Giáo trình thực tập vi sinh vật đại cương potx

20 763 5
Giáo trình thực tập vi sinh vật đại cương potx

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

TR NG I H C NÔNG NGHI P HÀ N I KHOA CÔNG NGH TH C PH M ******* Bài gi ng th c t p MÔN VI SINH V T IC NG Gi ng viên: TS Nguy n Th Thanh Thu Hà n i, 2009 BÀI 1: YÊU C U I V I CƠNG VI C TRONG PHỊNG THÍ NGHI M VSV CÁCH S D NG MÁY MÓC – CÁCH BAO GÓI D NG C THU TINH Các nhà vi sinh v t h c làm vi c ch y u v i gi ng vi sinh v t thu n t ó th h sinh t nh ng t bào riêng bi t Trong khơng khí, b m t v t phịng thí nghi m, c qu n áo, chân tay… u ln có m t l ng r t l n lo i vi sinh v t, v y c n ph i quan tâm t i vi c gi thu n t gi ng vi sinh v t dùng nghiên c u Khi làm vi c phịng thí nghi m vi sinh v t h c, c n ph i tuân ch nghiêm ng t qui t c nh t nh U C U I V I PHỊNG THÍ NGHI M VI SINH V T H C Phịng ln ph i c gi gìn s ch s Trong th c t , tiêu di t vi sinh v t khơng khí b m t v t, ta có th dùng bi n pháp kh trùng khác Khơng khí Th ng c làm s ch b ng ph ng pháp thơng gió Ph i thơng gió liên t c 30-60 phút Thơng gió s làm th p rõ r t s l ng vi sinh v t khơng khí, nh t có chênh l ch v nhi t gi a ngồi phịng M t cách làm s ch khơng khí khác có hi u qu h n th ng c s d ng h n, ó vi c chi u b ng tia t ngo i Lo i tia có tác ng ch ng vi sinh v t cao, làm ch t không nh ng t bào dinh d ng mà bào t c a vi sinh v t n a kh trùng khơng khí c n chi u tia t ngo i t 30 phút n vài gi tùy theo m c nhi m b n c a khơng khí Chú ý: tránh không tia t ngo i chi u tr c ti p ho c chi u ph n x lên m t Trong phịng nh , khơng nên ó ang b t èn t ngo i Sàn nhà, t ng bàn gh c làm s ch b ng máy hút b i, lau chùi b ng m t s hoá ch t kh trùng (dung d ch n c cloramin 0,5-3%) Làm v sinh tr c c sau làm thí nghi m Trên bàn làm vi c không v t d ng khơng c n thi t Ph i có nhãn ghi t t c l hoá ch t, l dung d ch ã pha ch ph i t ch xác nh Trong phịng thí nghi m ph i m c áo blouse làm vi c, không c phép n, u ng, hút thu c NGUYÊN T C LÀM VI C V I CÁC GI NG VI SINH V T Trong i u ki n phịng thí nghi m, vi sinh v t c ni c y môi tr ng dinh d ng ( c ho c l ng ng ng nghi m, a Petri ho c bình thu tinh D ng c thu tinh môi tr ng dinh d ng u ã c kh trùng tr c C y công vi c a t bào vi sinh v t vào môi tr ng ã c kh trùng Khi c y (ho c c y chuy n) ph i ti n hành theo nh ng qui t c xác nh, m b o gi cho gi ng nghiên c u kh i b nhi m vi sinh v t môi tr ng xung quanh Th c t p VSV N.T.T.Th y Tr c c y: ghi lên ng nghi m ( a Petri ho c bình thu tinh) tên gi ng, tên mơi tr ng, ngày ni c y Có th vi t b ng bút vi t kính ho c vi t lên nhãn gi y r i dán vào d ng c Trong c y: Khi l y t bào vi sinh v t môi tr ng c c y ho c làm tiêu b n, ng i ta s d ng que c y u tròn ho c u nh n l y t bào vi sinh v t môi tr ng l ng, ng i ta th ng dùng pipet ã kh trùng Cách ti n hành Kh trùng u que c y tr c l y t bào vi sinh v t H nóng u que c y làm nóng c ph n cán a que c y ã kh trùng vào d ng c ch a vi sinh v t tránh làm ch t vi sinh v t, tr c h t ph i áp que c y vào m t c a d ng c thu tinh ho c vào ph n môi tr ng ch a vi sinh v t cho ngu i r i m i dùng l y m t l ng nh sinh kh i vi sinh v t Các thao tác u c th c hi n bên c nh ng n l a (không ph i bên ng n l a) ph i ti n hành th t nhanh tránh nhi m VSV môi tr ng xung quanh Vi c c y vi sinh v t vào môi tr ng vô trùng t t nh t c th c hi n phòng vô trùng Sau c y Các t bào vi sinh v t l i u que c y sau c y ho c làm tiêu b n c t cháy ng n l a Ph i t t ph n dây kim lo i sát v i u que c y làm cho t bào vi sinh v t cịn l i b khơ i khơng t o thành khí dung (aerosol) làm nhi m b n khơng khí, sau ó t th ng ng nung u que c y i v i hình th c l y m u, c y b ng pipet vô trùng, sau ti n hành xong, pipet ph i c nhanh chóng ngâm vào dung d ch kh trùng (dung d ch cloramin 0,53% hay dung d ch phenol 3-5%) Sau c y ph i t ng nghi m (ho c d ng c khác có ni c y vi sinh v t) vào t nh ôn (thermostab) i v i d ng c nuôi c y vi sinh v t ã dùng xong, c n ph i kh trùng b ng n i h p áp l c (autoclave) r i m i em i r a Ph i lên b m t môi tr ng c ã dùng xong m t l p dung d ch kh trùng, ngày, sau ó m i c r a X lý không c n th n d ng c nuôi c y vi sinh v t s có th d n n hi n t ng khí dung vi khu n (baterial aerosol) NGUYÊN T C GHI CHÉP THÍ NGHI S ghi chép cơng vi c thí nghi m tài li u cho phép ki k t qu thu c Ph i ghi chép c n th n, rõ ràng theo m -Tên thí nghi m, ngày b t u ngày k t thúc - i t ng nghiên c u - Nh ng i u ki n ti n hành thí nghi m - Nguyên t c c b n c a ph ng pháp phân tích ã s - Nh ng k t qu thu nh n c Th c t p VSV N.T.T.Th y M m tra s xác c a t tr t t xác nh d ng Chú ý - Ph i ghi chép t m k t qu thu c, s li u ph i ghi thành t ng b ng, n u c n thi t ph i v bi u , th - Có quan sát, nh n xét, k t lu n c a b n thân - Không ghi chép vào m nh gi y r i CÁCH S D NG M T S MÁY MĨC Trong phịng thí nghi m có m t s lo i máy móc th ng xun c s d ng, v y c n ph i n m v ng cách v n hành b o d ng máy móc ó 1.N I P ÁP L C (AUTOCLAVE) Nguyên lý Ph ng pháp s d ng n i h p áp l c d a nguyên t c làm gia nhi t v t b ng h i n c bão hoà d i áp su t l n h n áp su t khí quy n Khi áp su t t ng, nhi t c ng t ng theo (b ng) B ng Nhi t c bão hoà áp su t khác Nhi t (oC) Áp su t (atm) Bình th ng Cao (áp su t b sung) 1,0 100 1,0 0,5 112 1,0 1,0 121 1,0 1,5 128 1,0 2,0 134 Tác d ng ph i h p gi a nhi t cao áp su t m b o cho vi c kh trùng th c hi n c t t Khi h p, áp l c s tiêu di t c t bào & sinh d ng l n bào t c a vi sinh v t Chú ý: ghi ch kh trùng b ng n v áp su t 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 atm… có ngh a nói n áp su t b sung C ut o N i h p th ng có c u trúc khác nh ng c u t o v m t nguyên lý c a b t k n i h p áp l c c ng nh Cách s d ng n c vào n i h p v i l ng thích h p ( n v ch chu n ng thu tinh t d i ph u rót n c) N c ph i , khơng nên q sơi n c có th l t vào ng d n n áp k làm sai l c ch s áp N u ít, hi u qu kh trùng kém, có th gây cháy n i T t nh t nên dùng n c c t cho vào n i h p s khơng t o canxi - Các dùng ph i bao gói k r i m i x p vào n i h p n ng Không nên x p d ng c sát h i n c có th di chuy n d dàng - Các môi tr ng em kh trùng c rót khơng q n a chi u cao c a d ng c ch a chúng Các d ng c có mơi tr ng c y b ng nút ng n c n vi Th c t p VSV h in N.T.T.Th y sinh v t khơng khí nhi m vào mơi tr ng Tuy nhiên nút c ng không nên ch t, gây nh h ng t i s cung c p không khí cho gi ng ni c y - t n p n i h p, v n ch t khoá, óng van thông h i - un nóng (có th b ng i n ho ng b ng h i t) kim áp k ch n v ch 0,5atm m van thơng h i lo i h t khơng khí có s n n i h p Do m t áp su t, nhi t c a h i n c n thu n s cao h n nhi t c ah nh p gi a h i n c khơng khí, nh v y tác d ng kh trùng c a h i n c n thu n lên t bào vi sinh v t s m nh lên r t nhi u - Khi kim áp k tr v 0, óng van thông h i, áp su t s t ng d n t i m c c n thi t Lúc ó ch c n i u ch nh ngu n nhi t trì tr ng thái theo th i gian ã nh tr c (Hi n nay, ph n l n phịng thí nghi m, n i h p áp l c ã c trang b y thi t b ch nh nhi t , áp l c th i gian ) - Khi ã th i gian kh trùng, i áp su t n i h d n t i v ch s 0, m van thông h i x h t khí V n c, m n p, l y dùng ã c kh trùng 2.T NH ÔN (THERMOSTAB) ây thi t b quan tr ng nuôi c y vi sinh v t Nhi t t có th thay o ã c xác nh s c trì n nh su t th i i t 0-60 C Nhi t gian nuôi c y C ut o Bao g m l p: - L p l p kim lo i d n nhi t gi nhi t bên c a t - L p l p kim lo i d y h n bao b c bên m t l p cách nhi t Gi a l p l p th ng kho ng r ng gi cho nhi t bi n i Trong t có m c b ph n c m ng nhi t báo nhi t lên xu ng cho r le ho t ng Phía m t ngồi c a t có núm i u ch nh nhi t Các i m c n ý s d ng - Ph i xem i n th c a máy v i n i t máy có gi ng khơng N u khác ph i dùng bi n th i n - Khi dùng l n u ph i xem b ph n i u ch nh nhi t có làm vi c t t khơng, nhhi t t có n nh khơng - C a t ln óng kín tr l y ho c cho nguyên li u vào nuôi c y - Luôn d m b o s ch s , khô t Cho máy ch y th ng xuyên nh t nh ng ngày tr i m Th c t p VSV N.T.T.Th y T S Y Nguyên lý ây ph ng pháp dùng kh trùng d ng c thu tinh b ng khơng khí nóng Cơng vi c c th c hi n t s y nhhi t 165-180oC vịng gi Khi ó có th tiêu di t c t bào sinh d ng bào t c a vi sinh v t C ut o T s y có c u t o b i v t li u ch u nhi t, th ng b ng kim lo i ho c ami ng Trong t có ng n, phía có l c m nhi t k cho b u thu ngân c a nhi t k ph i t bên t , cách thành c a t 6-8cm Khơng nên t sát thành t nhi t ó th ng cao h n nhi t so v i t Vi c trì nhi t c n thi t c th c hi n nh thi t b i u hoà nhi t (thermoregulator) Cách s d ng - Các d ng c ã chu n b t t c a vào t s y Khơng nên x p q khít khơng khí có th l u thơng làm nóng u v t c n kh trùng - óng kín c a t l khơng khí, b t công t c i n Khi nhi t lên t i 165o 180 C trì nhi t vòng gi Chú ý: n u nhi t xu ng th p tác d ng kh trùng khơng cịn, n u nhi t q o cao, l n h n 180 C s gây cháy gi y - Kh trùng xong, t t công t c i n nh ng không c m c a t tr c nhi t o h xu ng d i 80 C, n u không s gây n t làm nh h ng n tính vơ trùng c a d ng c CÁCH X LÝ D NG C TH Y TINH i v i d ng c thu tinh m i, d ng c thu tinh tr c sau làm thí nghi m, c n ý hai nhi m v trung tính r a d ng c Ph ng pháp trung tính d ng c thu tinh Ph ng pháp c s d ng nh m tránh s thay i pH gây t d ng c ch a vào môi tr ng nuôi c y Ph ng pháp th : l y n c trung tính (pH=7) cho vào d ng c thu tinh, em h p nhi t cao kho ng 30’ -> gi L y ra, ngu i, th pH N u pH>7, ngâm d ng c vào dung d ch HCl 2% 10gi Sau th l i th y ch a trung tính ti n hành ngâm ti p Nói chung d ng c thu tinh u ki m R a d ng c thu tinh D ng c m i Dùng ch i lơng sát xà phịng r a s ch trong, d ng c , r a xong d c ng c cho khô n c D ng c sau dùng ng nghi m: Dùng xong qua kh trùng n i h p áp l c hay ngâm dung d ch lyzol 2% 24 h Th c t p VSV N.T.T.Th y v t ph m ng nghi m ra, dùng xà phòng r a s ch trong, ng Tráng s ch, N u b ng cách ch a s ch có th ngâm vào dung d ch KMnO4 0,2% m t êm, v t ra, dùng dung d ch HCl 0,2% t y thu c tím Sau ó r a s ch nh M t s dung d ch có th dùng r a (ngâm 24h) NaOH 4% ; HCl 0,2% ; HNO3 20% ; Na3PO4 5% ;H2SO4 20% - Pipette: dùng xong ngâm dung d ch fenol 5%, sau ó ngâm vào dung d ch NaOH 0,4% - a Petri: dùng v i xát xà phịng r a bên góc quanh a, úp s p a, c sát bên R a b ng n c s ch nhi u l n, - Chai l : Tr c r a, h t ch t l i chai, l Ngâm n c 1-2 ngày Dùng dung d ch xà phòng c r a s ch, xúc r a bên nhi u l n, xúc r a l i v i dung d ch HCl 0,2% Tráng s ch, i v i l ng thu c nhu m, c n ngâm dung d ch HCl hay c n, sau ó dùng n c r a s ch - Phi n kính: N u phi n kính có d u, tr c r a ph i lau s ch, ngâm phi n kính vào dung d ch credin 2% ho c dung d ch fenol 5% Có th ngâm dung d ch HgCl2 0,1% hay dung d ch lyzol 5% un n c xà phòng phút R a s ch, khơ Có th gi phi n kính c n, dùng l y lau khô, h lên l a Nh v y tránh c b i, phi n kính s s ch h n BAO GĨI D NG C TH Y TINH Các d ng c thu tinh chi m m t ph n l n d ng c phòng th c t p vi sinh v t h c Vi c x lý bao gói d ng c có liên quan tr c ti p t i k t qu ti n hành D ng c ph i c l a ch n úng qui cách, m b o ch t l ng, ph i c x lý t t, v t b n khơng ch a t p ch t Bao gói ph i t tiêu chu n kh trùng thu n ti n s d ng Tr c h p kh trùng d ng c , v t li u, c n ph i ti n hành bao goí k úng k thu t thu n ti n cho công vi c kh trùng, tránh hi n t ng n t v hay b t p nhi m sau h p Cách làm nút Làm b ng không th m n c (bông m ) lo i s i dài C t thành mi ng nh hình vng 7-8cm Tu theo ng kính mi ng ng nh hay to mà ta có th thay i kích th c c a mi ng cho phù h p Chú ý - Nút cho ng nghi m không dài cm - Không làm nút ch t gây v ng nghi m - Không làm nút bơng q l ng d b nhi m t p - Làm nút bơng cho bình l n ph i b c thêm v i th a ho c g c Th c t p VSV N.T.T.Th y Làm nút ng hút M c ích: ng n ng a ch t t môi tr ng nuôi c y vào mi ng tránh nhi m t p t mi ng vào môi tr ng Cách làm Dùng que nh cho vào mi ng ng hút chút (cách mi ng 1-2cm) Chú ý: Khơng làm nút ch t q s khó hút ch t Khơng làm nút l ng nút bơng có th di ng lên, xu ng Bao gói d ng c Sau ã làm nút, d ng c ph i c bao gói quy cách em h p - i v i ng nghi m ng mơi tr ng ã có nút bơng, c n dùng gi y b c ch t phía u nút l i - Chai l c ng c b c ch t ph n nút b ng gi y - Pipet c gói b t u t phía u nh gi t, cu n gi y d n theo ki u xốy trơn c cho t i h t phía u có nút bơng Các pipet có th c gói t t i vài chi c - Các a Petri c gói thành ch ng, m i ch ng t 3-5 chi c - Các d ng c khác, tu theo yêu c u mà có s bao gói cho thích h p N u h p n i h p áp l c khơng c bao gói b ng gi y th m n c mà ph i dùng lo i gi y dai, không th m n c Các d ng c bao gói ph i th t khô, s ch, tránh v h p D ng c bao gói xong ph i dán nhãn, ngày em h p ti n vi c theo dõi, s d ng N i dung t c Quan sát bi t cách s d ng máy móc nh : t nh ơn, n i h p áp l c, t s y Th c t p x lý làm nút bơng bao gói d ng c thu tinh, ti n hành s y h p kh trùng d ng c Chu n b d ng c hoá ch t Máy móc - D ng c : T nh ôn T s y N i h p áp l c D ng c thu tinh Ch i r a d ng c thu tinh a tre, v i D ng c ngâm thu tinh Giá g , gi l i Ch u r a Hoá ch t Xà phòng Dung d ch ki m Dung d ch axit HCl 0,2%; H2SO4 20%, Fenol 5%; HNO3 Dung d ch ch t oxy hoá: KmnO4 0,2%; K2Cr2O7 10% Dung d ch ch t sát trùng: lyzol 2%; credin 2% Th c t p VSV N.T.T.Th y BÀI - PH NG PHÁP S D NG KÍNH HI N VI, CÁCH LÀM TIÊU B N VÀ QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH V T Vi c nghiên c u, c u t o t bào vi sinh v t h t s c nh bé ch có th th c hi n c nh s giúp ó c a kính hi n vi Hi n nay, ng i ta ã sáng ch nhi u lo i kính hi n vi khác nh m m c ích nghiên c u rõ sâu h n v vi sinh v t Tuy nhiên ây ch nghiên c u s d ng lo i kính hi n vi quang h c – lo i kính c s d ng h u h t l nh v c có liên quan n vi sinh v t quan sát vi sinh v t d i kính hi n vi quang h c, c n làm tiêu b n t bào s ng (tiêu b n t i) tiêu b n t bào ã cc nh (ch t) M c ích – yêu c u - N m v ng c u t o c a kính hi n vi, hi u rõ nguyên t c ph ng pháp s d ng - S d ng thành th o kính hi n vi quan sát hình thái c u t o c a vi sinh v t - Th c hi n t t bi n pháp, yêu c u b o v kính hi n vi tr c sau s d ng - H c làm tiêu b n t bào vi sinh v t s ng, tiêu b n c nh nhu m màu - Làm quen v i hình thái h c c a i di n thu c nhóm vi sinh v t khác A KÍNH HI N VI QUANG H C VÀ CÁCH S D NG Kính hi n vi bao g m ba b ph n sau ây: B ph n c gi i Chân kính: Dùng kính hi n vi Khay kính: N i t tiêu b n quan sát gi a có m t l h ng ánh sáng có th i qua Trên khay có k p gi tiêu b n Khay kính có th cc nh ho c i ng theo chi u nh có c c nh c chuy n d ch n m mép d i khay kính Tr mang ng kính: b ph n dùng t ng kính Tr kính có b u ( u tr ) g n ng kính bàn xoay ng kính: ng kim lo i hình tr , phía g n th kính, phía d i g n bàn xoay có g n v t kính Ph n ng kính có th m t ng g n th kính ho c có th hai ng g n th kính Ph n có th quay c theo h ng nh vít hãm c i u ch nh: g m c v c p c vi c p Các c th c ch t i u ch nh kho ng cách gi a tiêu b n u v t kính B ph n quang h c V t kính: V t kính h th ng quang h c g m nhi u th u kính ghép l i v i B ph n quan tr ng nh t quy t nh tính n ng c a kính hi n vi (tính n ng t o nh th t c a tiêu b n) M i kính hi n vi tu theo thi t k : V t kính b i s th p, trung bình cao V t kính có b i s th p v t kính 8X; 10X; 20X; v t kính có b i s cao trung bình 40X; 60X; ho c 65X; v t kính có b i s cao 90X ho c 100X (cịn g i v t kính Th c t p VSV N.T.T.Th y u, u có m t vòng en phân bi t v i v t kính khác) v t kính có b i s th p th ng c dùng xem t i, v t kính d u th ng xem tiêu b n nhu m Th kính: c u t o g m hai th u kính ghép l i Th kính khơng có n ng l c t o nh nh v t kính mà ch y u ch c n ng c a phóng i nh v t kính thu c Thơng th ng th kính có phóng i: 7X; 10X; 15X 20X (ho c 12X, 16X…) phóng i tiêu b n quan sát s tích s c a phóng i th kính v i phóng i c a v t kính em s d ng Ví d : n u dùng v t kính d u có phóng i 90X th kính có phóng i 15X quan sát tiêu b n tiêu b n ã c phóng i lên: 90x15 = 1350 l n B ph n t p trung ánh sáng G ng ph n chi u: t d i khay kính g m hai m t lõm l i T quang kính: t d i khay kính dùng t p trung ánh sáng t g ng ph n chi u vào tiêu b n T quang kính m t ho c nhi u th u kính t o nên s t p trung ánh sáng D i h th ng th u kính b ph n ch n sáng T quang kính có th di ng lên xu ng nh có c i u n làm chuy n d ch b n l g n t quang CÁCH S D NG T th kính: t kính bàn ng n, t th có l i nh t cho ng i quan sát Khi quan sát ng i ta th ng dùng m t trái m t ph i ghi chép Ngu n sáng Có th s d ng hai ngu n sáng ngu n sáng t nhiên ngu n sáng nhân t o (ánh sáng èn) S d ng ngu n sáng t nhiên th ng ánh sáng tán x (ánh sáng gián ti p) Tránh dùng ánh sáng chi u tr c ti p có h i cho m t ánh sáng không c rõ S d ng ngu n sáng nhân t o, th ng ng i ta dùng ánh sáng c a èn i n ánh sáng c a èn d u, èn t, n n….C n dùng nh ng phi n kính l c màu t t quang kính tránh s nh h ng c a tia sáng màu vàng ho c màu nâu n màu s c th t c a nh Tr ng h p ánh sáng m nh s d ng kính m màu tr ng gi m b t c ng ánh sáng làm cho ánh sáng u Cách l y ánh sáng Hi u qu quan sát tiêu b n có quan h r t l n n cách s d ng ánh sáng S d ng t t ánh sáng có quan h n ba y u t cách s d ng ngu n sáng, s d ng g ng ph n chi u kính t quang i v i kính hi n vi có b trí kính t quang Trong tr ng h p thông th ng: dùng m t ph ng g ng ph n chi u b o m phát huy tính n ng t o nh c a kính Trong tr ng h p ánh sáng khơng có th dùng kính lõm i v i kính hi n vi khơng có b trí kính t quang nói chúng u dùng m t lõm c a g ng ph n chi u S d ng kính t quang c n n m c i m sau ây: quan sát v i v t kính b i s táp th ng m b ph n ch n sáng, h th p n m c g n nh th p nh t Th c t p VSV N.T.T.Th y 10 kính t quang Khi dùng v t kính có b i s cao h n kính t quang c ng c nâng d n lên n m c c n thi t t c chi u sáng t t, nh rõ Dùng v i v t kính d u (b i s cao) c n thi t ph i nâng kính t quang lên m c t i a có th m hồn tồn b ph n ch n sáng Xác nh tiêu i m quan sát Khi xem t i ch c n h th p ng kính g n sát xu ng tiêu b n, sau ó v n c v c p nâng t t ng kính lên, ng th i quan sát kính, n u th y ch p nh dùng c vi c p i u ch nh cho rõ nh c a tiêu b n Khi xem tiêu b n nhu m v i v t kính d u u tiên ph i xác nh tiêu i m v i v t kính b i s th p nh t Sau ó nh m t gi t d u b ch d ng (cedre) r t nh vào v trí ã c xác nh khơng làm lan r ng Do v t kính d u có phóng i l n, ng kính th u kính nh v y khơng cho d u ch có m t ph n nh ánh sáng l t vào th u kính, nh vào s khơng c rõ, d u b ch d ng có chi t su t x p x chi t xu t thu tinh ánh sáng i qua tiêu b n vào v t kính m t mơi tr ng g n nh ng nh t nên di th ng mà khơng b khúc x v y l ng ánh sáng vào nhi u, nh rõ Xoay v t kính d u cho sát xu ng tiêu b n cho u v t kính ng p d u Khi th y có ch p nh v n c vi c p t t th y rõ nh tiêu b n CÁCH B O QU N KÍNH HI N VI L y kính hi n vi h p nên dùng tay ph i, n m ch c tr kính kéo kính theo h ng n m ngang khơng ng vào thành h p; sau ó dùng tay trái chân kính mang i N u mang i xa ph i c nh ch c ch n tránh b h ng kính b l c m nh Không c s tay vào u c a v t kính th kính N u phát hi n th y v t kính, th kính b b i b n ph i dùng gi y riêng lau kính hay kh n l a lau, lau ph i nh nhàng Khi dùng xong, n u s d ng v t kính d u tr c h t ph i dùng gi y m m ho c v i l a lau nh cho s ch d u, sau ó lau l i b ng xylen ho c benzen cho h t d u u v t kính Xoay b ph n c a kính v úng ch qui nh Khơng c ánh sáng m t tr i chi u tr c ti p vào kính Khơng c tháo l p b ph n c a kính, khơng t ý cho d u vào b ph n c gi i c a kính Ph i n i khơ thống, khơng nóng, b i b n B PH NG PHÁP LÀM VÀ NHU M CÁC TIÊU B N PH NG PHÁP LÀM TIÊU B N T I KHÔNG NHU M Tiêu b n “gi t ép” Tiêu b n “gi t ép” c dùng xác nh hình thái, kích th c, x p ph ng th c sinh bào t c a t bào vi sinh v t Cách làm: Dùng m t phiên kính (lame) khơ, s ch, l y m t gi t n c vô trùng t lên gi a phiên kính Sau ó dùng que c y vơ trùng thêm vào ó m t t bào vi sinh v t hay Th c t p VSV N.T.T.Th y 11 v t li u c n nghiên c u (n c d a, s a ….), tr n u Dùng m t kính (lamella) y lên gi t dung d ch vi sinh v t (hình) Chú ý: Tránh y nhanh, m nh có th gây nên b t khí làm cho gi t d ch b n lung tung Tiêu b n “gi t treo”: c dùng quan sát s sinh s n c a vi sinh v t, s hình thành n y m m c a bào t , phát hi n kh n ng di ng m i quan h c a t bào vi sinh v t v i kích thích hố h c Cách làm: Dùng que c y u tròn l y m t gi t d ch huy n phù vi sinh v t t lên kính s ch khơ Bơi m t l p vaz lin m ng quanh ch lõm phi n kính có th g n ch t kính bên trên, tránh khơ d ch quan sát Quay ng c kính xu ng phía d i t lên m t phi n kính lõm cho gi t d ch n m úng ch lõm Tiêu b n v t: Dùng nghiên c u s phân b t nhiên c a t bào khu n l c vi sinh v t, hình thái bào t & cu ng sinh bào t x khu n, n m m c Cách làm: Cách 1: dùng kính ép nh lên m t ám vi sinh v t m c dày c hay phía m t khu n l c riêng r t tiêu b n ã nh n c lên m t phi n kính ã có s n m t gi t n c hay m t gi t dung d ch xanh metylen 1/40 Cách 2: có th dùng phi n kính ép nh lên b m t c a vi sinh v t ho c b m t c a khu n l c L y làm tiêu b n “v t” PH NG PHÁP LÀM TIÊU B N NHU M M c ích: có th quan sát m t rõ ràng h n ho t ng s ng c a t bào vi sinh v t Cách làm: gi ng nh tiêu b n “gi t treo” ho c “gi t ép”, nh ng cho thêm dung d ch thu c nhu m xanh metylen …% PH NG PHÁP C NH VÀ NHU M MÀU TIÊU B N C nh nhu m màu tiêu b n dùng quan sát k ph n c u trúc c a t bào Nh ng tiêu b n có tác d ng b o t n tiêu b n c a m t lo i hình vi sinh v t ó cho nghiên c u v sau Vi c chu n b tiêu b n g m b c: chu n b v t bôi, làm khô, c nh nhu m màu (hình) Chu n b v t bơi: t v t li u nghiên c u lên m t phi n kính s ch theo ki u làm gi t ép, dùng que c y dàn u v t li u di n tích 1-2cm2 Th c t p VSV N.T.T.Th y 12 Làm khô v t bôi: Tiêu b n c làm khơ khơng khí, n u khơ ch m có th h phiên kính lên phía cao c a ng n l a èn c n Tránh làm q nóng v t bơi n u nh v y vi sinh v t s b bi n d ng C nh: M c ích - G n t bào vi sinh v t lên phi n kính - Tránh b r a trơi - Làm cho v t bôi d b t thu c nhu m t bào ch t d nhu m màu h n t bào s ng, an tồn s d ng v t bơi h n, nh t s d ng vi sinh v t gây b nh Nhu m màu: - Ng i ta chia lo i thu c nhu m thành hai lo i: thu c nhu m axit thu c nhu m baz - T bào vi sinh v t c nhu m màu ch y u b ng thu c nhu m baz - Thu c nhu m axit g m: eozin, eritrozin, nigrozin, fuchsin zit…, chúng liên k t ch t ch v i cá thành ph n t bào ch t (có tính baz ) c a t bào - Thu c nhuôm baz : xanh metylen, fuchsin ki m, tím gentian, tím k t tinh, safranin…., chúng liên k t v i thành ph n ch t nhân (có tính axit) c a t bào - Ng i ta chia cách nhu m: nhu m n nhu m phân bi t a Nhu m n: có th quan sát tồn b hình d ng kích th nhu m nh : xanh metylen, fuchsin, tím getian c t bào Dùng thu c b Nhu m phân bi t: dùng nhu m phân bi t nghiên c u m t s c u trúc t bào, c tính xác nh vi sinh v t Cách làm: i v i nhu m n nhu m phân bi t: - t phi n kính ã cc nh giá thu tinh - Nh 1-2 gi t thu c nhu m lên tiêu b n - R a nh tiêu b n b ng n c t i th y n c c Nhu m Gram (nhu m kép) D a vào s khác v thành ph n hoá h c thành t bào c a t bào vi khu n S d ng ph i h p lo i thu c nhu m phân bi t s khác ó Cách làm (hình…) N i dung t ng trình - Làm tiêu b n t i khơng nhu m nhu m i v i loài vi sinh v t nhóm: + Vi khu n (Sarcina, Staphylococcus, Bacillus subtilis, E.coli) + N m men: (Saccharomyces cerevisiae) + N m m c (Mucor, Aspergillus, Rhizopus) - Miêu t hình thái lo i vi khu n Th c t p VSV N.T.T.Th y 13 - Miêu t hình thái s n y ch i c a n m men - Miêu t hình thái c quan mang bào t b o t c a n m m c - Nhu m Gram i v i lo i vi khu n V hình thái xác nh s b t màu c a chúng Chu n b d ng c hoá ch t D ng c Kính hi n vi, d u soi kính Que c y trịn nh n Phi n kính th ng lõm, kính èn c n Giá ch u thu tinh Hoá ch t Xanh metylen axit phenic C n 96o Tím gentian KI I2 Axeton Safranin Fucshin Th c t p VSV N.T.T.Th y 14 BÀI - MÔI TR NG NUÔI C Y VÀ PH NG PHÁP PHÂN L P VSV MÔI TR NG NUÔI C Y Kh n ng t ng h p cách th c thu nh n n ng l ng khác tu thu c vào m i lo i vi sinh v t Do v y nhu c u v ch t dinh d ng c a chúng c ng khác Môi tr ng dinh d ng c n thi t cho vi c ni c y tích lu , phân l p, b o qu n gi ng c ng nh nuôi c y v i m c ích nghiên c u trình trao i ch t ho c thu nh n s n ph m trao i ch t có giá tr vi sinh v t Môi tr ng dinh d ng c n ph i ch a ng t t c thành ph n c n thi t i v i trình hình thành c u trúc n ng l ng c a t bào ó ngu n dinh d ng cacbon, nitrogen, nguyên t khống ngun t vi l ng Tuy nhiên mơi tr ng ph i có i u ki n lý, hoá phù h p v i i u ki n s ng c a vi sinh v t ó nh : pH, th oxy hoá kh , n ng ch t, thống khí… A CÁC LO I MÔI TR NG C n c vào thành ph n, ngu n g c ch t dinh d ng có mơi tr ng Mơi tr ng t nhiên: Mơi tr ng hình thành t s n ph m có ngu n g c ng v t ho c th c v t nh : n c ép rau, qu , t ch c mô c ng v t, màu pha loãng, s a, … ho c có th n c chi t thu c ch t o t c ch t t nhiên nh th t, phân, t, b ph n c a th c v t … Trên môi tr ng t nhiên, nhi u lo i vi sinh v t phát tri n r t t t có ch a nhi u thành ph n dinh d ng c n thi t cho s sinh tr ng phát tri n c a vi sinh v t Tuy nhiên mơi tr ng có thành ph n hóa h c ph c t p, không n nh, không thu n l i cho vi c nghiên c u sinh lý, trao i ch t c a vi sinh v t Các môi tr ng t nhiên ch y u c dùng nic c y tích lu sinh kh i ho c nh tên vi sinh v t Môi tr ng t ng h p: Môi tr ng c hình thành t h p ch t hố h c tinh t, c xác nh l y v i nh ng n ng phù h p u i m: bi t rõ thành ph n s l ng thành ph n a vào môi tr ng nên có th nghiên c u c nhu c u c ng nh s chuy n hoá c a chúng thành s n ph m trao i ch t t ng ng Nh c i m: giá thành cao Môi tr ng bán t ng h p: Thu c lo i mơi tr ng t nhiên có thành ph n không xác nh Trong thành ph n c a chúng, h p ch t ã rõ b n ch t hố h c cịn có c nh ng ch t ch a bi t rõ thành ph n Môi tr ng c s d ng ph bi n vi sinh v t h c công nghi p thu nh n axit amin, vitamin s n ph m quan tr ng khác ho t ng s ng c a vi sinh v t Th c t p VSV N.T.T.Th y 15 C n c v công d ng c a môi tr ng Phân lo i thành môi tr ng: môi tr ng ch n l c môi tr ng chu n óan phân bi t Mơi tr ng c s : môi tr ng c s d ng r ng rãi nh t c s c a mơi tr ng có th t o môi tr ng c n dùng khác Môi tr ng c s th ng th y nh t môi tr ng n c pepton, môi tr ng n c th t pepton Môi tr ng ch n l c: Môi tr ng m b o s phát tri n th c a m t loài hay m t nhóm vi sinh v t ó thu n l i ho c hoàn toàn b t l i i v i d phát tri n c a vi sinh v t khác Các môi tr ng ch n l c ch y u c s d ng phân l p vi sinh v t t môi tr ng sinh s ng t nhiên c a chúng ho c dùng ni c y tích lu Mơi tr ng chu n ốn phân bi t (mơi tr ng ch th ) Cho phép phân bi t nhanh loài vi sinh v t v i loài vi sinh v t khác Thành ph n c a mơi tr ng ph i tính tốn, ch n l a cho phát hi n c rõ ràng c i m c a lồi ó Các mơi tr ng ch th c dùng vi khu n h c lâm sàng, nghiên c u di truy n h c nh tên vi sinh v t C n c vào tr ng thái v t lý c a môi tr ng C n c vào tr ng thái v t lý c a môi tr ng, có th phân bi t thành d ng sau: Môi tr ng l ng: H p thành s hoà tan ch t dinh d ng c n thi t n c nh môi tr ng n c th t, n c pepton, n c lo i c , qu nh carot, su hào, khoai tây, giá … Môi tr ng c ng d ng phát hi n c i m sinh lý – sinh hố c a vi sinh v t, tích lý sinh kh i ho c s n ph m trao i ch t, gi gi ng b o qu n nhi u lo i vi sinh v t không phát tri n t t môi tr ng c Mơi tr ng bán l ng: c hình thành c s c a môi tr ng l ng có b sung m t s ch t làm ông giúp cho môi tr ng c l i nh ng có ơng Mơi tr ng bán l ng dùng theo dõi s di ng c a vi khu n Mơi tr ng r n: Hình thành c s c a mơi tr ng l ng có b sung ch t làm ông nhi u h n môi tr ng bán l ng nh m t ng ông c ng c a môi tr ng Môi tr ng c ng d ng tách gi ng thu n t, nghiên c u nh tên (xác nh hình thái khu n l c, c i m sinh tr ng th ch nghiêng…), gi gi ng, m s l ng vi sinh v t, xác nh tính i kháng c a vi sinh v t nhi u tr ng h p khác Môi tr ng x p: c ng d ng vi sinh v t h c công nghi p Thu c lo i có kê n u nh , cám, cát th ch anh th m dung d ch dinh d ng Th c t p VSV N.T.T.Th y 16 B CÁCH PHA CH CÁC LO I MÔI TR NG i v i lo i môi tr ng khác nhau, cách ch t o có nh ng quy t c chung gi ng Quy trình pha ch mơi tr ng Ph i h p hoà tan nguyên li u Cân xác ngun li u mơi tr ng theo l ng ã nh Cho vào d ng c n u: - N u ch môi tr ng l ng un ý b sung l ng n c b c h i - N u ch mơi tr ng r n: cân xác hố ch t (t l ng nh nh t t i l ng t ng d n), xác nh l ng thách c n cho B sung n c cho t i th tích u c u Ngốy u un b p cho tan th ch Chú ý ngoáy u tránh b t khí phía b cháy phía d i Ki m tra pH Có th dùng máy o pH ho c so màu C n c vào pH ã c xác nh, i u ch nh pH c a môi tr ng theo úng yêu c u nuôi c y Thông th ng i u ch nh pH c a mơi tr ng cao h n só v i yêu c u m t chút theo kinh nghi m, môi tr ng sau kh trùng pH s b h th p (môi tr ng th ch r n h p pH h 0,4; môi tr ng th ch m m h 0,2; môi tr ng l ng h 0,1 Mu n i u ch nh pH th ng dùng dung d ch HCl, NaOH, H2SO4, NaHCO3… pha v i n ng xác nh L c phân ph i mơi tr ng Có th dùng gi y l c, v i xô, ho c l c b ng thi t b l c chân không Phân ph i môi tr ng vào d ng c c n làm Chú ý l ng môi tr ng không v t t l cho phép so v i dung tích v t ch a tránh b trào - Khi h p th ch nghiêng khơng q 1/4 dung tích ng - Khi h p th ch ng khơng q 2/3 dung tích ng - Khi h p th ch bình tam giác, l ng môi tr ng không v t 2/3 dung tích bình Kh trùng Thơng th ng kh trung n i h p áp l c Nhi t th i gian kh trùng tu thu c vào c tính c a mơi tr ng ó Do k n ng d bi n i c tính hố h c c a mơi tr ng có m t ch t q trình kh trùng, ta có th h p riêng r m t s ch t, sau ó k t h p l i v i tr c dùng nuôi c y M t s môi tr ng d b phá h y nhi t cao, có th dùng ph ng pháp gián o n (ph ng pháp tyndal) x lý Ki m nh Sau h p kh trùng, t môi tr ng t nh ôn nhi t 300 C Sau 2448h n u không th y vi sinh v t xu t hi n t yêu c u B o qu n Môi tr ng c ki m nh n u ch a dùng phi b o qu n nhi t th p tránh ánh sáng giúp mơi tr ng khơng b khơ, khơng b oxy hố ho c có nh ng bi n i v pH, ng th i gi cho môi tr ng không b nhi m t p Chú ý: th i gian BQ không dài Th c t p VSV N.T.T.Th y 17 CÁCH PHA CH M T S LO I MÔI TR NG Cách pha ch m t s lo i môi tr ng Môi tr ng t nhiên Môi tr ng canh th t – pepton (MPB): môi tr ng nuôi c y vi sinh d d ng Cách làm: Th t (lo i b x ng, m , gân) xay nh : 500g + lít n c -> l c l y n c -> un sôi > l c -> b sung n c t i m c ban u -> b sung 0.5% NaCl + 1% pepton -> kh trùng 1atm/20-30 phút Môi tr ng m ch nha: môi tr ng t t v i lo i vi khu n lactic, vi khu n axetic, n m men, n m m c lo i vi sinh v t d d ng th ng dùng ng làm ngu n cacbon ngu n nguyên li u n ng l ng Cách làm : i m ch n y m m (thóc n y m m) xay nh : 250g + n c : lít -> un nóng -> nâng nhi t -> ng hố h t tinh b t (khơng có phán ng màu v i thu c th Iod) -> l c -> o n ng dung d ch ng ( Balling - oB) N ng ng n c m ch nha m i th ng t 16-18oB Mu n có n ng c n thi t, ta dùng n c s ch pha loãng + i v i n m m c, n ng 3-4oB + i v i men, n ng 6-8oB + i v i vi khu n lactic, n ng 8-12oB N c m ch nha c kh trùng 0,5atm/20-30 phút Môi tr ng khoai tây: c s d ng ch y u phân l p ni c y lồi gi ng Clostriodium i di n vi khu n phân gi i tinh b t khác Cách làm Khoai tây g t v , c t nh : 200 g + lít n c -> un sơi (15 phút) -> phân ph i vào d ng c nuôi c y -> kh trùng (1,5 atm/30 phút) -> CaCO3 môi tr ng nuôi c y Môi tr ng t ng h p Môi tr ng Hansen : s d ng Nguyên li u (g/l) Glucose(maltose, saccharose) Th ch : 20g MgSO4 : 2-5g Cách làm Hoà tan h n h p nguyên lieu 121oC/15 phút nuôi c y n m men : 50 g Pepton pH :… n : 10g KH2PO4 : 3g c, un cho tan h t th ch, h p kh trùng, Mơi tr ng Saburaud PH NG PHÁP NI C Y PHÂN L P VI SINH V T Trong công tác nghiên c u vi sinh v t: c y, phân l p có t m quan tr ng l n công tác b o t n gi ng, t o nh ng gi ng thu n ch ng hay gi ng m i Th c t p VSV N.T.T.Th y 18 Trong môi tr ng m i, vi sinh v t phát tri n t t, t ng nhanh v s l ng t bào Tuy nhiên sau m t th i gian ngu n dinh d ng c n d n, s tích lu s n ph m c a trình trao i ch t t ng lên gây tác d ng c ch vi sinh v t th m chí cịn thay c tính ho c gây ch t t bào Do v y nên c n c y truy n sang môi tr ng m i Qua phân l p ng i ta có th sàng l c c ch ng lo i vi sinh v t riêng bi t Trên c s nh n bi t thu n ch ng gi ng theo yêu c u c a ng i PH NG PHÁP PHÂN L P Dùng ph ng pháp c y th ch a nh m t o nh ng khu n l c riêng r , thu n l i cho vi c nh n xét, phân bi t hay ch n l c ch ng vi sinh v t có m u Ph ng pháp phân l p c ti n hành theo b c sau: L ym u Tu theo m u em phân l p mà có cách l y m u kh i l ng m u l y khác C n b o m i u ki n chung - S l ng ph i phân l p ti n hành phân tích ch tiêu khác (n u c n) - Ph i ghi rõ ràng th i gian a i m l y m u phân l p - Th i gian l y m u ti n hành nhanh - Chú ý công tác vơ trùng ch n l c m u có tính i di n X lý m u M u r n: Bao g m m u t, m u th c n b t, m u th t….Cân xác 10g m u cho vào c i vơ trùng nghi n k , sau ó pha lỗng t i 100ml b ng n c c t vô trùng L c u hút l y 1ml d ch m u làm b c pha loãng ti p theo M u l ng: không c n x lý tr c, ch c n hút l y 1ml d ch m u pha loãng Ph ng pháp pha loãng m u c y Chu n b dãy ng nghi m ch a 9ml n c vô trùng ho c dung d ch NaCl 9% vô trùng, s l ng ng tu theo s c oán s vi sinh v t m u nhi u hay Cách làm (hình) Chú ý: chuy n chuy n sang n ng m i, c n thay pipet C y môi tr ng th ch a: môi tr ng ã c chu n b ki m nghi m t tr c C y t pha loãng ó ph thu c vào s l ng vi sinh v t có Dùng pipet vơ trùng l y m t th tích nh t nh (th ng 0,05; 0,1; 0,2 ml) d ch có pha loãng t ng ng, c y lên b m t th ch có ch a a Petri, dùng que g t dàn u lên kh p b m t mơi tr ng T m i pha lỗng c n l p l i t 3-5 l n M i l n ch s d ng pipet que g t vô trùng Các a ch a môi tr ng ã c y c t vào t nh ôn v i nhi t thích h p theo dõi s phát tri n c a vi sinh v t c n phát hi n Nói chúng, sau 24 gi , vi sinh v t ã sinh tr ng phát tri n t t, hình thành khu n l c môi tr ng m b o cho vi sinh v t m c h t, có th xác nh Th c t p VSV N.T.T.Th y 19 th i gian nuôi c y nh sau: vi khu n 36-48 gi , n m men 48-72 gi , n m m c 96120 gi N i dung th c t p t ng trình Ph n làm mơi tr ng - Chia thành nhóm th c t p làm môi tr ng: canh th t Pepton, môi tr ng khoai tây, môi tr ng Hansen môi tr ng Saburaud - Ti n hành môi tr ng th ch nghiêng, th ch a i v i môi tr ng Hansen Saburaud - Nêu tóm t t cách làm mơi tr ng xác nh hi u qu kh trùng môi tr ng D ng c , hoá ch t nguyên li u D ng c C c n u: 1000ml, 500ml, 250ml Ph u thu tinh H p l ng ng nghi m: 16x160ml Bình tam giác: 100ml, 200 ml, 250ml Bình nh m c: 250ml, 500ml, 1000ml èn c n a thu tinh H p so màu pH k B p i n N i h p áp l c Hoá ch t nguyên li u Dung d ch axit: HCl 0,1N ho c H2SO4 0,1N K2SO4 KH2PO4 Dung d ch baz : NaOH 0,1N ho c NaHCO3 0,1N MgSO4.7H2O NaCl CaCO3 ng Glucose Pepton Th ch Ph n phân l p - Chia thành nhóm th c t p phân l p vi sinh v t mơi tr ng r n: Bánh biscuit, thóc, m ; môi tr ng l ng: n c sinh ho t, n c d a chua, s a t i - - Ti n hành làm ng nghi m có ch a dung d ch n c mu i sinh lý ti t trùng pha loãng m u - Theo dõi s xu t hi n khu n l c kh n ng phát tri n c a chúng Xác nh c i m hình thái khu n l c c ng nh hình thái t bào V hình minh ho Th c t p VSV N.T.T.Th y 20 ... a vi sinh v t tránh làm ch t vi sinh v t, tr c h t ph i áp que c y vào m t c a d ng c thu tinh ho c vào ph n môi tr ng ch a vi sinh v t cho ngu i r i m i dùng l y m t l ng nh sinh kh i vi sinh. .. tay… u ln có m t l ng r t l n lo i vi sinh v t, v y c n ph i quan tâm t i vi c gi thu n t gi ng vi sinh v t dùng nghiên c u Khi làm vi c phịng thí nghi m vi sinh v t h c, c n ph i tuân ch nghiêm... C U I V I CÔNG VI C TRONG PHỊNG THÍ NGHI M VSV CÁCH S D NG MÁY MÓC – CÁCH BAO GÓI D NG C THU TINH Các nhà vi sinh v t h c làm vi c ch y u v i gi ng vi sinh v t thu n t ó th h sinh t nh ng t bào

Ngày đăng: 14/08/2014, 01:20

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan