báo cáo thực tập vi sinh

Phương pháp cấy vi sinh vật trên môi trường thạch đĩa và ống thạch.... Các quy tắc an toàn trong phòng thí nghiệm: - Nắm vững nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật - Không ăn

MỤC LỤC

Bài 1: Hướng dẫn sử dụng các dụng cụ, thiết bị vi sinh và các quy tắc trong

phòng thí nghiệm 2

Bài 2: Cách sử dụng kính hiển vi và cách làm nút bông ống nghiệm, bình tam giác, bao gói và thanh trùng dụng cụ vi sinh 3

Bài 3: Quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn ( thịt lợn, bò) 4

Bài 4: Quan sát hình dạng vi khuẩn lactic ( nước dưa, sữa chua) 6

Bài 5: Quan sát vi khuẩn nốt sần 8

Bài 6: Quan sát hình dạng tế bào nấm mốc, nấm men 10

Bài 7: Nhuộm đơn vi khuẩn 12

Bài 8: Nhuộm đơn nấm mốc 14

Bài 9 - 10: Nhuộm kép đối với vi khuẩn Gram – và Gram + 16

Bài 11: Kiểm tra quan sát mẫu vi sinh vật 18

Bài 12: Lên men sữa chua 19

Bài 13: Phương pháp chuẩn bị môi trường lỏng và đặc để phân tích chỉ tiêu VSV Phương pháp cấy vi sinh vật trên môi trường thạch đĩa và ống thạch 21

Bài 14: Phương pháp phân lập và chọn giống vi sinh vật 26

Bài 15: Phân tích chỉ số E Coli, Coliforms và Fecal coliforms bằng phương pháp CFU 28

Bài 16: Phân tích chỉ số vi sinh vật – phân tích tổng coliform bằng 30

phương pháp MPN 30

Tổng kết: 31

Tài liệu tham khảo 32

Bài 1: Hướng dẫn sử dụng các dụng cụ, thiết bị vi sinh và các quy tắc trong

phòng thí nghiệm

1 Các quy tắc an toàn trong phòng thí nghiệm:

- Nắm vững nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật

- Không ăn uống, hút thuốc trong phòng thí nghiệm, mang khẩu trang khi thaotác với vi sinh vật

- Mặc áo blouse trong thời gian làm thí nghiệm

- Cần ghi chú tên chủng, ngày, tháng làm thí nghiệm lên tất cả các hộp petri,ống nghiệm môi trường, bình nuôi cấy

- Khi lỡ tay làm đổ, nhiễm vi sinh vật ra nơi làm việc, dùng khăn giấy tẩmchất diệt khuẩn lau kĩ, sau đó thực hiện khử trùng lại bàn làm việc

- Cẩn thận khi thao tác với đèn cồn Tắt ngọn lửa khi chưa có nhu cầu sử dụnghoặc ngay sau khi thực hiện xong mỗi thao tác

- Khi làm vỡ dụng cụ thủy tinh, cẩn thận mang găng tay thu gom tất cả cácmảnh vỡ vào một túi rác riêng

- Không mở hộp petri và dùng mũi ngửi để tránh nhiễm vi sinh vật vào đường

hô hấp

- Khi đốt que cấy có dính sinh khối vi sinh vật, cần đặt vòng hoặc đầu que cấyvào chân ngọn lửa để tránh sự văng nhiễm vi sinh vật vào không khí

- Sát trùng và rửa sạch tay bằng xà phòng trước khi rời phòng thí nghiệm

2 Một số dụng cụ và thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh:

- Tủ ẩm: Dùng để ủ vi sinh vật hoặc theo dõi sự tăng trưởng của chúng

- Nồi hấp: Để tiêu diệt cả tế bào dinh dưỡng lẫn bào tử của vi sinh vật

- Tủ sấy: Sấy khô dụng cụ thủy tinh hoặc để khử trùng bằng phương phápnhiệt khô

- Tủ cấy vô trùng: Đảm bảo tính vô trùng cao khi thao tác với vi sinh vật

Bài 2: Cách sử dụng kính hiển vi và cách làm nút bông ống nghiệm, bình tam giác, bao gói và thanh trùng dụng cụ vi sinh

1 Kính hiển vi:

Kính hiển vi dùng để quan sát vi sinh vật Kính hiển vi cần được đặt nơi tránh bụi,

ẩm, chấn động Để tránh bị két dầu soi hoặc bị mốc kính thì sau khi dùng kính vớidầu soi, dùng giấy lau kính chuyên dụng Khi không dùng kính cần phải đậy kínlại

2 Bao gói dụng cụ:

a Cách làm nút bông:

- Với các ống nghiệm

- Lấy một ít bông không thấm nước cuộn tròn lại

- Dùng que ấn vào giữa cuộn bông

- Đẩy cuộn bông này gập đôi và từ từ vào miệng ống nghiệm

- Với các chai lọ, bình tam giác có kích thước lớn: Làm tương tự nhưng sửdụng lượng bông nhiều hơn

- Bật công tắc tủ hoạt động

- Điều chỉnh thời gian và nhiệt độ thích hợp

- Tắt tủ sấy, để nguội tới 60oC rồi mở tủ lấy dụng cụ ra

- Thịt lợn, bò (không rửa) ngâm vào 30 ml nước để trong 24 giờ

- Nước canh thiu

- Đốt đèn cồn, hơ que cấy ( nghiêng 45°) trên ngọn lửa đèn cồn để thanh trùng

- Dùng que cấy lấy mẫu thịt lợn, thịt bò, canh thiu vào giữa 3 lame, ghi tên mỗiloại lên lame

- Hơ lại que cấy

- Để vết bôi khô tự nhiên trong không khí

Chú ý:

- Lượng vi sinh vật lấy vừa phải

- Vết bôi tròn gọn, thật mỏng

- Các tế bào vi sinh vật được dàn đều dễ quan sát.

b Cố định vết bôi

- Dùng kẹp gỗ hoặc kẹp sắt kẹp lame

- Hơ mặt dưới của lame trên ngọn lửa đèn cồn, tránh không để quá nóng

- Việc cố định vết bôi nhằm các mục đích giết chết vi sinh vật để dễ dàng quansát, tránh khỏi các vi sinh vật độc hại

Tên vi khuẩn: chostridium

Mô tả hình dạng: hình bầu dục,hình que, không rõ nhân, màng nhày rộng

Bài 4: Quan sát hình dạng vi khuẩn lactic ( nước dưa, sữa chua)

- Hơ lại que cấy

- Để vết bôi khô tự nhiên trong không khí

- Hơ mặt dưới của lame trên ngọn lửa đèn cồn, tránh không để quá nóng

- Việc cố định vết bôi nhằm các mục đích giết chết vi sinh vật để dễ dàngquan sát, tránh khỏi các vi sinh vật độc hại

Tên vi khuẩn: Latic

Mô tả hình dạng:

- Nước dưa: liên cầu khuẩn, quan sát thấy hình que, sợi

- Sữa chua: song cầu khuẩn tròn,trắng liên kết nhóm 2 hoặc 3

Bài 5: Quan sát vi khuẩn nốt sần.

- Rửa lại bằng dung dịch sát khuẩn HgCl2 0.1% trong 5 phút

- Rửa lại bằng nước sạch

- Lấy kẹp sắt ( lau sạch bằng cồn) hơ trên ngọn lửa đèn cồn, dầm nốt sần ranước, khi đó vi khuẩn nốt sần sẽ tan trong nước

- Dùng que cấy đã thanh trùng lấy mẫu lên phiến kính

- Để mẫu khô tự nhiên trong không khí.

- Hơ hộp petri trên ngọn lửa đèn cồn ( xoay vòng quanh)

- Thanh trùng miệng ống đựng nước cất, đổ khoảng 5-7 giọt vào hộp petri,đậy nắp ống

- Hơ que cấy ở 45°C đến khi đầu que cấy đỏ để vi sinh vật chết hết

- Cho que cấy vào hộp petri để giảm nhiệt độ

- Lấy mẫu, mở hộp petri, để mẫu vào chỗ có nước ( hé miệng hộp)

- Thanh trùng lại hộp, cho vào bao giấy, bảo quản

II/ Kết quả - Nhận xét

Mô tả hình dạng: Có mầu xanh lá Đơn cầu khuẩn hình tròn, ovan, màng nhầyrộng, khó quan sát

Bài 6: Quan sát hình dạng tế bào nấm mốc, nấm men.

- Mẫu ngô, cơm: lấy những hạt ngô, cơm đã lên mốc, hòa vào trong nước

- Mẫu nho: lấy một giọt nước lên phiến kính, dùng que cấy đã thanh trùng, lấymột ít nước phết lên phấn nho

- Hơ lại que cấy

- Để vết bôi khô tự nhiên trong không khí

- Việc cố định vết bôi nhằm các mục đích giết chết vi sinh vật để dễ dàngquan sát, tránh khỏi các vi sinh vật độc hại.

c Quan sát hình dạng vi khuẩn

- Chỉnh vật kính ở 4X và soi lần lượt ba mẫu mốc cơm, mốc ngô và nho.II/ Kết quả - Nhận xét

Mốc cơm Mốc nhoHình vẽ:

Bài 7: Nhuộm đơn vi khuẩn.

- Hơ lại que cấy

- Để vết bôi khô tự nhiên trong không khí

- Nhỏ vào vết bôi vài giọt Xanh metylen và Fucshin, đế yên 1-2 phút

- Rửa vết bôi bằng cách nghiêng lame, dùng bình tia xịt nước cho chảy nhẹqua vết bôi cho đến khi mất màu ở tiêu bản

- Hơ nhẹ tiêu bản trên đèn cồn

- Quan sát tiêu bản ở vật kính X40 và X100 dùng dầu soi

b Quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn.

- Quan sát tiêu bản ở vật kính X40 và X100 dùng dầu soi.II/ Kết quả - Nhận xét

Thịt bòNhận xét: vi khuẩn bắt mầu xanh, hình bầu dục

Bài 8: Nhuộm đơn nấm mốc.

- Hơ lại que cấy

- Để vết bôi khô tự nhiên trong không khí

- Nhỏ vào vết bôi vài giọt Xanh metylen và Fucshin, đế yên 1-2 phút

- Rửa vết bôi bằng cách nghiêng lame, dùng bình tia xịt nước cho chảy nhẹqua vết bôi cho đến khi mất màu ở tiêu bản

- Hơ nhẹ tiêu bản trên đèn cồn

Chú ý:

- Lượng vi sinh vật lấy vừa phải

- Vết bôi tròn gọn, thật mỏng

- Các tế bào vi sinh vật được dàn đều dễ quan sát

b Quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn

- Quan sát tiêu bản ở vật kính X40 và X100 dùng dầu soi.

II/ Kết quả - Nhận xét

Mốc cơm

Nhận xét: bắt mầu xanh dương, mốc có hình dạng que có đầu tròn chứa bào tử

Bài 9 - 10: Nhuộm kép đối với vi khuẩn Gram – và Gram +

xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung Vi sinh vật có phức chất nàythuộc loại gram âm

2 Nguyên liệu – Dụng cụ thí nghiệm

a Làm tiêu bản ( tạo vết bôi)

- Dùng que cấy lấy nước vô trùng để 2 vết bôi trên lame kính

- Dùng que cấy lấy một ít sinh khối làm vết bôi theo thứ tự:

+ Bên trái là nấm men

+ Bên phải là nấm mốc

- Để khô vết bôi trong không khí hoặc cố định nhẹ trên đèn cồn

b Nhuộm tiêu bản

- Nhuộm bằng thuốc tím geltian từ 1-2 phút

- Rửa bằng nước đến khi trôi hết màu, để khô

- Nhuộm bằng dung dịch Lugol từ 1-2 phút

- Rửa nước, để khô.

- Tẩy màu bằng cồn trong khoảng 20 giây, để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từnggiọt đến khi mất màu

- Rửa lại bằng nước

- Nhuộm bổ sung Fuchsin từ 30-60 giây

- Rửa bằng nước, để khô

c Quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn

- Quan sát tiêu bản ở vật kính X40 và X100 dùng dầu soi

II/ Kết quả - Nhận xét

Thịt lợnNhận xét: mẫu bắt mầu hồng tím, hình que, sợi dài

Bài 11: Kiểm tra quan sát mẫu vi sinh vật.

Bài 12: Lên men sữa chua.

- B4: Cho vào 2 hộp sữa chua

- B5: Khuấy đều, tránh tạo bọt, cho ra cốc và đậy nắp lại

- B6: Cho vào tủ ủ ở 40oC trong một khoảng thời gian rồi mang đi ủ lạnh.II/ Kết quả - Nhận xét

- Sữa chua ủ trong 4 giờ: đã đông đặc, mầu trắng đục có vị chua ngọt đậm

- Sữa chua ủ trong 6 giờ: đã đông đặc, mầu trắng đục có vị chua hơn sữa chua4giờ, mùi chua nhẹ

- Sữa chua ủ trong 8 giờ: đã đông đặc, mầu trắng đục vị chua ngọt vừa phải,mùi chua nhẹ

- Đã làm thành công sữa chua

- Đưa ra được thời gian ủ phù hợp

Men

giống

Thời gian ủ(30 0 C)

Màu sắc Độ đục Độ ngọt Độ chua Mùi

Bài 13: Phương pháp chuẩn bị môi trường lỏng và đặc để phân tích chỉ tiêu VSV Phương pháp cấy vi sinh vật trên môi trường thạch đĩa và ống thạch.

- Bếp điện, xoong, muôi

- Đũa thủy tinh, nồi hấp thanh trùng

- Tủ sấy, tủ ấm

- 6 ống nghiệm ( 2 ống cấy nấm men, 2 ống cấy nấm mốc, 2 ống cấy vikhuẩn)

- Đĩa petri ( thanh trùng, bọc giấy)

- Môi trường nuôi cấy

- Nước cất

1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

a Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

Môi trường cao thịt – Pepton

b Môi trường nuôi cấy nấm men

- Cho thêm 2- 5g dịch chiết của nấm men

Môi trường Hansen.

Môi trường Czapek.

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

- B1: Cân hóa chất cho các môi trường vào 3 bình tam giác khác nhau

- B2: Cho vào mỗi bình 250ml nước cất, khuấy đều

- B3: Đặt các bình tam giác có chứa môi trường vào bếp điện đun, dùng đũathủy tinh khuấy thường xuyên

- B4: Đung dung dịch đến khi dung dịch lăn tăn sôi thì dừng

- B5: Để nguội dung dịch vừa đun về khoảng 40oC

- B6: Rót dung dịch môi trường vào ống nghiệm (chiếm khoảng 1/3 ống)

- B7: Đậy nút bông vào ống nghiệm và bình tam giác, để nghiêng ốngnghiệm, đem đi thanh trùng cùng với đĩa peptri đã bao gói

- B1: Lau cồn bàn của tủ thanh trùng, tay, để khô

- B2: Châm đèn cồn, thanh trùng que cấy

- B3: Hơ nhẹ miệng đĩa peptri có chứa mẫu trên đèn cồn

- B4: Dùng que cấy đã thanh trùng để lấy mẫu

- B5: Mở nút ống nghiệm, hơ nhẹ miệng ống nghiệm có chứa môi trường

- B6: Cho que cấy vào ống nghiệm, cấy theo hình zik zak từ trên xuống

- B7: Thanh trùng que cấy, đậy nút ống nghiệm, ghi rõ loại vi sinh vật, ngày

- B8: Để vào tủ ủ ở 30oC

b Trong đĩa peptri

Cấy nấm men và vi khuẩn

- B1: Đun nóng dung dịch môi trường của vi khuẩn và nấm men trong bìnhtam giác đã thanh trùng

- B2: Để nguội dung dịch xuống khoảng 40oC

- B3: Hơ nhẹ miệng bình tam giác và đĩa peptri

- B4: Mở nhẹ đĩa peptri, đổ dung dịch vào đĩa, dày khoảng 0,3-0,5cm

- B5: Thanh trùng miệng bình tam giác, đậy nút bông lại

- B6: Lắc cho dung dịch tràn đều trên đĩa peptri rồi để thạch đông đặc

- B7: Cấy vi sinh vật (quy trình giống như cấy trong ống nghiệm)

- B8: Đặt đĩa peptri ngược lại và cho vào tủ ủ

II/ Kết quả - Nhận xét

Sau 2 ngày ta có kết quả nuôi cấy

Có mầu trắng đục phát triển tốt

2 Nấm mốc

Có ba mầu vàng trắng đen phát triển tốt

3 Vi khuẩn

Có mầu trắng đục phát triển tốt

Bài 14: Phương pháp phân lập và chọn giống vi sinh vật.

Phương pháp giữ giống VSV và cấy truyền VSV

I/ Cơ sở lý thuyết

Vi khuẩn nốt sần thuộc loại háo khí, ưa pH trung tính hoặc hơi kiềm, phát triển tốt

ở nhiệt độ 28-30oC, độ ẩm 60-80%

a Chuẩn bị

Bảng : Hóa chất chuẩn bị cho môi trường Pochon nuôi cấy vi khuẩn nốt sần

I.Tiến hành

a Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Bước 1: Cân hóa chất cho vào bình tam giác

- Bước 2: Thêm vào 250ml nước cất, dùng đũa thủy tinh khuấy đều

- Bước 3: Đun dung dịch trên bếp điện, dùng đũa thủy tinh khuấy thườngxuyên

- Bước 4: Dung dịch lăn tăn sôi thì dừng lại, để nguội đến khoảng 40oC

- Bước 5: Đổ dung dịch vào đĩa peptri, dày khoảng 0,3-0,5cm

- Bước 6: Lắc nhẹ cho dung dich tràn đều ra đĩa

- Bước 7: Để cho môi trường đông đặc

- Bước 8: Bao gói đem đi thanh trùng cùng với một ống nghiệm chứa 10mlnước cất

b Phân lập vi khuẩn nốt sần

- Bước 1: Lấy đĩa peptri có chứa vi khuẩn nốt sần trong tủ lạnh ra

- Bước 2: Để cho nhiệt độ của đĩa peptri về nhiệt độ phòng

- Bước 3: Thanh trùng que cấy bằng đèn cồn

- Bước 4: Cho một giọt nước vô trùng vào mẫu vi khuẩn nốt sần, dùng quecấy dầm nhẹ

- Bước 5: Hơ nhẹ đĩa peptri có chứa môi trường

- Bước 6: Mở nhẹ đĩa, dùng que cấy, cấy vi khuẩn theo hình zik zak, sau đóquay ngược lại và tiếp tục cấy theo hình zik zak

- Bước 7: Đậy nắp, thanh trùng que cấy, ghi rõ loại vi sinh vật, ngày thựchiện

- Bước 8: Mang đi ủ ở 35oC

II/ Kết quả và nhận xét:

Vi khuẩn nốt sần có mầu trắng đục, riêng rẽ, phát triển tốt

Bài 15: Phân tích chỉ số E Coli, Coliforms và Fecal coliforms bằng phương

pháp CFU

I Cơ sở lý thuyết:

- Bước 1: Pha loãng mẫu theo dãy thập phân: 1/10, 1/100, 1/1000,…

- Bước 2: Mỗi độ pha loãng lấy 0.1ml của những mẫu pha loãng vào từng đĩathạch

- Bước 3: Dùng que trang đã được thanh trùng trang đều trên mặt thạch Trangđều và quay đĩa thạch trong quá trình trang

- Bước 4: Chuyển các đĩa thạch có mẫu đem đi nuôi trong tủ ẩm ở điều kiệnthích hợp

Chú ý: lắc đều ở mỗi độ pha loãng trước khi lấy 1ml vào mỗi độ pha loãng và lắc

kĩ trước khi lấy 0.1ml vào môi trường đĩa thạch

- Bước 5: Đếm mẫu pha loãng tối đa từ 30-300 khuẩn lạc, sau đó tính kết quảtheo công thức sau:

M(CFU/ml)= A x D/V

- A: số khuẩn lạc trung bình trên đĩa

- D: độ pha loãng

- V: dinh tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml)

M: trung bình cộng của M ở các nồng độ pha loãng khác nhau

Số lượng vi sinh vật trong mẫu đất

Nhận xét:

 Đối với mẫu nấm men: mẫu có sự phát triển tương đối tốt, số lượng khuẩn lạc phân bố đều trên đĩa Tuy nhiên số lượng khuẩn lạc ở các đĩa thạch còn tương đối cao nhất là với đĩa có độ pha loãng 106

 Đối với mẫu đất: Sauk hi nuôi cấy mẫu đất thì gần như không có sự xuất hiện của khuẩn lạc Điều này có thể do môi trường nuôi cấy hoặc điều kiện nuôi cấy không phù hợp

Bài 16: Phân tích chỉ số vi sinh vật – phân tích tổng coliform bằng

phương pháp MPN

I Lý thuyết

Kỹ thuyết MPN là phương páp đĩa đếm tiêu chuẩn để đánh giá số lượng vi khuẩn

có xác suất lớn nhất trong 1 đơn vị thể tích mẫu trong môi trường

II Tiến hành

Có 3 bước

B1: Kiểm tra cơ sở:

- Pha loãng mẫu theo dãy thập phân vào ống nghệm có ống duleharm

- Nuôi trong tủ ấm 24h – 35oC

- Những ống nghiệm có 10%khí hoặc nhiều hơn được cho là chỉ số dươngtính Những ống có chỉ số dương tính trong mỗi lần pha loãng dung để tính sốlượng vi khuẩn có xác suất lớn nhất trong mẫu

B2: Kiểm tra lại mẫu

Lựa chọn 1 trong các ống có chỉ số dương tính và dung để cấy lên đĩa thạch có môitrường thạch Levine’s EBM và endo Những đĩa thạch sau khi cấy được nuôi 24h trong tủ ấm 35oC và quan sát khuẩn lạc coliform

B3: Hoàn thành kiểm tra:

Các mẫu sau khi đếm được ghi lại kết quả và tra bảng theo TCVN 648:2007

III Kết quả:

Do điều kiện thí nghiệm kông cho phép nên chưa có kết quả

Tổng kết:

Thực hành và thực tập vi sinh vật môi trường nhằm giúp cho chúng em làm quenvới các phương pháp tính ,khảo sát các vi sinh vật được ứng dụng trong xử lý môitrường bị ô nhiễm Các vi sinh ứng dụng thường được phân tích từ môi trường tựnhiên ,chúng có khả năng sử dụng các cơ chất khác nhau,chuyển hóa vật chất trong

tự nhiên Nguồn vi sinh vật gây ô nhiễm có thể từ đất nước ,không khí ,độngvật ,thực vật hay thực phẩm Phân tích xác định chức năng ,định danh chúng làbứơc dầu tiên đưa chúng vào ứng dụng Hoạt động của vi sinh vật có liên quan đénnhiều quá trình xảy ra trong đất và nước ,trước hết là các vòng tuần hoàn của vậtchất trong tự nhiên như chu trình cácbon ,chu trình nito ,photpho và lưu huỳnh vàsau đó là nó tham gia vào các quá trình phân hủy cũng như vậy gây ô nhiễm đếnmôi trường sống của con người