Giáo trình thực tập vi sinh vật đại cương potx

TR NG I H C NÔNG NGHI P HÀ N I KHOA CÔNG NGH TH C PH M ******* Bài gi ng th c t p MÔN VI SINH V T IC NG Gi ng viên: TS Nguy n Th Thanh Thu Hà n i, 2009 BÀI 1: YÊU C U I V I CƠNG VI C TRONG PHỊNG THÍ NGHI M VSV CÁCH S D NG MÁY MÓC – CÁCH BAO GÓI D NG C THU TINH Các nhà vi sinh v t h c làm vi c ch y u v i gi ng vi sinh v t thu n t ó th h sinh t nh ng t bào riêng bi t Trong khơng khí, b m t v t phịng thí nghi m, c qu n áo, chân tay… u ln có m t l ng r t l n lo i vi sinh v t, v y c n ph i quan tâm t i vi c gi thu n t gi ng vi sinh v t dùng nghiên c u Khi làm vi c phịng thí nghi m vi sinh v t h c, c n ph i tuân ch nghiêm ng t qui t c nh t nh U C U I V I PHỊNG THÍ NGHI M VI SINH V T H C Phịng ln ph i c gi gìn s ch s Trong th c t , tiêu di t vi sinh v t khơng khí b m t v t, ta có th dùng bi n pháp kh trùng khác Khơng khí Th ng c làm s ch b ng ph ng pháp thơng gió Ph i thơng gió liên t c 30-60 phút Thơng gió s làm th p rõ r t s l ng vi sinh v t khơng khí, nh t có chênh l ch v nhi t gi a ngồi phịng M t cách làm s ch khơng khí khác có hi u qu h n th ng c s d ng h n, ó vi c chi u b ng tia t ngo i Lo i tia có tác ng ch ng vi sinh v t cao, làm ch t không nh ng t bào dinh d ng mà bào t c a vi sinh v t n a kh trùng khơng khí c n chi u tia t ngo i t 30 phút n vài gi tùy theo m c nhi m b n c a khơng khí Chú ý: tránh không tia t ngo i chi u tr c ti p ho c chi u ph n x lên m t Trong phịng nh , khơng nên ó ang b t èn t ngo i Sàn nhà, t ng bàn gh c làm s ch b ng máy hút b i, lau chùi b ng m t s hoá ch t kh trùng (dung d ch n c cloramin 0,5-3%) Làm v sinh tr c c sau làm thí nghi m Trên bàn làm vi c không v t d ng khơng c n thi t Ph i có nhãn ghi t t c l hoá ch t, l dung d ch ã pha ch ph i t ch xác nh Trong phịng thí nghi m ph i m c áo blouse làm vi c, không c phép n, u ng, hút thu c NGUYÊN T C LÀM VI C V I CÁC GI NG VI SINH V T Trong i u ki n phịng thí nghi m, vi sinh v t c ni c y môi tr ng dinh d ng ( c ho c l ng ng ng nghi m, a Petri ho c bình thu tinh D ng c thu tinh môi tr ng dinh d ng u ã c kh trùng tr c C y công vi c a t bào vi sinh v t vào môi tr ng ã c kh trùng Khi c y (ho c c y chuy n) ph i ti n hành theo nh ng qui t c xác nh, m b o gi cho gi ng nghiên c u kh i b nhi m vi sinh v t môi tr ng xung quanh Th c t p VSV N.T.T.Th y Tr c c y: ghi lên ng nghi m ( a Petri ho c bình thu tinh) tên gi ng, tên mơi tr ng, ngày ni c y Có th vi t b ng bút vi t kính ho c vi t lên nhãn gi y r i dán vào d ng c Trong c y: Khi l y t bào vi sinh v t môi tr ng c c y ho c làm tiêu b n, ng i ta s d ng que c y u tròn ho c u nh n l y t bào vi sinh v t môi tr ng l ng, ng i ta th ng dùng pipet ã kh trùng Cách ti n hành Kh trùng u que c y tr c l y t bào vi sinh v t H nóng u que c y làm nóng c ph n cán a que c y ã kh trùng vào d ng c ch a vi sinh v t tránh làm ch t vi sinh v t, tr c h t ph i áp que c y vào m t c a d ng c thu tinh ho c vào ph n môi tr ng ch a vi sinh v t cho ngu i r i m i dùng l y m t l ng nh sinh kh i vi sinh v t Các thao tác u c th c hi n bên c nh ng n l a (không ph i bên ng n l a) ph i ti n hành th t nhanh tránh nhi m VSV môi tr ng xung quanh Vi c c y vi sinh v t vào môi tr ng vô trùng t t nh t c th c hi n phòng vô trùng Sau c y Các t bào vi sinh v t l i u que c y sau c y ho c làm tiêu b n c t cháy ng n l a Ph i t t ph n dây kim lo i sát v i u que c y làm cho t bào vi sinh v t cịn l i b khơ i khơng t o thành khí dung (aerosol) làm nhi m b n khơng khí, sau ó t th ng ng nung u que c y i v i hình th c l y m u, c y b ng pipet vô trùng, sau ti n hành xong, pipet ph i c nhanh chóng ngâm vào dung d ch kh trùng (dung d ch cloramin 0,53% hay dung d ch phenol 3-5%) Sau c y ph i t ng nghi m (ho c d ng c khác có ni c y vi sinh v t) vào t nh ôn (thermostab) i v i d ng c nuôi c y vi sinh v t ã dùng xong, c n ph i kh trùng b ng n i h p áp l c (autoclave) r i m i em i r a Ph i lên b m t môi tr ng c ã dùng xong m t l p dung d ch kh trùng, ngày, sau ó m i c r a X lý không c n th n d ng c nuôi c y vi sinh v t s có th d n n hi n t ng khí dung vi khu n (baterial aerosol) NGUYÊN T C GHI CHÉP THÍ NGHI S ghi chép cơng vi c thí nghi m tài li u cho phép ki k t qu thu c Ph i ghi chép c n th n, rõ ràng theo m -Tên thí nghi m, ngày b t u ngày k t thúc - i t ng nghiên c u - Nh ng i u ki n ti n hành thí nghi m - Nguyên t c c b n c a ph ng pháp phân tích ã s - Nh ng k t qu thu nh n c Th c t p VSV N.T.T.Th y M m tra s xác c a t tr t t xác nh d ng Chú ý - Ph i ghi chép t m k t qu thu c, s li u ph i ghi thành t ng b ng, n u c n thi t ph i v bi u , th - Có quan sát, nh n xét, k t lu n c a b n thân - Không ghi chép vào m nh gi y r i CÁCH S D NG M T S MÁY MĨC Trong phịng thí nghi m có m t s lo i máy móc th ng xun c s d ng, v y c n ph i n m v ng cách v n hành b o d ng máy móc ó 1.N I P ÁP L C (AUTOCLAVE) Nguyên lý Ph ng pháp s d ng n i h p áp l c d a nguyên t c làm gia nhi t v t b ng h i n c bão hoà d i áp su t l n h n áp su t khí quy n Khi áp su t t ng, nhi t c ng t ng theo (b ng) B ng Nhi t c bão hoà áp su t khác Nhi t (oC) Áp su t (atm) Bình th ng Cao (áp su t b sung) 1,0 100 1,0 0,5 112 1,0 1,0 121 1,0 1,5 128 1,0 2,0 134 Tác d ng ph i h p gi a nhi t cao áp su t m b o cho vi c kh trùng th c hi n c t t Khi h p, áp l c s tiêu di t c t bào & sinh d ng l n bào t c a vi sinh v t Chú ý: ghi ch kh trùng b ng n v áp su t 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 atm… có ngh a nói n áp su t b sung C ut o N i h p th ng có c u trúc khác nh ng c u t o v m t nguyên lý c a b t k n i h p áp l c c ng nh Cách s d ng n c vào n i h p v i l ng thích h p ( n v ch chu n ng thu tinh t d i ph u rót n c) N c ph i , khơng nên q sơi n c có th l t vào ng d n n áp k làm sai l c ch s áp N u ít, hi u qu kh trùng kém, có th gây cháy n i T t nh t nên dùng n c c t cho vào n i h p s khơng t o canxi - Các dùng ph i bao gói k r i m i x p vào n i h p n ng Không nên x p d ng c sát h i n c có th di chuy n d dàng - Các môi tr ng em kh trùng c rót khơng q n a chi u cao c a d ng c ch a chúng Các d ng c có mơi tr ng c y b ng nút ng n c n vi Th c t p VSV h in N.T.T.Th y sinh v t khơng khí nhi m vào mơi tr ng Tuy nhiên nút c ng không nên ch t, gây nh h ng t i s cung c p không khí cho gi ng ni c y - t n p n i h p, v n ch t khoá, óng van thông h i - un nóng (có th b ng i n ho ng b ng h i t) kim áp k ch n v ch 0,5atm m van thơng h i lo i h t khơng khí có s n n i h p Do m t áp su t, nhi t c a h i n c n thu n s cao h n nhi t c ah nh p gi a h i n c khơng khí, nh v y tác d ng kh trùng c a h i n c n thu n lên t bào vi sinh v t s m nh lên r t nhi u - Khi kim áp k tr v 0, óng van thông h i, áp su t s t ng d n t i m c c n thi t Lúc ó ch c n i u ch nh ngu n nhi t trì tr ng thái theo th i gian ã nh tr c (Hi n nay, ph n l n phịng thí nghi m, n i h p áp l c ã c trang b y thi t b ch nh nhi t , áp l c th i gian ) - Khi ã th i gian kh trùng, i áp su t n i h d n t i v ch s 0, m van thông h i x h t khí V n c, m n p, l y dùng ã c kh trùng 2.T NH ÔN (THERMOSTAB) ây thi t b quan tr ng nuôi c y vi sinh v t Nhi t t có th thay o ã c xác nh s c trì n nh su t th i i t 0-60 C Nhi t gian nuôi c y C ut o Bao g m l p: - L p l p kim lo i d n nhi t gi nhi t bên c a t - L p l p kim lo i d y h n bao b c bên m t l p cách nhi t Gi a l p l p th ng kho ng r ng gi cho nhi t bi n i Trong t có m c b ph n c m ng nhi t báo nhi t lên xu ng cho r le ho t ng Phía m t ngồi c a t có núm i u ch nh nhi t Các i m c n ý s d ng - Ph i xem i n th c a máy v i n i t máy có gi ng khơng N u khác ph i dùng bi n th i n - Khi dùng l n u ph i xem b ph n i u ch nh nhi t có làm vi c t t khơng, nhhi t t có n nh khơng - C a t ln óng kín tr l y ho c cho nguyên li u vào nuôi c y - Luôn d m b o s ch s , khô t Cho máy ch y th ng xuyên nh t nh ng ngày tr i m Th c t p VSV N.T.T.Th y T S Y Nguyên lý ây ph ng pháp dùng kh trùng d ng c thu tinh b ng khơng khí nóng Cơng vi c c th c hi n t s y nhhi t 165-180oC vịng gi Khi ó có th tiêu di t c t bào sinh d ng bào t c a vi sinh v t C ut o T s y có c u t o b i v t li u ch u nhi t, th ng b ng kim lo i ho c ami ng Trong t có ng n, phía có l c m nhi t k cho b u thu ngân c a nhi t k ph i t bên t , cách thành c a t 6-8cm Khơng nên t sát thành t nhi t ó th ng cao h n nhi t so v i t Vi c trì nhi t c n thi t c th c hi n nh thi t b i u hoà nhi t (thermoregulator) Cách s d ng - Các d ng c ã chu n b t t c a vào t s y Khơng nên x p q khít khơng khí có th l u thơng làm nóng u v t c n kh trùng - óng kín c a t l khơng khí, b t công t c i n Khi nhi t lên t i 165o 180 C trì nhi t vòng gi Chú ý: n u nhi t xu ng th p tác d ng kh trùng khơng cịn, n u nhi t q o cao, l n h n 180 C s gây cháy gi y - Kh trùng xong, t t công t c i n nh ng không c m c a t tr c nhi t o h xu ng d i 80 C, n u không s gây n t làm nh h ng n tính vơ trùng c a d ng c CÁCH X LÝ D NG C TH Y TINH i v i d ng c thu tinh m i, d ng c thu tinh tr c sau làm thí nghi m, c n ý hai nhi m v trung tính r a d ng c Ph ng pháp trung tính d ng c thu tinh Ph ng pháp c s d ng nh m tránh s thay i pH gây t d ng c ch a vào môi tr ng nuôi c y Ph ng pháp th : l y n c trung tính (pH=7) cho vào d ng c thu tinh, em h p nhi t cao kho ng 30’ -> gi L y ra, ngu i, th pH N u pH>7, ngâm d ng c vào dung d ch HCl 2% 10gi Sau th l i th y ch a trung tính ti n hành ngâm ti p Nói chung d ng c thu tinh u ki m R a d ng c thu tinh D ng c m i Dùng ch i lơng sát xà phịng r a s ch trong, d ng c , r a xong d c ng c cho khô n c D ng c sau dùng ng nghi m: Dùng xong qua kh trùng n i h p áp l c hay ngâm dung d ch lyzol 2% 24 h Th c t p VSV N.T.T.Th y v t ph m ng nghi m ra, dùng xà phòng r a s ch trong, ng Tráng s ch, N u b ng cách ch a s ch có th ngâm vào dung d ch KMnO4 0,2% m t êm, v t ra, dùng dung d ch HCl 0,2% t y thu c tím Sau ó r a s ch nh M t s dung d ch có th dùng r a (ngâm 24h) NaOH 4% ; HCl 0,2% ; HNO3 20% ; Na3PO4 5% ;H2SO4 20% - Pipette: dùng xong ngâm dung d ch fenol 5%, sau ó ngâm vào dung d ch NaOH 0,4% - a Petri: dùng v i xát xà phịng r a bên góc quanh a, úp s p a, c sát bên R a b ng n c s ch nhi u l n, - Chai l : Tr c r a, h t ch t l i chai, l Ngâm n c 1-2 ngày Dùng dung d ch xà phòng c r a s ch, xúc r a bên nhi u l n, xúc r a l i v i dung d ch HCl 0,2% Tráng s ch, i v i l ng thu c nhu m, c n ngâm dung d ch HCl hay c n, sau ó dùng n c r a s ch - Phi n kính: N u phi n kính có d u, tr c r a ph i lau s ch, ngâm phi n kính vào dung d ch credin 2% ho c dung d ch fenol 5% Có th ngâm dung d ch HgCl2 0,1% hay dung d ch lyzol 5% un n c xà phòng phút R a s ch, khơ Có th gi phi n kính c n, dùng l y lau khô, h lên l a Nh v y tránh c b i, phi n kính s s ch h n BAO GĨI D NG C TH Y TINH Các d ng c thu tinh chi m m t ph n l n d ng c phòng th c t p vi sinh v t h c Vi c x lý bao gói d ng c có liên quan tr c ti p t i k t qu ti n hành D ng c ph i c l a ch n úng qui cách, m b o ch t l ng, ph i c x lý t t, v t b n khơng ch a t p ch t Bao gói ph i t tiêu chu n kh trùng thu n ti n s d ng Tr c h p kh trùng d ng c , v t li u, c n ph i ti n hành bao goí k úng k thu t thu n ti n cho công vi c kh trùng, tránh hi n t ng n t v hay b t p nhi m sau h p Cách làm nút Làm b ng không th m n c (bông m ) lo i s i dài C t thành mi ng nh hình vng 7-8cm Tu theo ng kính mi ng ng nh hay to mà ta có th thay i kích th c c a mi ng cho phù h p Chú ý - Nút cho ng nghi m không dài cm - Không làm nút ch t gây v ng nghi m - Không làm nút bơng q l ng d b nhi m t p - Làm nút bơng cho bình l n ph i b c thêm v i th a ho c g c Th c t p VSV N.T.T.Th y Làm nút ng hút M c ích: ng n ng a ch t t môi tr ng nuôi c y vào mi ng tránh nhi m t p t mi ng vào môi tr ng Cách làm Dùng que nh cho vào mi ng ng hút chút (cách mi ng 1-2cm) Chú ý: Khơng làm nút ch t q s khó hút ch t Khơng làm nút l ng nút bơng có th di ng lên, xu ng Bao gói d ng c Sau ã làm nút, d ng c ph i c bao gói quy cách em h p - i v i ng nghi m ng mơi tr ng ã có nút bơng, c n dùng gi y b c ch t phía u nút l i - Chai l c ng c b c ch t ph n nút b ng gi y - Pipet c gói b t u t phía u nh gi t, cu n gi y d n theo ki u xốy trơn c cho t i h t phía u có nút bơng Các pipet có th c gói t t i vài chi c - Các a Petri c gói thành ch ng, m i ch ng t 3-5 chi c - Các d ng c khác, tu theo yêu c u mà có s bao gói cho thích h p N u h p n i h p áp l c khơng c bao gói b ng gi y th m n c mà ph i dùng lo i gi y dai, không th m n c Các d ng c bao gói ph i th t khô, s ch, tránh v h p D ng c bao gói xong ph i dán nhãn, ngày em h p ti n vi c theo dõi, s d ng N i dung t c Quan sát bi t cách s d ng máy móc nh : t nh ơn, n i h p áp l c, t s y Th c t p x lý làm nút bơng bao gói d ng c thu tinh, ti n hành s y h p kh trùng d ng c Chu n b d ng c hoá ch t Máy móc - D ng c : T nh ôn T s y N i h p áp l c D ng c thu tinh Ch i r a d ng c thu tinh a tre, v i D ng c ngâm thu tinh Giá g , gi l i Ch u r a Hoá ch t Xà phòng Dung d ch ki m Dung d ch axit HCl 0,2%; H2SO4 20%, Fenol 5%; HNO3 Dung d ch ch t oxy hoá: KmnO4 0,2%; K2Cr2O7 10% Dung d ch ch t sát trùng: lyzol 2%; credin 2% Th c t p VSV N.T.T.Th y BÀI - PH NG PHÁP S D NG KÍNH HI N VI, CÁCH LÀM TIÊU B N VÀ QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH V T Vi c nghiên c u, c u t o t bào vi sinh v t h t s c nh bé ch có th th c hi n c nh s giúp ó c a kính hi n vi Hi n nay, ng i ta ã sáng ch nhi u lo i kính hi n vi khác nh m m c ích nghiên c u rõ sâu h n v vi sinh v t Tuy nhiên ây ch nghiên c u s d ng lo i kính hi n vi quang h c – lo i kính c s d ng h u h t l nh v c có liên quan n vi sinh v t quan sát vi sinh v t d i kính hi n vi quang h c, c n làm tiêu b n t bào s ng (tiêu b n t i) tiêu b n t bào ã cc nh (ch t) M c ích – yêu c u - N m v ng c u t o c a kính hi n vi, hi u rõ nguyên t c ph ng pháp s d ng - S d ng thành th o kính hi n vi quan sát hình thái c u t o c a vi sinh v t - Th c hi n t t bi n pháp, yêu c u b o v kính hi n vi tr c sau s d ng - H c làm tiêu b n t bào vi sinh v t s ng, tiêu b n c nh nhu m màu - Làm quen v i hình thái h c c a i di n thu c nhóm vi sinh v t khác A KÍNH HI N VI QUANG H C VÀ CÁCH S D NG Kính hi n vi bao g m ba b ph n sau ây: B ph n c gi i Chân kính: Dùng kính hi n vi Khay kính: N i t tiêu b n quan sát gi a có m t l h ng ánh sáng có th i qua Trên khay có k p gi tiêu b n Khay kính có th cc nh ho c i ng theo chi u nh có c c nh c chuy n d ch n m mép d i khay kính Tr mang ng kính: b ph n dùng t ng kính Tr kính có b u ( u tr ) g n ng kính bàn xoay ng kính: ng kim lo i hình tr , phía g n th kính, phía d i g n bàn xoay có g n v t kính Ph n ng kính có th m t ng g n th kính ho c có th hai ng g n th kính Ph n có th quay c theo h ng nh vít hãm c i u ch nh: g m c v c p c vi c p Các c th c ch t i u ch nh kho ng cách gi a tiêu b n u v t kính B ph n quang h c V t kính: V t kính h th ng quang h c g m nhi u th u kính ghép l i v i B ph n quan tr ng nh t quy t nh tính n ng c a kính hi n vi (tính n ng t o nh th t c a tiêu b n) M i kính hi n vi tu theo thi t k : V t kính b i s th p, trung bình cao V t kính có b i s th p v t kính 8X; 10X; 20X; v t kính có b i s cao trung bình 40X; 60X; ho c 65X; v t kính có b i s cao 90X ho c 100X (cịn g i v t kính Th c t p VSV N.T.T.Th y u, u có m t vòng en phân bi t v i v t kính khác) v t kính có b i s th p th ng c dùng xem t i, v t kính d u th ng xem tiêu b n nhu m Th kính: c u t o g m hai th u kính ghép l i Th kính khơng có n ng l c t o nh nh v t kính mà ch y u ch c n ng c a phóng i nh v t kính thu c Thơng th ng th kính có phóng i: 7X; 10X; 15X 20X (ho c 12X, 16X…) phóng i tiêu b n quan sát s tích s c a phóng i th kính v i phóng i c a v t kính em s d ng Ví d : n u dùng v t kính d u có phóng i 90X th kính có phóng i 15X quan sát tiêu b n tiêu b n ã c phóng i lên: 90x15 = 1350 l n B ph n t p trung ánh sáng G ng ph n chi u: t d i khay kính g m hai m t lõm l i T quang kính: t d i khay kính dùng t p trung ánh sáng t g ng ph n chi u vào tiêu b n T quang kính m t ho c nhi u th u kính t o nên s t p trung ánh sáng D i h th ng th u kính b ph n ch n sáng T quang kính có th di ng lên xu ng nh có c i u n làm chuy n d ch b n l g n t quang CÁCH S D NG T th kính: t kính bàn ng n, t th có l i nh t cho ng i quan sát Khi quan sát ng i ta th ng dùng m t trái m t ph i ghi chép Ngu n sáng Có th s d ng hai ngu n sáng ngu n sáng t nhiên ngu n sáng nhân t o (ánh sáng èn) S d ng ngu n sáng t nhiên th ng ánh sáng tán x (ánh sáng gián ti p) Tránh dùng ánh sáng chi u tr c ti p có h i cho m t ánh sáng không c rõ S d ng ngu n sáng nhân t o, th ng ng i ta dùng ánh sáng c a èn i n ánh sáng c a èn d u, èn t, n n….C n dùng nh ng phi n kính l c màu t t quang kính tránh s nh h ng c a tia sáng màu vàng ho c màu nâu n màu s c th t c a nh Tr ng h p ánh sáng m nh s d ng kính m màu tr ng gi m b t c ng ánh sáng làm cho ánh sáng u Cách l y ánh sáng Hi u qu quan sát tiêu b n có quan h r t l n n cách s d ng ánh sáng S d ng t t ánh sáng có quan h n ba y u t cách s d ng ngu n sáng, s d ng g ng ph n chi u kính t quang i v i kính hi n vi có b trí kính t quang Trong tr ng h p thông th ng: dùng m t ph ng g ng ph n chi u b o m phát huy tính n ng t o nh c a kính Trong tr ng h p ánh sáng khơng có th dùng kính lõm i v i kính hi n vi khơng có b trí kính t quang nói chúng u dùng m t lõm c a g ng ph n chi u S d ng kính t quang c n n m c i m sau ây: quan sát v i v t kính b i s táp th ng m b ph n ch n sáng, h th p n m c g n nh th p nh t Th c t p VSV N.T.T.Th y 10 kính t quang Khi dùng v t kính có b i s cao h n kính t quang c ng c nâng d n lên n m c c n thi t t c chi u sáng t t, nh rõ Dùng v i v t kính d u (b i s cao) c n thi t ph i nâng kính t quang lên m c t i a có th m hồn tồn b ph n ch n sáng Xác nh tiêu i m quan sát Khi xem t i ch c n h th p ng kính g n sát xu ng tiêu b n, sau ó v n c v c p nâng t t ng kính lên, ng th i quan sát kính, n u th y ch p nh dùng c vi c p i u ch nh cho rõ nh c a tiêu b n Khi xem tiêu b n nhu m v i v t kính d u u tiên ph i xác nh tiêu i m v i v t kính b i s th p nh t Sau ó nh m t gi t d u b ch d ng (cedre) r t nh vào v trí ã c xác nh khơng làm lan r ng Do v t kính d u có phóng i l n, ng kính th u kính nh v y khơng cho d u ch có m t ph n nh ánh sáng l t vào th u kính, nh vào s khơng c rõ, d u b ch d ng có chi t su t x p x chi t xu t thu tinh ánh sáng i qua tiêu b n vào v t kính m t mơi tr ng g n nh ng nh t nên di th ng mà khơng b khúc x v y l ng ánh sáng vào nhi u, nh rõ Xoay v t kính d u cho sát xu ng tiêu b n cho u v t kính ng p d u Khi th y có ch p nh v n c vi c p t t th y rõ nh tiêu b n CÁCH B O QU N KÍNH HI N VI L y kính hi n vi h p nên dùng tay ph i, n m ch c tr kính kéo kính theo h ng n m ngang khơng ng vào thành h p; sau ó dùng tay trái chân kính mang i N u mang i xa ph i c nh ch c ch n tránh b h ng kính b l c m nh Không c s tay vào u c a v t kính th kính N u phát hi n th y v t kính, th kính b b i b n ph i dùng gi y riêng lau kính hay kh n l a lau, lau ph i nh nhàng Khi dùng xong, n u s d ng v t kính d u tr c h t ph i dùng gi y m m ho c v i l a lau nh cho s ch d u, sau ó lau l i b ng xylen ho c benzen cho h t d u u v t kính Xoay b ph n c a kính v úng ch qui nh Khơng c ánh sáng m t tr i chi u tr c ti p vào kính Khơng c tháo l p b ph n c a kính, khơng t ý cho d u vào b ph n c gi i c a kính Ph i n i khơ thống, khơng nóng, b i b n B PH NG PHÁP LÀM VÀ NHU M CÁC TIÊU B N PH NG PHÁP LÀM TIÊU B N T I KHÔNG NHU M Tiêu b n “gi t ép” Tiêu b n “gi t ép” c dùng xác nh hình thái, kích th c, x p ph ng th c sinh bào t c a t bào vi sinh v t Cách làm: Dùng m t phiên kính (lame) khơ, s ch, l y m t gi t n c vô trùng t lên gi a phiên kính Sau ó dùng que c y vơ trùng thêm vào ó m t t bào vi sinh v t hay Th c t p VSV N.T.T.Th y 11 v t li u c n nghiên c u (n c d a, s a ….), tr n u Dùng m t kính (lamella) y lên gi t dung d ch vi sinh v t (hình) Chú ý: Tránh y nhanh, m nh có th gây nên b t khí làm cho gi t d ch b n lung tung Tiêu b n “gi t treo”: c dùng quan sát s sinh s n c a vi sinh v t, s hình thành n y m m c a bào t , phát hi n kh n ng di ng m i quan h c a t bào vi sinh v t v i kích thích hố h c Cách làm: Dùng que c y u tròn l y m t gi t d ch huy n phù vi sinh v t t lên kính s ch khơ Bơi m t l p vaz lin m ng quanh ch lõm phi n kính có th g n ch t kính bên trên, tránh khơ d ch quan sát Quay ng c kính xu ng phía d i t lên m t phi n kính lõm cho gi t d ch n m úng ch lõm Tiêu b n v t: Dùng nghiên c u s phân b t nhiên c a t bào khu n l c vi sinh v t, hình thái bào t & cu ng sinh bào t x khu n, n m m c Cách làm: Cách 1: dùng kính ép nh lên m t ám vi sinh v t m c dày c hay phía m t khu n l c riêng r t tiêu b n ã nh n c lên m t phi n kính ã có s n m t gi t n c hay m t gi t dung d ch xanh metylen 1/40 Cách 2: có th dùng phi n kính ép nh lên b m t c a vi sinh v t ho c b m t c a khu n l c L y làm tiêu b n “v t” PH NG PHÁP LÀM TIÊU B N NHU M M c ích: có th quan sát m t rõ ràng h n ho t ng s ng c a t bào vi sinh v t Cách làm: gi ng nh tiêu b n “gi t treo” ho c “gi t ép”, nh ng cho thêm dung d ch thu c nhu m xanh metylen …% PH NG PHÁP C NH VÀ NHU M MÀU TIÊU B N C nh nhu m màu tiêu b n dùng quan sát k ph n c u trúc c a t bào Nh ng tiêu b n có tác d ng b o t n tiêu b n c a m t lo i hình vi sinh v t ó cho nghiên c u v sau Vi c chu n b tiêu b n g m b c: chu n b v t bôi, làm khô, c nh nhu m màu (hình) Chu n b v t bơi: t v t li u nghiên c u lên m t phi n kính s ch theo ki u làm gi t ép, dùng que c y dàn u v t li u di n tích 1-2cm2 Th c t p VSV N.T.T.Th y 12 Làm khô v t bôi: Tiêu b n c làm khơ khơng khí, n u khơ ch m có th h phiên kính lên phía cao c a ng n l a èn c n Tránh làm q nóng v t bơi n u nh v y vi sinh v t s b bi n d ng C nh: M c ích - G n t bào vi sinh v t lên phi n kính - Tránh b r a trơi - Làm cho v t bôi d b t thu c nhu m t bào ch t d nhu m màu h n t bào s ng, an tồn s d ng v t bơi h n, nh t s d ng vi sinh v t gây b nh Nhu m màu: - Ng i ta chia lo i thu c nhu m thành hai lo i: thu c nhu m axit thu c nhu m baz - T bào vi sinh v t c nhu m màu ch y u b ng thu c nhu m baz - Thu c nhu m axit g m: eozin, eritrozin, nigrozin, fuchsin zit…, chúng liên k t ch t ch v i cá thành ph n t bào ch t (có tính baz ) c a t bào - Thu c nhuôm baz : xanh metylen, fuchsin ki m, tím gentian, tím k t tinh, safranin…., chúng liên k t v i thành ph n ch t nhân (có tính axit) c a t bào - Ng i ta chia cách nhu m: nhu m n nhu m phân bi t a Nhu m n: có th quan sát tồn b hình d ng kích th nhu m nh : xanh metylen, fuchsin, tím getian c t bào Dùng thu c b Nhu m phân bi t: dùng nhu m phân bi t nghiên c u m t s c u trúc t bào, c tính xác nh vi sinh v t Cách làm: i v i nhu m n nhu m phân bi t: - t phi n kính ã cc nh giá thu tinh - Nh 1-2 gi t thu c nhu m lên tiêu b n - R a nh tiêu b n b ng n c t i th y n c c Nhu m Gram (nhu m kép) D a vào s khác v thành ph n hoá h c thành t bào c a t bào vi khu n S d ng ph i h p lo i thu c nhu m phân bi t s khác ó Cách làm (hình…) N i dung t ng trình - Làm tiêu b n t i khơng nhu m nhu m i v i loài vi sinh v t nhóm: + Vi khu n (Sarcina, Staphylococcus, Bacillus subtilis, E.coli) + N m men: (Saccharomyces cerevisiae) + N m m c (Mucor, Aspergillus, Rhizopus) - Miêu t hình thái lo i vi khu n Th c t p VSV N.T.T.Th y 13 - Miêu t hình thái s n y ch i c a n m men - Miêu t hình thái c quan mang bào t b o t c a n m m c - Nhu m Gram i v i lo i vi khu n V hình thái xác nh s b t màu c a chúng Chu n b d ng c hoá ch t D ng c Kính hi n vi, d u soi kính Que c y trịn nh n Phi n kính th ng lõm, kính èn c n Giá ch u thu tinh Hoá ch t Xanh metylen axit phenic C n 96o Tím gentian KI I2 Axeton Safranin Fucshin Th c t p VSV N.T.T.Th y 14 BÀI - MÔI TR NG NUÔI C Y VÀ PH NG PHÁP PHÂN L P VSV MÔI TR NG NUÔI C Y Kh n ng t ng h p cách th c thu nh n n ng l ng khác tu thu c vào m i lo i vi sinh v t Do v y nhu c u v ch t dinh d ng c a chúng c ng khác Môi tr ng dinh d ng c n thi t cho vi c ni c y tích lu , phân l p, b o qu n gi ng c ng nh nuôi c y v i m c ích nghiên c u trình trao i ch t ho c thu nh n s n ph m trao i ch t có giá tr vi sinh v t Môi tr ng dinh d ng c n ph i ch a ng t t c thành ph n c n thi t i v i trình hình thành c u trúc n ng l ng c a t bào ó ngu n dinh d ng cacbon, nitrogen, nguyên t khống ngun t vi l ng Tuy nhiên mơi tr ng ph i có i u ki n lý, hoá phù h p v i i u ki n s ng c a vi sinh v t ó nh : pH, th oxy hoá kh , n ng ch t, thống khí… A CÁC LO I MÔI TR NG C n c vào thành ph n, ngu n g c ch t dinh d ng có mơi tr ng Mơi tr ng t nhiên: Mơi tr ng hình thành t s n ph m có ngu n g c ng v t ho c th c v t nh : n c ép rau, qu , t ch c mô c ng v t, màu pha loãng, s a, … ho c có th n c chi t thu c ch t o t c ch t t nhiên nh th t, phân, t, b ph n c a th c v t … Trên môi tr ng t nhiên, nhi u lo i vi sinh v t phát tri n r t t t có ch a nhi u thành ph n dinh d ng c n thi t cho s sinh tr ng phát tri n c a vi sinh v t Tuy nhiên mơi tr ng có thành ph n hóa h c ph c t p, không n nh, không thu n l i cho vi c nghiên c u sinh lý, trao i ch t c a vi sinh v t Các môi tr ng t nhiên ch y u c dùng nic c y tích lu sinh kh i ho c nh tên vi sinh v t Môi tr ng t ng h p: Môi tr ng c hình thành t h p ch t hố h c tinh t, c xác nh l y v i nh ng n ng phù h p u i m: bi t rõ thành ph n s l ng thành ph n a vào môi tr ng nên có th nghiên c u c nhu c u c ng nh s chuy n hoá c a chúng thành s n ph m trao i ch t t ng ng Nh c i m: giá thành cao Môi tr ng bán t ng h p: Thu c lo i mơi tr ng t nhiên có thành ph n không xác nh Trong thành ph n c a chúng, h p ch t ã rõ b n ch t hố h c cịn có c nh ng ch t ch a bi t rõ thành ph n Môi tr ng c s d ng ph bi n vi sinh v t h c công nghi p thu nh n axit amin, vitamin s n ph m quan tr ng khác ho t ng s ng c a vi sinh v t Th c t p VSV N.T.T.Th y 15 C n c v công d ng c a môi tr ng Phân lo i thành môi tr ng: môi tr ng ch n l c môi tr ng chu n óan phân bi t Mơi tr ng c s : môi tr ng c s d ng r ng rãi nh t c s c a mơi tr ng có th t o môi tr ng c n dùng khác Môi tr ng c s th ng th y nh t môi tr ng n c pepton, môi tr ng n c th t pepton Môi tr ng ch n l c: Môi tr ng m b o s phát tri n th c a m t loài hay m t nhóm vi sinh v t ó thu n l i ho c hoàn toàn b t l i i v i d phát tri n c a vi sinh v t khác Các môi tr ng ch n l c ch y u c s d ng phân l p vi sinh v t t môi tr ng sinh s ng t nhiên c a chúng ho c dùng ni c y tích lu Mơi tr ng chu n ốn phân bi t (mơi tr ng ch th ) Cho phép phân bi t nhanh loài vi sinh v t v i loài vi sinh v t khác Thành ph n c a mơi tr ng ph i tính tốn, ch n l a cho phát hi n c rõ ràng c i m c a lồi ó Các mơi tr ng ch th c dùng vi khu n h c lâm sàng, nghiên c u di truy n h c nh tên vi sinh v t C n c vào tr ng thái v t lý c a môi tr ng C n c vào tr ng thái v t lý c a môi tr ng, có th phân bi t thành d ng sau: Môi tr ng l ng: H p thành s hoà tan ch t dinh d ng c n thi t n c nh môi tr ng n c th t, n c pepton, n c lo i c , qu nh carot, su hào, khoai tây, giá … Môi tr ng c ng d ng phát hi n c i m sinh lý – sinh hố c a vi sinh v t, tích lý sinh kh i ho c s n ph m trao i ch t, gi gi ng b o qu n nhi u lo i vi sinh v t không phát tri n t t môi tr ng c Mơi tr ng bán l ng: c hình thành c s c a môi tr ng l ng có b sung m t s ch t làm ông giúp cho môi tr ng c l i nh ng có ơng Mơi tr ng bán l ng dùng theo dõi s di ng c a vi khu n Mơi tr ng r n: Hình thành c s c a mơi tr ng l ng có b sung ch t làm ông nhi u h n môi tr ng bán l ng nh m t ng ông c ng c a môi tr ng Môi tr ng c ng d ng tách gi ng thu n t, nghiên c u nh tên (xác nh hình thái khu n l c, c i m sinh tr ng th ch nghiêng…), gi gi ng, m s l ng vi sinh v t, xác nh tính i kháng c a vi sinh v t nhi u tr ng h p khác Môi tr ng x p: c ng d ng vi sinh v t h c công nghi p Thu c lo i có kê n u nh , cám, cát th ch anh th m dung d ch dinh d ng Th c t p VSV N.T.T.Th y 16 B CÁCH PHA CH CÁC LO I MÔI TR NG i v i lo i môi tr ng khác nhau, cách ch t o có nh ng quy t c chung gi ng Quy trình pha ch mơi tr ng Ph i h p hoà tan nguyên li u Cân xác ngun li u mơi tr ng theo l ng ã nh Cho vào d ng c n u: - N u ch môi tr ng l ng un ý b sung l ng n c b c h i - N u ch mơi tr ng r n: cân xác hố ch t (t l ng nh nh t t i l ng t ng d n), xác nh l ng thách c n cho B sung n c cho t i th tích u c u Ngốy u un b p cho tan th ch Chú ý ngoáy u tránh b t khí phía b cháy phía d i Ki m tra pH Có th dùng máy o pH ho c so màu C n c vào pH ã c xác nh, i u ch nh pH c a môi tr ng theo úng yêu c u nuôi c y Thông th ng i u ch nh pH c a mơi tr ng cao h n só v i yêu c u m t chút theo kinh nghi m, môi tr ng sau kh trùng pH s b h th p (môi tr ng th ch r n h p pH h 0,4; môi tr ng th ch m m h 0,2; môi tr ng l ng h 0,1 Mu n i u ch nh pH th ng dùng dung d ch HCl, NaOH, H2SO4, NaHCO3… pha v i n ng xác nh L c phân ph i mơi tr ng Có th dùng gi y l c, v i xô, ho c l c b ng thi t b l c chân không Phân ph i môi tr ng vào d ng c c n làm Chú ý l ng môi tr ng không v t t l cho phép so v i dung tích v t ch a tránh b trào - Khi h p th ch nghiêng khơng q 1/4 dung tích ng - Khi h p th ch ng khơng q 2/3 dung tích ng - Khi h p th ch bình tam giác, l ng môi tr ng không v t 2/3 dung tích bình Kh trùng Thơng th ng kh trung n i h p áp l c Nhi t th i gian kh trùng tu thu c vào c tính c a mơi tr ng ó Do k n ng d bi n i c tính hố h c c a mơi tr ng có m t ch t q trình kh trùng, ta có th h p riêng r m t s ch t, sau ó k t h p l i v i tr c dùng nuôi c y M t s môi tr ng d b phá h y nhi t cao, có th dùng ph ng pháp gián o n (ph ng pháp tyndal) x lý Ki m nh Sau h p kh trùng, t môi tr ng t nh ôn nhi t 300 C Sau 2448h n u không th y vi sinh v t xu t hi n t yêu c u B o qu n Môi tr ng c ki m nh n u ch a dùng phi b o qu n nhi t th p tránh ánh sáng giúp mơi tr ng khơng b khơ, khơng b oxy hố ho c có nh ng bi n i v pH, ng th i gi cho môi tr ng không b nhi m t p Chú ý: th i gian BQ không dài Th c t p VSV N.T.T.Th y 17 CÁCH PHA CH M T S LO I MÔI TR NG Cách pha ch m t s lo i môi tr ng Môi tr ng t nhiên Môi tr ng canh th t – pepton (MPB): môi tr ng nuôi c y vi sinh d d ng Cách làm: Th t (lo i b x ng, m , gân) xay nh : 500g + lít n c -> l c l y n c -> un sôi > l c -> b sung n c t i m c ban u -> b sung 0.5% NaCl + 1% pepton -> kh trùng 1atm/20-30 phút Môi tr ng m ch nha: môi tr ng t t v i lo i vi khu n lactic, vi khu n axetic, n m men, n m m c lo i vi sinh v t d d ng th ng dùng ng làm ngu n cacbon ngu n nguyên li u n ng l ng Cách làm : i m ch n y m m (thóc n y m m) xay nh : 250g + n c : lít -> un nóng -> nâng nhi t -> ng hố h t tinh b t (khơng có phán ng màu v i thu c th Iod) -> l c -> o n ng dung d ch ng ( Balling - oB) N ng ng n c m ch nha m i th ng t 16-18oB Mu n có n ng c n thi t, ta dùng n c s ch pha loãng + i v i n m m c, n ng 3-4oB + i v i men, n ng 6-8oB + i v i vi khu n lactic, n ng 8-12oB N c m ch nha c kh trùng 0,5atm/20-30 phút Môi tr ng khoai tây: c s d ng ch y u phân l p ni c y lồi gi ng Clostriodium i di n vi khu n phân gi i tinh b t khác Cách làm Khoai tây g t v , c t nh : 200 g + lít n c -> un sơi (15 phút) -> phân ph i vào d ng c nuôi c y -> kh trùng (1,5 atm/30 phút) -> CaCO3 môi tr ng nuôi c y Môi tr ng t ng h p Môi tr ng Hansen : s d ng Nguyên li u (g/l) Glucose(maltose, saccharose) Th ch : 20g MgSO4 : 2-5g Cách làm Hoà tan h n h p nguyên lieu 121oC/15 phút nuôi c y n m men : 50 g Pepton pH :… n : 10g KH2PO4 : 3g c, un cho tan h t th ch, h p kh trùng, Mơi tr ng Saburaud PH NG PHÁP NI C Y PHÂN L P VI SINH V T Trong công tác nghiên c u vi sinh v t: c y, phân l p có t m quan tr ng l n công tác b o t n gi ng, t o nh ng gi ng thu n ch ng hay gi ng m i Th c t p VSV N.T.T.Th y 18 Trong môi tr ng m i, vi sinh v t phát tri n t t, t ng nhanh v s l ng t bào Tuy nhiên sau m t th i gian ngu n dinh d ng c n d n, s tích lu s n ph m c a trình trao i ch t t ng lên gây tác d ng c ch vi sinh v t th m chí cịn thay c tính ho c gây ch t t bào Do v y nên c n c y truy n sang môi tr ng m i Qua phân l p ng i ta có th sàng l c c ch ng lo i vi sinh v t riêng bi t Trên c s nh n bi t thu n ch ng gi ng theo yêu c u c a ng i PH NG PHÁP PHÂN L P Dùng ph ng pháp c y th ch a nh m t o nh ng khu n l c riêng r , thu n l i cho vi c nh n xét, phân bi t hay ch n l c ch ng vi sinh v t có m u Ph ng pháp phân l p c ti n hành theo b c sau: L ym u Tu theo m u em phân l p mà có cách l y m u kh i l ng m u l y khác C n b o m i u ki n chung - S l ng ph i phân l p ti n hành phân tích ch tiêu khác (n u c n) - Ph i ghi rõ ràng th i gian a i m l y m u phân l p - Th i gian l y m u ti n hành nhanh - Chú ý công tác vơ trùng ch n l c m u có tính i di n X lý m u M u r n: Bao g m m u t, m u th c n b t, m u th t….Cân xác 10g m u cho vào c i vơ trùng nghi n k , sau ó pha lỗng t i 100ml b ng n c c t vô trùng L c u hút l y 1ml d ch m u làm b c pha loãng ti p theo M u l ng: không c n x lý tr c, ch c n hút l y 1ml d ch m u pha loãng Ph ng pháp pha loãng m u c y Chu n b dãy ng nghi m ch a 9ml n c vô trùng ho c dung d ch NaCl 9% vô trùng, s l ng ng tu theo s c oán s vi sinh v t m u nhi u hay Cách làm (hình) Chú ý: chuy n chuy n sang n ng m i, c n thay pipet C y môi tr ng th ch a: môi tr ng ã c chu n b ki m nghi m t tr c C y t pha loãng ó ph thu c vào s l ng vi sinh v t có Dùng pipet vơ trùng l y m t th tích nh t nh (th ng 0,05; 0,1; 0,2 ml) d ch có pha loãng t ng ng, c y lên b m t th ch có ch a a Petri, dùng que g t dàn u lên kh p b m t mơi tr ng T m i pha lỗng c n l p l i t 3-5 l n M i l n ch s d ng pipet que g t vô trùng Các a ch a môi tr ng ã c y c t vào t nh ôn v i nhi t thích h p theo dõi s phát tri n c a vi sinh v t c n phát hi n Nói chúng, sau 24 gi , vi sinh v t ã sinh tr ng phát tri n t t, hình thành khu n l c môi tr ng m b o cho vi sinh v t m c h t, có th xác nh Th c t p VSV N.T.T.Th y 19 th i gian nuôi c y nh sau: vi khu n 36-48 gi , n m men 48-72 gi , n m m c 96120 gi N i dung th c t p t ng trình Ph n làm mơi tr ng - Chia thành nhóm th c t p làm môi tr ng: canh th t Pepton, môi tr ng khoai tây, môi tr ng Hansen môi tr ng Saburaud - Ti n hành môi tr ng th ch nghiêng, th ch a i v i môi tr ng Hansen Saburaud - Nêu tóm t t cách làm mơi tr ng xác nh hi u qu kh trùng môi tr ng D ng c , hoá ch t nguyên li u D ng c C c n u: 1000ml, 500ml, 250ml Ph u thu tinh H p l ng ng nghi m: 16x160ml Bình tam giác: 100ml, 200 ml, 250ml Bình nh m c: 250ml, 500ml, 1000ml èn c n a thu tinh H p so màu pH k B p i n N i h p áp l c Hoá ch t nguyên li u Dung d ch axit: HCl 0,1N ho c H2SO4 0,1N K2SO4 KH2PO4 Dung d ch baz : NaOH 0,1N ho c NaHCO3 0,1N MgSO4.7H2O NaCl CaCO3 ng Glucose Pepton Th ch Ph n phân l p - Chia thành nhóm th c t p phân l p vi sinh v t mơi tr ng r n: Bánh biscuit, thóc, m ; môi tr ng l ng: n c sinh ho t, n c d a chua, s a t i - - Ti n hành làm ng nghi m có ch a dung d ch n c mu i sinh lý ti t trùng pha loãng m u - Theo dõi s xu t hi n khu n l c kh n ng phát tri n c a chúng Xác nh c i m hình thái khu n l c c ng nh hình thái t bào V hình minh ho Th c t p VSV N.T.T.Th y 20 ... a vi sinh v t tránh làm ch t vi sinh v t, tr c h t ph i áp que c y vào m t c a d ng c thu tinh ho c vào ph n môi tr ng ch a vi sinh v t cho ngu i r i m i dùng l y m t l ng nh sinh kh i vi sinh. .. tay… u ln có m t l ng r t l n lo i vi sinh v t, v y c n ph i quan tâm t i vi c gi thu n t gi ng vi sinh v t dùng nghiên c u Khi làm vi c phịng thí nghi m vi sinh v t h c, c n ph i tuân ch nghiêm... C U I V I CÔNG VI C TRONG PHỊNG THÍ NGHI M VSV CÁCH S D NG MÁY MÓC – CÁCH BAO GÓI D NG C THU TINH Các nhà vi sinh v t h c làm vi c ch y u v i gi ng vi sinh v t thu n t ó th h sinh t nh ng t bào