphylococci Trang 26 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Khuẩn lạc Staphylococci có hai đặc điểm:Khuẩn lạc có màu đen khử telurite thành telurium, dạng lồi tạo vòng xung quanh khuẩn lạc,đường kính từ – mm thủy phân protein Sau xuất vịng đục vịng (có tác động lecithinase, loại lipase) Đây đặc tính thường thấy có tính chun biệt tụ cầu khuẩn gây bệnh Đặc tính Staphylococcus aureus kiểm chứng qua phản ứng coagulase tốt thử nghiệm desoxyribonuclease phosphatase Các loại vsv ngoại lệ khác mọc mơi trường như: Staphylococcus epidermis, Bacillus, Micrococci, nấm men nhỏ, màu nâu tới đen màu nâu sậm đục, mọc sau 48h trắng Micrococci Bacillus sp nấm men Pastorex: Là thử nghiệm dùng để định danh S.aureus thực trực tiếp với vi khuẩn môi trường nuôi cấy Bằng phản ứng ngưng kết latex kính (latex mẫn cảm với huyết tương người), thử nghiệm cho phép phát đồng thời yếu tố: yếu tố cụm “clumping factor” (một chất có bề mặt tế bào vi khuẩn có lực cao với fibrinogen) protein A Kết nghiên cứu với pastorex với 228 chủng Staphylococci cho thấy:độ nhạy cảm 97.5%, độ đặc hiệu 92.5% BÀI 5: KIỂM TRA ĐỊNH TÍNH VIBRIO CHOLERA,VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS Trang 27 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C 1.Giới thiệu chung 1.1.Lịch sử Vibrio cholera : năm 1883,Robert Kock với vai trị trưởng nhóm nghiên cứu bệnh dịch tả phát vi khuẩn phân bệnh nhân vụ đại dich tả lần thứ vùng Alexandria,Ai cập V.parahaemolyticus Fujino phát lần vào mùa hè năm 1951 vùng ven biển Nhật Bản sau vụ ngộ độc ăn cá ,hào… Người ta xác định đuợc 21 lồi thuộc giống Vibrio,trong có lồi thuộc tác nhân gây bệnh cho người gồm : V.cholera,V.parahaemolyticus ,V.vulnificus,V.alginolyticus 1.2.Đặc điểm phân bố V.cholera phân bố rộng khắp với số lượng lớn lan tới chân Mỹ,gây bệnh dịch tả cho số vùng châu Á,Ấn Độ Đông Nam Á.Chúng gây đại dịch lây truyền qua tiếp xúc, nước ,sữa,thực phẩm côn trùng V.parahaemolyticus vi sinh vật biển,tồn tự nhiên nước biển,thường gặp loại hải sản loại nhuyễn thể giáp sát nước biển Trừ V.cholera tồn nước ngọt,còn tất loại Vibrio khác cần muối để tăng trưởng thường xuyên phân lập vùng nước ven biển 1.3.Đặc điểm hình thái Là vi khuẩn Gram -,hình que hai đầu khơng tạo thành hình dấu phẩy,khơng sinh bào tử,di động nhờ lông roi 1.4.Đặc điểm sinh trưởng phát triển Trang 28 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C T0op=370C , pHop=8.6 ,sống kị khí tùy ý, có khả phát triển tốt mơi trường kiềm V.cholera bị tiêu diệt nhiệt độ t0=560C 30’, điều kiện khô hạn,ánh sáng chất diệt khuẩn 1.5.Cấu trúc kháng nguyên độc tố V.cholera sinh độc tố ruột nội độc tố đường tiêu hóa,kích thích nghiêm trọng màng nhày tạo dịch dày,gây tiêu chảy nặng ,mất nước,chống,thậm chí gây tử vong với tỉ lệ lên tới 25-50%.Biện pháp điều trị tốt bổ sung nước chất điện giải thay Phần lớn đợt dịch bệnh V.parahaemolyticus gây thường vào mùa hè,khi nước thủy vực ấm lên.Các triệu chứng tiêu chảy,nôn mửa,hơi ớn lạnh,đau đầu xuất sau 12 h sau ăn lượmg lớn vi sinh vật sống (105 tế bào/g).Cá triệu chứng tương tự triệu chứng Salmonella gây trầm trọng hơn.Salmonella tác dụng lên vùng bụng V.parahaemolyticus tác dụng lên dày người bệnh 2.Quy trình kiểm tra Bước 1: Tăng sinh 25 g thực phẩm ( mắm tôm) + 225ml peptone kiềm, stomacher Ủ 370C/24h Rất khó phát Vibrio mẫu,vì ta sử dụng lượng mẫu lớn 25g.Và khó phát nên phải tạo điều thuận lợi để Vibrio sinh trưởng cách tăng sinh môi trường pepton kiềm Bước : Phân lập từ phần váng dịch tăng sinh lên môi trường TCBS agar.Ủ370C/24h Bước : nhận diện khuẩn lạc điển hình Vi sinh vật Đặc điểm Trang 29 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Vibrio cholera Vàng,chuyển màu môi trường từ xanh Vibrio parahaemolyticus sang vàng,dẹp,2-3mm Không màu,tâm xanh đậm màu Vibrio alginolyticus Vibrio fluvialis,V.vulnificus Pseudomonas,Aeromonas Các loại vk đường ruột khác môi trường,3-4mm Khuẩn lạc vàng lớn Khuẩn lạc vàng lớn Khuẩn lạc xanh dương Khuẩn lạc nhỏ ,trong suốt Bước 4: từ khuẩn lạc nghi ngờ,cấy chuyền sang môi trường N.A Ủ 370 C / 24h Bước : lấy vi khuẩn môi trường N.A làm khánhg huyết Vibrio ,đọc kết phản ứng ngưng kết làm BIS 14 GNE, ủ đọc kêt -Huyết tương thỏ bị đông lại sau 30 phút cấy vi khuẩn vào.Trên vách tế bào bi khuẩn có chứa protein A enzyme - BIS 14 GNE gồm 14 phản ứng sinh hóa để định danh vi khuẩn Gr - ,có 10 giếng (giếng có phản ứng phản ứng sinh H2S phản ứg Indol) phản ứng bên ngồi.Trong MOB kiểm tra khả di động vi khuẩn MOB+(mọc lan nhòe MOBTrang 30 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C đường cấy) 3.Môi trường sử dụng Môi trường TCBS agar môi trường chọn lọc để phân lập Vibrio cholera loài Vibrio gây bệnh đường ruột khác ( đặc biệt Vibrio parahaemolyticus) mẫu bệnh phẩm hoạc mẫu thực phẩm ,hải sản Nồng độ cao chất thiosulfate sodium citrate với tính kiềm ức chế tương đối phát triển vi khuẩn đường ruột Mật bò muối mật làm chậm sinh trưởng cầu khuẩn đường ruột ức chế phát triển vi khuẩn Gram + Sự acid hóa môi trường Vibrio lên men saccharose làm thay đổi màu thị bromothymol blue sang vàng Hydrogen sulfide sinh sư diện thiosulfate ferric citrate,tất lồi Vibrio khơng sinh H2S Các vi khuẩn khác mọc TCBS agar : E.coli ,Salmonella typhy, Klebsiella,Shingella…nhưng khuẩn lạc khơng có màu vàng MỤC LỤC Trang BÀI 1:QUY TRÌNH KIỂM TRA TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ 1.Định nghĩa 2.Ý nghĩa việc kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí 3.Quy trình kiểm tra Trang 31 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C 4.Mơi trường sử dụng BAI 2: KIÊM TRA TÔNG SỐ COLIFORM ̀ ̉ ̉ 1.Những kiến thức chung COLIFORM 2.Ý nghĩa việc kiểm tra tiêu 3.Quy trình kiểm tra Môi trường sử dụng 10 5.Các thiết bị ,dụng cụ sử cho thí nghiệm 11 6.Kết thí nghiệm 11 BÀI 3: KIỂM TRA TỔNG SỐ E.COLI 12 1.Mục đích thí nghiệm 12 Nguyên tắc 12 3.Dụng cụ hóa chất 12 4.Tiến hành thí nghiệm 13 BÀI:4 KIỂM TRA VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS 18 Đặc điểm Stapylococcus aureus 18 Ý nghĩa việc kiểm tra vi khuẩn 21 Quy trình kiểm tra 21 Mở Rộng 24 BÀI 5: KIỂM TRA ĐỊNH TÍNH VIBRIO CHOLERA,VIBRIO 26 PARAHAEMOLYTICUS 1.Giới thiệu chung 26 2.Quy trình kiểm tra 27 Trang 32 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C 3.Mơi trường sử dụng 29 Trang 33 ... 1ml Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C   Mẫu 10-2 10-3 10-1 9ml NaCl 9ml NaCl (nước vô trùng) vô trùng vô trùng 90ml NaCl vô trùng Trang 15 10-4 9ml NaCl vô trùng Thực tập vi sinh đại. .. muối vô trùng nhằm tạo môi trường dinh dưỡng cho vi sinh vật, dùng nước cất vô Trang 16 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C trùng vi sinh chết để lâu bên ngồi mà khơng có mơi trường... nhiệt độ số vi khuẩn khác bị hạn chế khả sinh trưởng Hơn môi trường E.C muối mật ức chế cá vi khuẩn Gr + vi khuẩn khơng thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột Trang 18 Thực tập vi sinh đại cương Nhóm