BÁO cáo THỰC tập VI SINH CÔNG NGHỆ dược

Bài 1. Chọn lọc giống Vi sinh vật Bài 2: SINH KHỐI VI SINH VẬT Bài 3: TINH CHẾ ENZYME AMYLASE BẰNG ALGINAT Bài 4: Cố định CGTase lên alginat Bài 5. Tinh chế protein bằng sắc ký ái lực Bài 6. Tinh chế lysozyme bằng sắc ký trao đổi ion

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN VI SINH – KÝ SINH   BÁO CÁO THỰC TẬP VI SINH CÔNG NGHỆ DƯỢC Năm 2011 Bộ môn Vi sinh-Ký sinh Báo cáo thực tập CNVS Bài Chọn lọc giống Vi sinh vật I.Khái quát: Quá trình chọn lọc giống vi sinh vật bao gồm: phân lập từ tự nhiên, gây đột biến, phát dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn bảo quản giống Việc phát dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn dựa vào: - Chất chuyển hóa tạo ra: kháng sinh, sắc tố,… - Enzym ngoại bào tác động lên chất môi trường - Sự thay đổi đặc tính sinh trưởng vi sinh vật - Sự thay đổi hình thái II.Nội dung thực hành: Phân lập phát vi sinh vật có đặc tính mong muốn: a.Amylase ngoại bào: Mơi trường phân lập Thạch tinh bột: dùng cho vi khuẩn Peptone 5g Beef extract 3g Starch soluble Agar 2g 18g Tiến hành: cho vào mẫu đất 10ml đệm PBS, vortex để phân tán vi sinh vật vào đệm Để khoảng 15 phút cho đất lắng xuống đáy - Hút 100µ dịch huyền phù vi khuẩn + 900µ đệm  pha lỗng 10 lần Trải lên đĩa thạch tinh bột, thạch gelatin TSA đĩa: 100µ dịch huyền phù vi khuẩn (đã pha lỗng 10 lần trên) + 900µ đệm  pha lỗng 100 lần - Hút 100µ dịch huyền phù pha lỗng 10 lần + 900µ đệm  pha loãng 100 lần Trải lên đĩa thạch tinh bột, thạch gelatin TSA đĩa: 100µ dịch huyền phù vi khuẩn (đã pha loãng 100 lần trên) + 900µ đệm  pha lỗng 1000 lần Phát Amylase ngoại bào: tráng bề mặt môi trường thạch tinh bột với dung dịch Lugol ( Iod ) , mơi trường có màu tím than màu iod với tinh bột Nếu chủng vi sinh vật có sinh amylase ngoại bào xung quanh chỗ vi sinh vật mọc có vòng sáng, tinh bột bị thủy phân nên khơng tạo màu với iod Đường kính vòng phân giải tinh bột tỷ lệ với hoạt tính Kết quả: Có số khóm vi khuẩn thủy phân tinh bột mơi trường xung quanh  Các khóm có sinh amylase ngoại bào b.Protease ngoại bào: Bộ môn Vi sinh-Ký sinh Báo cáo thực tập CNVS Thạch gelatin: dùng cho vi khuẩn Pepton 5g Beef extract 3g Starch soluble Agar 10g 15g Tiến hành: Tráng môi trường thạch gelatin TCA 50% mơi trường đục gelatin bị kết tủa Nếu chủng vi sinh vật có sinh protease ngoại bào xung quanh chỗ vi sinh vật mọc có vòng sáng, gelatin bị thủy phân nên không bị tủa Đường kính vòng phân giải gelatin tỷ lệ với hoạt tính Kết quả: Vi khuẩn có thủy phân gelatin  Khả sinh protease thấp c.Kháng sinh: Nguyên tắc: Phát vi sinh vật sinh kháng sinh dựa vào khả ức chế tăng trưởng vi sinh vật khác Tiến hành: - Dùng que vô trùng nhúng vào huyền trọc vi khuẩn chuẩn bị, ép que thành ống cho nước, sau trải mặt thạch Lập lại lần, lần xoay hộp 60 - Để hộp tủ ấm 3-5 phút cho mặt - Đục lỗ đường kính 6mm thạch dụng cụ tiệt trùng - Môi trường sau lọc nhỏ vào lỗ khoảng 20µl - Tiến hành song song với lỗ chứng nhỏ môi trường - Để yên khoảng 15p cho chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp thạch - Ủ hộp thạch tủ ấm 35-37C 16-18h Kết quả: Có vị trí xuất vòng kháng khuẩn B1 B3 Bộ môn Vi sinh-Ký sinh Bài 2: Báo cáo thực tập CNVS SINH KHỐI VI SINH VẬT I KHÁI QUÁT: Sinh khối toàn tế bào vi sinh vật thu nhận trình lên men II NỘI DUNG THỰC HÀNH: Lên men thu sinh khối: Mơi trường 1: TSB Mơi trường 2: TSB có bổ sung khoáng (nhằm tăng tốc độ sinh trưởng) TSB 30 g 10% KCl 10 ml 1.2% MgSO4 10 ml 1mM Fe(SO4)2 ml 0.1M MnCl2 ml M Ca(NO3)3 ml Nước vđ 1L Định lượng sinh khối phương pháp đo thể tích, so độ đục đếm sống Phân tán cắn nước vô trùng, đo độ đục máy đo quang, suy số tế bào/ml theo công thức : Số tế bào /ml = OD x 0,8 x 109 Môi trường - Nhiệt độ Điều OD600 Số tế bào/ml kiện nuôi cấy TSB, 37oC, lắc 0,844 6,7 x 108 TSB, 37oC, tĩnh 0,178 1,4 x 108 TSB, 30oC, lắc 0,899 7,2 x 108 TSB, 30oC, tĩnh 0,785 6,3 x 108 TSB + khoáng, 37oC, lắc 0,675 5,4 x 108 TSB + khoáng, 37oC, tĩnh 0,490 3,9 x 108 TSB + khoáng, 30oC, lắc 0,935 7,5 x 108 TSB + khoáng, 30oC, tĩnh 0,304 2,4 x 108 Thực phương pháp đếm sống : - Pha loãng liên tiếp (cấp số 10) huyền trọc vi khuẩn, cấp, đánh số 1-7 - Đánh dấu hộp thạch đếm TSA - Lấy cấp cuối cho vào hộp petri tương ứng 100 µl / hộp Dùng que gạt trải dịch vi khuẩn mặt thạch - Ủ nhiệt độ phòng 24h - Chọn hộp có khoảng 30-200 khóm, đếm tổng số khóm Bộ mơn Vi sinh-Ký sinh Báo cáo thực tập CNVS - Số tế bào / ml A= Số khóm, đếm tổng số khóm - Số tế bào /ml A = Số khóm x 10sốthứtự+1 - So sánh phương pháp xác định số lượng tế bào Bộ môn Vi sinh-Ký sinh Báo cáo thực tập CNVS Đo độ đục khuẩn sống nhanh - Ít xác ảnh hưởng yếu tố mơi trường Đếm sống - Chính xác - Khơng xác định xác số lượng vi - Thời gian lâu - Tốn Bộ môn Vi sinh-Ký sinh Báo cáo thực tập CNVS  Phương pháp đo độ đục: dùng để sàng lọc sơ So sánh môi trường nuôi cấy tĩnh lắc : sau định lượng sinh khối, ta có nhân xét chung mơi trường ni cấy có lắc có mật độ tế bào lớn hơn, tức sinh khối thu nhiều Bài 3: TINH CHẾ ENZYME AMYLASE BẰNG ALGINAT KHÁI QUÁT Enzyme amylase có ứng dụng quan trọng công nghiệp, thực phẩm, y dược… năm gần amylase sử dụng nhiều rộng rãi y học để sản xuất glucose làm dịch tiêm truyền, chuyển hóa tinh bột thành dextrin, tinh bột tan làm tá dược bào chế để sản xuất số thuốc Emzym amylase thu nhận từ động vật thực vật Tuy nhiên, emzym để ứng dụng y dược cần trải qua bước tinh chế từ enzyme thô => Alginat polysaccarid chiết xuất từ Tảo nâu, tạo gel có mặt ion hóa trị Amylase hấp phụ vào mạng lưới alginate, sau giải hấp phụ carbohydrate (cơ chất có lực cao với enzyme) => Mục đích tinh chế: tinh khiết, tăng hoạt tính enzyme (giữ bã alginate), sử dụng enzyme thô u cầu khơng đòi hỏi tinh khiết cao LÊN MEN VÀ THU ENZYME: 2.1 Nguyên liệu: Khoai lang Alginate: chiết từ tảo biển, có khả hấp phụ enzym amylase, có khả tạo gel có mặt ion hóa trị hai Dung dịch CaCl 0,7M ( tạo gel với alginate giúp giữ lại enzym thô hấp phụ alginate) => vừa cho vừa khuấy để tủa khơng vón cục Dung dịch glucose 2% ( giải hấp phụ enzym amylase, glucose có lực với amylase cao alginate) 2.2 Tiến hành: Sơ đồ quy trình tinh chế enzym amy lase Bộ mơn Vi sinh-Ký sinh Báo cáo thực tập CNVS Xay Khoai lang + đệm phosphate (1:1) phút Lọc hỗn hợp qua rây Dịch lọc, để yên cho tinh bột lắng xuống Gạn lấy dịch lọc phía trên, lọc qua giấy lọc Dịch lọc chứa enzyme thô 15ml dịch lọc enzyme thô + 75ml dung dịch sodium alginate 2% (trong đệm natriacetat 0,2M pH 4.8) dung đũa thủy tinh khuấy + 20ml CaCl2 0.7M Lọc Lọc lấy tủa + 30ml glucose 2% Lọc bỏ tủa Thu amylase 2.3 Xác định hàm lượng protein OD280: Chuẩn bị mẫu enzym thô mẫu enzym tinh chế: - Dịch enzym thô: Cho dịch enzym thô vào eppendorf ly tâm 15000 vòng/ phút, pha lỗng 10 lần Đo OD280 - Dịch enzym tinh chế Lấy ml mẫu, đo độ hấp thu bước sóng 280 nm Tính tổng lượng protein mẫu sau: Protein ( A280nm) = OD280 x V (ml) 2.4 Định lượng hoạt tính amylase: Xác định hoạt độ amylase phương pháp Heinkel: đo mật độ quang dung dịch sau thực phản ứng màu với Iode Một đơn vị hoạt độ tương ứng với khả phân giải 1mg tinh bột sau 30 phút 30oC Tiến hành Bộ môn Vi sinh-Ký sinh Báo cáo thực tập CNVS Ống thử: cho vào ống nghiệm sấy khô 0.1 ml dung dịch tinh bột 1%, 0.1 ml dung dịch NaCl 0.1% 0.2 ml dung dịch đệm phosphat 0.05M pH 6, lắc Thêm vào hỗn hợp 0.1ml dung dịch enzym, lắc Giữ nhiệt 300C 30 phút Lấy ống nghiệm khỏi tủ ấm, cho vào 0.5 ml dung dịch tricloacetic acid 5% để làm ngừng phản ứng, ly tâm 10.000 vòng/ phút phút  Ống thử phải màu xanh (để xác định thời điểm kết thúc), hoạt tính q cao phải pha lỗng Ống kiểm tra: song song với mẫu kiểm tra tương tự cho dung dịch tricloacetic acid 5% vào trước cho dung dịch enzym vào Lấy 0.1 ml dịch lọc mẫu thí nghiệm mẫu kiểm tra, cho vào ống nghiệm mẫu kiểm tra, cho vào ống nghiệm khô, thêm 0.9 ml dung dịch iod pha loaxng150 lần So màu bước sóng 560 nm Tính kết Tính hiệu số đọc đươc máy mẫu kiểm tra mẫu thí nghiệm ∆OD = ODKT - ODTN Từ OD đưa vào đồ thị chuẩn tính số tinh bột tương ứng Lập đồ thị chuẩn: Để xác định hoạt độ enzym amylase theo phương pháp Heinkel cần xác định đường chuẩn từ dung dịch tinh bột 1%: cân g tinh bột trộn với 10 ml nước cất, thêm 80 ml nước cất sôi Để nguội cho vào bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch Từ dung dịch chuẫn bị dung dịch có chứa 2, 4, 6, 8, 10mg tinh bột ml cách lấy 2/10, 4/10, 6/10, 8/10, 10/10ml dung dịch tinh bột 1% thêm nước cất vào 1ml Lập đồ thị đường chuẩn: Ống Tinh bột (mg) 0,2 0,4 0,6 0,8 OD 0,038 0,09 0,135 0,174 0,218 U/ml 10 Vẽ đường chuẩn xác định hoạt tính amylase Bộ mơn Vi sinh-Ký sinh Báo cáo thực tập CNVS Thơng số quy trình tinh chế: OD280 Enzym thô = 1,96  Protein = 0,96 x 15 x 10 = 144 OD280 Enzym tinh = 1,438  Protein = 0,438 x 30 = 13,14 Enzym thơ (pha lỗng lần): ODKT = 0,454 , ODTN = 0,158  Enzym tinh chế (khơng pha lỗng): ODKT = 0,442 , ODTN = 0,154  0,296 0,288 Hiệu suất Dịch thô Enzym sau tinh chế Tổng protein Tổng hoạt tính (A280nm) (U) 144 101,06 13,14 Hoạt tính chuyên biệt (U/ A280nm) Mức tinh chế (%) Tổng Protein Tổng Hoạt tính (lần) 9,1% 38,9% 0,702 39,34 2,994 Nhận xét: Enzym sau tinh chế có tổng hoạt tính giảm so với ban đầu hoạt tính chuyên biệt tăng lên, hiệu suất tinh chế đạt 50,53 % với mức tinh chế lần 10 Bộ môn Vi sinh-Ký sinh Báo cáo thực tập CNVS 4.Cố định enzym gel, 5-10 phút lắc lần 5.Lọc dung dịch sau cố định, rửa hạt gel lần với đệm Tris-HCl pH Thu dịch rửa, xác định hàm lượng protein khơng cố định b.Tính hàm lượng hiệu suất protein cố định Nguyên tắc: Phương pháp dựa thay đổi bước sóng hấp thu cực đại thuốc nhuộm Coomasie Brillant Blue tạo phức hợp với protein Trong dung dịch mang tính acid, chưa kết nối với protein thuốc nhuộm có λ max 465 nm Khi kết hợp với protein thi thc nhuộm có λmax 595 nm 1.Xây dựng đường chuẩn STT 10 20 30 40 50 Dung dịch BSA 0.1 mg/ml (ml) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Nước cất (ml) 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 Nồng độ (µg/ml) BSA -Hút ống 0.8 ml cho vào ependorf theo thứ tự, thêm vào 0.2 ml thuốc thử Bradford 5X, lắc đều, để yên cho màu ổn định phút Đo OD 595 nm -Dựng đường chuẩn 2.Xác định hàm lượng protein chế phẩm - Pha loãng chế phẩm CGTase 100 lần -Hút 0.8 ml chế phẩm cho vào 0.2 ml thuốc thử Bradford 5, đo OD 595 -Tính hàm lượng protein chế phẩm 3.Xác định hàm lượng protein cố định -Hút 0.8 ml thu được, cho vào 0.8 ml thuốc thử Bradford, đo OD 595 nm -Tính hàm lượng protein khơng cố định, suy hàm lượng protein cố định c Xác định hoạt tính CGTase cố định Nguyên tắc: Hoạt tính CGTase đánh giá thông qua lương cyclodextrin CGTase tạo từ malatosedextrin điều kiện xác định Dựa vào khả hấp phụ làm màu phenolphtalein cyclodextrin, ta có xác định cyclodextrin tạo thành từ maltosedextrin dựa trêm sở xác định mức độ giảm cường độ màu hỗn hợp phản ứng với phenolphtalein 12 Bộ môn Vi sinh-Ký sinh Báo cáo thực tập CNVS 1.Xây dựng đường chuẩn β-CD -Pha dung dịch β-CD 1% : Lấy 1g β-CD hòa vào khoảng 80ml đệm Tris- HCl, cho vào bình định mức thêm vừa đủ 100ml Từ dung dịch β-CD pha thành giai mẫu Ống nghiệm 5 β-CD 1%( ml) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 H2O (ml) 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 Nồng độ (mg/ml) β-CD -Lấy 100µl dung dịch β-CD tương ứng vào ependorf, thêm 900 µl đệm Tris- HCl, 400 µl dung dịch NaOH, 100 µl phenophtalein Để ổn định phút, đo cường độ màu bước sóng 550 nm -Mẫu trắng để chỉnh máy 0: 0.4 ml dung dich NaOH + ml Tris- HCl 50 Nm 0.1 ml nước cất -Từ giá trị OD xây dưng đường chuẩn phương trình hồi quy ΔOD = a × β-CD + b (mg) 2.Xác định hoạt tính enzym ban đầu - Pha lỗng enzym ban đầu 15 lần - Chuẩn bị mẫu thử mẫu chứng ependorf khô theo thứ tự sau: Mẫu thử Mẫu chứng Enzym (ml) 0.1 0.1 NaOH 60 nM (ml) 0.4 Maltose dextrin %(ml) 0.9 0.9 NaOH 30 mM (ml) 0.4 Phenolphtalein 0.1 0.1 Ủ 370C 15 phút Để ổn định 10 phút, đo OD550 3.Xác định hoạt tính enzym sau cố định 13 Bộ môn Vi sinh-Ký sinh Báo cáo thực tập CNVS - Chuẩn bị mẫu thử mẫu chứng Falcon 15 ml khô theo thứ tự sau: Mẫu thử Mẫu chứng Enzym (mg) 200( hạt gel) 200( hạt gel) NaOH 60 mM (ml) 0.4 Maltose dextrin %(ml) 0.9 0.9 NaOH 30 mM (ml) 0.4 Phenolphtalein 0.1 0.1 Ủ 370C 15 phút Để ổn định 10 phút, đo OD550 4.Kết 1.Cố định enzym CGTase lên alginate Cách : Phương pháp bắt giữ: Tổng thể tích nước rửa: V = 93 ml Khối lượng hat gel: m = 13.58 g Cách : Phương pháp hấp phụ : Tổng thể tích nước rửa: V = 75,5 ml Khối lượng hạt gel: m = 14,19g 2.Xác định hàm lượng protein chế phẩm CGTase protein cố định a.Xây dựng đường chuẩn định lương protein ống ngiệm Nồng độ BSA (µg/ml) 10 20 30 40 50 ΔOD595 nm 0.086 0.200 0.320 0.428 0.530 14 Bộ môn Vi sinh-Ký sinh Báo cáo thực tập CNVS Vẽ đường chuẩn định lượng protein theo phương pháp Bradford b.Tính hàm lượng protein chế phẩm ΔOD595 nm 0,232 Nồng độ protein (µg/ml) 22.454 Hàm lượng protein (mg) 4,491 c.Tính hàm lượng protein cố định ΔOD595 nm 0,452 Nồng độ protein (µg/ml) 42,824 Hàm lượng protein khơng cố định (mg) 3,983 Hàm lượng protein cố định (mg) 0,508 Hiếu suất cố định(%) 11,315 3.Kết xác định hoạt tính enzym chế phẩm hoạt tính enzym cố định a.Xây dựng đường chuẩn cyclodextrin Số thứ tự Nồng độ CD (mg/ml) OD550 0,816 0,703 0,582 0,420 0,314 0,234 Tương đương OD lượng phenophtalein lại 0,113 0,234 0,396 0,502 0,582 Hệ số góc (a) 0,121 15 Bộ môn Vi sinh-Ký sinh Báo cáo thực tập CNVS Vẽ đường chuẩn dựa vào OD hàm lượng phenophtalein lại Ta có phương trình hồi quy : 0,816 - ΔOD = 0,121 × β-CD – 0,119 b.Xác định hoạt tính CGTase OD thử = 0,126 OD chứng = 0,711 ΔOD550 nm β-CD (mg/ml) Hoạt tính CGTase (U/mg protein) 0,585 2,893 0,639 c.Xác định hoạt tính enzym cố định OD thử = 0,710 OD chứng = 1,033 ΔOD550 nm 0,323 β-CD (mg/ml) 5,058 Hoạt tính riêng (U/mg) 0,047 Tỉ lệ hoạt tính (%) 7,355 Trả lời câu hỏi: 1.Nguyên tắc xác định hoạt tính CTGase: Hoạt tính CGTase đánh giá thông qua lương cyclodextrin CGTase tạo từ malatosedextrin điều kiện xác định Dựa vào khả hấp phụ làm màu phenolphtalein cyclodextrin, ta có xác định cyclodextrintaoj thành từ maltosedextrin dựa trêm sở xác định mức độ giảm cường độ màu hỗn hợp phản ứng với phenolphtalein 16 Bộ môn Vi sinh-Ký sinh Báo cáo thực tập CNVS 2.Vẽ sơ đồ quy trình cố định CTGase phương pháp hấp phụ: 20ml đệm Tris-HCl pH=8 Nhỏ từ từ alginate 2% DD CaCl2 0,2M Hạt Gel Ca-alginat Bỏ dịch lọc 2ml enzyme CGTase Dịch rửa Lắc 10 lần/phút Enzyme cố định 1h Hạt gel chứa enzyme Rửa hạt gel lần với đệm Tris-HCl pH=8 -o0o - Bài Tinh chế protein sắc ký lực I.Nguyên tắc Dựa vào gắn thuận nghịch nhóm chức protein với nhóm chức pha tĩnh sắc ký Như có protein đích mang nhóm chức đặc hiệu gắn vào pha tĩnh, protein khác khỏi cột protein đích sau thơi cạnh tranh với Hình :Nguyên tắc sắc ký lực Đây phương pháp cho phép tinh nhanh chóng hợp chất cần quan tâm 17 Bộ môn Vi sinh-Ký sinh Báo cáo thực tập CNVS Đây kỹ thuật sắc ký đơn giản hiệu để tinh chế protein Tuy nhiên, có nhược điểm đòi hỏi protein đích phải có nhóm chức đó, mà khơng phải lúc có Ngày nay, với kỹ thuật tái tổ hợp, người ta them vào gen đích đoạn acid nucleic mã hóa cho đoạn peptid mang chức để sau tách chiết protein đích, đoạn peptid sau loại bỏ peptase Một số thí dụ -Trong sắc ký lực ion kim loại IMAC (ion metal affinity chromatography), nhựa sắc ký gắn ion kim loại( hóa trị II: Cu,Ni,…), ion có lực với đoạn peptid có nhiều histidine, đặc biệt 6-10 histidine Chất dung để protein imidazole nồng độ > 100 mM -GST: nhựa có lực với enzyme Glutathione-S-Tranferase Protein đích thơi glutathione dạng khử có nồng độ > 20 mM II Nội dung thực hành: Chuẩn bị cột sắc ký Phá vỡ tế bào phương pháp siêu âm (protien đích sản phẩm nội bào) Tiến hành tinh chế His-tag protein (như hình 1)  Nạp mẫu vào cột  Rửa cột với đệm chạy đệm rửa(*)  Tiến hành rửa giải đệm H 1X(*)  Phục hồi cột băng đệm chạy H(*) Định lượng protein phương pháp Bradford (*) Thành phần đệm sử dụng vai trò thành phần đệm Đệm chạy H 8X (binding buffer) - 40mM imidazole - 4M NaCl - 160mM Tris-HCl pH 7.9 → đệm chạy H 1X: Nồng độ imidazole = 5mM, có vai trò rửa Ni 2+ chất gắn không đặc hiệu với ion Ni 2+ - NaCl giúp tạo lực ion vừa phải Đệm H 4X ( elution buffer) - 400mM imidazole 18 Bộ môn Vi sinh-Ký sinh Báo cáo thực tập CNVS 2M NaCl - 80mM Tris-HCl pH 7.9 → đệm H 1X: Nồng độ imidazole = 100mM dùng để protein đích., tăng lực với Ni → đẩy His-tag Đệm ion 8X ( charge buffer) 400 mM NiSO Đệm rửa H 8X ( wash buffer) - 400mM imidazole - 4m NaCl - 160mM Tris-HCl pH 7.9 → Nồng độ imidazole = 50mM, vai trò giúp cho trình gắn đặc hiệu Ni protein his-tag xảy tốt 2+ với Đệm xả H 4X - 400mM EDTA - 2M NaCl - 80mM Tris-HCl pH 7.9 Vai trò EDTA: EDTA có lực với imidazole, giúp rửa hết imidazole khỏi cột, làm tái tạo cột sắc ký III KẾT QUẢ QUAN SÁT Mẫu chuẩn: Bảng 6.1 Nồng độ 10 20 30 40 50 OD 0.055 0.075 0.115 0.145 0.192 19 Bộ môn Vi sinh-Ký sinh Báo cáo thực tập CNVS Quan sát: dung dịch E Coli đục, sau phá hủy tế bào dịch trở lại Kết đo quang: Dịch A B C D1 D2 D3 Thể tích 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml Độ pha loãng OD 100 100 0 0 0.182 0.156 0.216 Nồng độ (µg/ml) Khối lượng (µg) 47,86 41,12 0,133 0,140 0,065 Mẫu gộp 3ml 0.105 26,576 4786 79,728 Hiệu suất=mẫu D/mẫu A x 100%=79,728/4786x100%=1,716% IV.Biện luận-giải thích: Sau phá hủy tế bào, dịch trở lại ban đầu tế bào vi khuẩn tạo thành dạng hỗn dịch làm dung dịch bị đục, sau phá hủy tế bào chất tan nước nên trở lại Hiệu suất chiết tách đạt 1,716 thấp thao tác kĩ thuật chưa xác  Trường hợp khơng có His-tag: - Pha sai: Nồng độ Imidazol không đủ đẩy His-tag - Chủng E.Coli khơng có His-tag - Do lượng mẫu nạp vào cột lớn => Ở ta không định lượng phương pháp Bradford có Urê làm ảnh hưởng đến kết (Urê tạo màu với thuốc thử) 20 Bộ môn Vi sinh-Ký sinh Bài Tinh Báo cáo thực tập CNVS chế lysozyme sắc ký trao đổi ion I.Tổng quan: 1.Nguyên tắc - Mỗi dung dịch protein tùy theo pH tích điện khác Mỗi protein có giá trị pH mà tổng điện tích âm dương nhau, hay nói cách khác có điện tích o, pH gọi pI ( điểm đẳng điện) Khi pH dung dịch lớn pI protein tích điện âm ngược lại - Nhựa sắc ký trao đổi ion gồm chất rắn không tan gắn nhóm mang điện tích liên kết cộng hóa trị , nhóm tích điện liên kết với đối ion có điện tích trái dấu cách thuận nghịch nhờ tương tác tĩnh điện - Sắc ký trao đổi ion dựa vào trao đổi thuận nghịch điện tích protein với điện tích trái dấu pha tĩnh sắc ký, tùy theo cân ion pH dung dịch mà protein gắn vào nhựa hay bị đẩy khỏi nhựa Các lọai nhựa trao đổi ion - Theo lọai điện tích trao đổi nhựa chia làm lọai cation anion - Theo độ mạnh nhóm mang điện tích nhựa có lọai mạnh yếu khái niệm mạnh hay yếu mức độ biến động ion hóa theo pH độ mạnh liên kết Nhựa trao đổi mạnh có khả họat động dãi pH rộng bị ảnh hưởng pH môi trường ngược lại - Theo chất vật liệu mang : vật liệu mang (matrix) thường lọai polymer tự nhiên hay tổng hợp dextran (sephadex), agarose (sepharose), cellulose(sephacel) … vật liệu mang định độ bền, khả chịu đựng tác động hóa học, vật lý,độ thân nước khả thấm phân tử vào bên tốc độ mức độ trao đổi diễn 21 Bộ môn Vi sinh-Ký sinh Báo cáo thực tập CNVS - + - + + - +++ + pI - + + Gắn vào Nhựa trao đổi cation pH + - - + Gắn vào nhựa trao đổi anion + - II.Nội dung thực hành: Áp dụng sắc ký trao đổi ion để tinh chế lysozym từ lòng trắng trứng Nguyên tắc Dựa vào khác biệt pI lysozym ( pI= 10) so với protein khác lòng trắng trứng ( pI  6) Do pH= nhựa trao đổi cation lysozym có pI> pH tích điện dương, protein khác tích điện âm có pI< pH Ta chọn cột sắc ký trao đổi cation để giữ lại lysozym lysozym chiếm tỷ lệ nhỏ nhiều so với tổng lượng protein lại, chọn cột giữ lysozym lại lâu làm đầy cột, khả lại lớn hơn, lâu hơn, tiết kiệm nhựa Do lysozym giữ lại cột trao đổi cation, protein khác khơng trao đổi nên ngồi Sau lysozym thơi cách nâng pH lên 10 tăng nồng độ ion dung dịch lên để cạnh tranh đẩy lysozym Vật liệu: Đệm chạy 50mM tris-HCl pH (để lysozyme tích điện dương) Đệm thơi 2M NaCl 22 Bộ môn Vi sinh-Ký sinh Báo cáo thực tập CNVS 50mM tris-HCl pH Nhựa trao đổi ion SP sepharose FF Dịch lòng trắng trứng Trong đệm thơi có thêm thành phần NaCl cung cấp ion Na + tác dụng cạnh tranh đầy lysozym giữ lại cột ngồi => dịch thơi chứa lysozyme Tiến hành I.1 Chuẩn bị cột  Rửa cột rỗng với nước cất vô trùng cho sạch, gắn lên giá cho thẳng đứng  Phân tán nhựa sắc ký cho thật cách úp ngửa  Cho ml SP Sepharose vào cột cho đừng dính vào thành cột  Để yên khoảng 1h cho sepharose lắng xuống  Mở cột cho chạy hết dung dịch bảo quản cột, tránh để cột bị khô  Rửa cột với đệm sau: Đo thể tích cột = 0.5 ml thể tích = 1.5 ml nước cất vơ trùng thể tích = 2.5 ml đệm chạy L-1X  Khoá cột 1.2 Tinh chế lysozym  Nạp ml dịch lòng trắng trứng ( dịch A) lên cột, nhẹ nhàng, tránh làm tung sepharose lên Cho cột chạy Hứng toàn dịch chảy vào ống nghiệm ( dịch B)  Rửa cột với 5-10 thể tích đệm chạy => pH=8 có lysozyme tích điện dương nên bị giữ lại Hứng dịch thu vào ống nghiệm lắc mạnh thấy tạo bọt bền tiếp tục rửa với 1.5 ml đệm chạy đến dịch thu hết tạo bọt bền => Khơng protein Hứng toàn dịch chảy = dịch C  Thôi lysozym khỏi cột cách cho 1ml đệm Hứng dịch chảy vào ống nghiệm lắc đến thấy dịch hết tạo bọt bền dừng thu từ D1D4 Hút ống 0.5 ml dịch gộp vào ống nghiệm = dịch D  Tái cân cột thể tích= 2.5 ml đệm chạy L-1X I.2 Đo OD: 23 Bộ môn Vi sinh-Ký sinh Báo cáo thực tập CNVS  Dịch A,B pha loãng 100 lần  Dịch C, D để nguyên đo OD, với thành phần: Mẫu trắng: 0.5 ml braford + 0.5 ml đệm chạy L-1X Mẫu đo: 0.5 ml braford + 0.05 ml mẫu + 0.45 ml đệm chạy L-1X III.Kết quả: Định lượng protein Mẫu chuẩn: Bảng 7.1 Nồng độ 10 20 30 40 50 OD 0.055 0.075 0.115 0.145 0.192 Mẫu thử chứa lysozym: Bảng 7.2 A B C D1 D2 D3 D4 D gộp Thể tích(ml) 1 1.5 0.5 0.5 0.5 0.5 OD 0.182 0.084 1.132 0.315 0.05 0.006 C(µg/ml) 47,8 22,1 Độ pha 50 lỗng 50 0.111 29.16 5 Theo cơng thức: m = độ pha lỗng * C * 10-3 * V 24 Bộ môn Vi sinh-Ký sinh Khối 2.39 lượng(mg) Báo cáo thực tập CNVS 1.105 0.292 Hiệu suất = mẫu gộp / mẫu A * 100% = 0.292 * 100 = 12,21% 2.39 IV Biện luận-giải thích: Nhận xét hiệu suất tinh chế - giải thích: Hiệu suất tinh chế đạt khoảng 12,21% thấp Vì theo lý thuyết trình tinh chế gồm bước với mục tiêu khác nhau: - Đánh bắt: mục tiêu giữ lại phân tử cần nhiều nhất, bắt lầm bỏ sót - Tinh chế: mục tiêu tìm cách loại tạp, chấp nhận chất cần để tăng độ tinh khiết - Đánh bóng: mục tiêu tăng độ tinh khiết cao hơn, sử dụng thuốc tiêm Trong thực tập ta làm giai đoạn tinh chế lysozym từ dịch lòng trắng trứng phương pháp sắc ký trao đổi ion theo nguyên lý liên kết ion, tách theo khác biệt điện tích Mục đích loại tạp nhiều tốt, chấp nhận sản phẩm để đạt độ tinh khiết cao Sơ đồ trình tinh chế: Chuẩn bị cột Rửa cột với nước cất, đệm chạy Nạp dịch lòng trắng trứng(A) Hứng lấy dịch B( protein tạp) Rửa cột với 5V đệm chạy Hứng dịch C, kiểm tra protein Thôi lysozym đệm 25 Bộ môn Vi sinh-Ký sinh Báo cáo thực tập CNVS Hứng dịch D, kiểm tra protein( lysozym) Tái cân cột 5V đệm chạy 26 ... B3 Bộ môn Vi sinh- Ký sinh Bài 2: Báo cáo thực tập CNVS SINH KHỐI VI SINH VẬT I KHÁI QUÁT: Sinh khối toàn tế bào vi sinh vật thu nhận trình lên men II NỘI DUNG THỰC HÀNH: Lên men thu sinh khối:...Bộ môn Vi sinh- Ký sinh Báo cáo thực tập CNVS Bài Chọn lọc giống Vi sinh vật I.Khái quát: Quá trình chọn lọc giống vi sinh vật bao gồm: phân lập từ tự nhiên, gây đột biến, phát dòng vi sinh vật... số khóm vi khuẩn thủy phân tinh bột mơi trường xung quanh  Các khóm có sinh amylase ngoại bào b.Protease ngoại bào: Bộ môn Vi sinh- Ký sinh Báo cáo thực tập CNVS Thạch gelatin: dùng cho vi khuẩn