báo cáo thực tập chuyên ngành công nghệ sinh học y dược (nuôi cấy tế bào động vật và ivf)

THU NHẬN QUẦN THỂ TẾ BÀO TRONG TỦY XƯƠNGNguyên tắc -Thu nhận quần thế tế bào trong tủy xương bằng cách dội rửa với dung dịch nuôi tế bào DMEM/F12 bổ sung 10% FBS,kháng sinh 1%... • Môi t

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC TẬP CHUYÊN NGÀNH

CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC

(NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT VÀ IVF)

NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

NUÔI CẤY SƠ CẤP

Thu nhận mô có chứa

tế bào sống

Tách rời tế bào, xác định mật độ tế bào

Nuôi cấy

NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

THU NHẬN MÔ XƯƠNG ĐÙI,XƯƠNG CẲNG CHÂN CHUỘT

Nguyên tắc

-Thu nhận xương đùi chuột có chứa tế bào sống tủy xương chuột bằng cách mổ và thu nhận trực tiếp trên chuột

THU NHẬN MÔ XƯƠNG ĐÙI CHUỘT

Kết quả

-Thu nhận thành công xương đùi chuột nguyên vẹn,

đúng vị trí

THU NHẬN QUẦN THỂ TẾ BÀO TRONG TỦY XƯƠNG

THU XƯƠNG ĐÙI CHUỘT

DỘI RỬA TỦY XƯƠNG

RỬA PBS 2X RỬA PBS 5X

THU NHẬN QUẦN THỂ TẾ BÀO TRONG TỦY XƯƠNG

Nguyên tắc

-Thu nhận quần thế tế bào trong tủy xương bằng cách dội rửa với dung dịch nuôi tế bào (DMEM/F12 bổ sung 10% FBS,kháng sinh 1%)

ĐẾM TẾ BÀO

Nguyên tắc

-Đếm tế bào bằng cách đếm trên buồng đếm hồng cầu với thuốc nhuộm trypan blue(bắt màu với tế bào chết)

ĐẾM TẾ BÀO

ĐẾM TẾ BÀO

THAY MÔI TRƯỜNG

HÚT BỎ MÔI TRƯỜNG CŨ

RỬA BẰNG 1ml PBS

THÊM 3ml MÔI TRƯỜNG MỚI

THAY MÔI TRƯỜNG

Trước khi thay môi trường Sau khi thay môi trường

Kết quả

Đã loại bỏ được các tế bào không mong muốn, các tế bào gốc trung mô đã bám dính được, tỉ lệ bám dính khá thấp

Mục đích – Nguyên tắc

Pha dừng (Station ary phase) Tế bào đi

vào apoptosis

CẤY CHUYỀN

• Tần số và tỉ lệ pha loãng phụ

thuộc vào dòng tế bào.

• Nếu cấy chuyền quá thường

xuyên hay nồng độ tế bào quá

Huyền phù

Ly tâm ở

2000 rpm, 5 phút,

22 độ C

Quy trình

CẤY CHUYỀN

Lấy tế bào lên bằng scrapper vẫn còn dính ở góc, chưa lấy lên được hoàn toàn Huyền phù

tế bào không đều.

Kết quả- biện luận

CẤY CHUYỀN

Sự giới

Tiết kiệm môi trường dinh dưỡng

Công cấy chuyền

Đột biến

tế bào

CẦN ĐÔNG LẠNH VÀ BẢO QUẢN

TẾ BÀO

Mục đích – Nguyên tắc

ĐÔNG LẠNH VÀ BẢO QUẢN TẾ BÀO

• Môi trường đông lạnh

chứa 10% DMSO có vai

trò đi vào trong tế bào 

Khiến nước đi ra khỏi tế

bào  Tế bào sẽ không bị

vỡ do tinh thể nước khi

để trong môi trường lạnh

Mục đích – Nguyên tắc

ĐÔNG LẠNH VÀ BẢO QUẢN TẾ BÀO

• Phải nhanh chóng làm tan đá hoàn toàn ở 37

độ C để tránh hình thành tinh thể đá trong tế bào trong quá trình bù nước

• Các chất đông lạnh có thể làm tổn hại và gây độc tế bào  Nhanh chóng loại bỏ chất đông lạnh

Mục đích – Nguyên tắc

GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO

Trong không khí 30s 37 độ C trong

Kết quả- biện luận

GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO

THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF)

1.Cơ sở lý thuyết

- Thụ tinh in vitro ( In vitro fertilization -IVF) là quá trình kết hợp giữa tinh trùng và trứng để tạo ra hợp tử, được thực hiện bên ngoài cơ thể mẹ , tại phòng thí

nghiệm Tuy vậy, các điều kiện cho quá trình IVF như môi trường, nhiệt độ, độ ẩm, độ nhớt, yếu tố dinh

dưỡng…cùng các chỉ tiêu sinh học khác phải được đảm bảo bình thường giống như trong cơ thể mẹ

THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF)

2 Quy trình thực tập

2.1 Thu giao tử cái

2.1.1 Thu nhận ống dẫn trứng

- Chuột đã gây siêu bài noãn trước đó

- Mổ chuột cái để thu nhận buồng trứng và ống dẫn trứng

- Cho buồng trứng và ống dẫn trứng vào Eppendorf chứa sẵn

dung dịch PBS

THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF)

2.1.2 Thu trứng từ ống dẫn trứng

- Chuyển ống dẫn trứng đã thu được vào đĩa chứa sẵn

GMOP đưa lên kính hiển vi ⇒ Xác định đoạn bóng chứa trứng ⇒ Dùng mũi kim xé đoạn bóng để trứng thoát ra ngoài dung dịch ⇒ Hút trứng trong dung dịch và chuyển sang một đĩa khác chứa sẵn PBS ⇒ bảo quản trứng ở

37oC, 5%CO2 chờ thụ tinh

THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF)

• Kết quả đạt được

- Không có đoạn bóng, mô đệm chỉ có trứng non

THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF)

2.2 Thu giao tử đực

2.2.1 Thu mào tinh và ống dẫn tinh

- Mổ bìu chuột đực để tiến hành thu mào tinh

và ống dẫn tinh

- Xác định đúng vị trí của mào tinh và đoạn

phình lên của ống dẫn tinh

- Cắt mào tinh và ống dẫn tinh cho vào một

THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF)

• Kết quả thu được

- Tinh hoàn chuột bị rút lên ổ bụng, không

tìm thấy và không thu nhận được mào

tinh và ống dẫn trứng

⇒ Xin tinh trùng của nhóm khác (nhóm 11)

THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF)

2.2.2 Thu tinh dịch và tiến hành swim-up

- Thu tinh dịch từ mào tinh và ống dẫn tinh ở trên

- Dùng kẹp vuốt dọc ống dẫn tinh để tinh dịch tràn ra

2.2.2 Thu tinh dịch và tiến hành swim-up(tt)

2.2.2.2 Swim-up

- Cho eppendorf chứa dung dịch swim-up đã có

tinh trùng ở trên vào tủ nuôi cấy sơ cấy trong

30p, để tiến hành swim-up

- Sau khi đã swim-up, hút phần dịch ở trên sang

một eppendorf khác, hút 20 đem đi đếm để xác

định mật độ, phần còn lại đem đi ly tâm để cô

đặc tinh trùng

THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF)

• Kết quả đạt được

- Thể tích hút được sau khi swim-up là 450 (của nhóm 11)

- Đếm tinh trùng

+ Tổng tinh trùng đếm được là 396 con

+ Tính mật độ tinh trùng dựa vào công thức

N(tinh trùng/ml) = x 106 x độ pha loãng

2.3 Thụ tinh trong ống nghiệm

2.3.1 Tạo vi giọt

- Tạo vi giọt thụ tinh: Dùng pipite nhỏ 10 dung dịch để tạo giọt trên đĩa, tạo 4 vi giọt ⇒ thêm nhẹ nhàng khoảng

3.5ml dầu khoáng vào

- Tạo vi giọt nuôi phôi: Dùng pipite nhỏ 10l dung dịch để tạo giọt trên đĩa, tạo 4 vi giọt ⇒ thêm nhẹ nhàng khoảng 3.5ml dầu khoáng vào ⇒ thêm tiếp 30l vào mỗi giọt

⇒ Chuyển nhẹ nhàng và cẩn thận vào tủ nuôi cấy sơ cấy

THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF)

2.3.2 Thụ tinh

- Hút chuyển trứng vào vi giọt thụ tinh

- Thêm 30l huyền phù tinh trùng vào

- Cho vi giọt thụ tinh vào tủ nuôi tế bào

từ 4-6h, 37oC, 5% CO2

THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF)

Kết quả nhuộm phôi

Hình ảnh phôi được nhuộm với

THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF)

Biện luận-giải thích

- Ta thấy trứng chỉ bắt màu xanh chứng tỏ

trứng chỉ được nhuộm với Hoechst Do đó

trứng vẫn còn sống

THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF)

• Kết quả đạt được

- Đã tạo được vi giọt, đã chuyển được

huyền phù tinh trùng vào vi giọt, nhưng

vì không có trứng nên không thể tạo

được phôi

20um

2.3.3 Nuôi phôi

- Hút chuyển trứng sang vi giọt nuôi phôi,

quan sát hình thái phôi

- Tỉ lệ phôi được tạo thành được tính theo

công thức sau:

THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF)

KIẾN NGHỊ

-Nếu tạo phôi thất bại, có thể có phôi mẫu để quan sát

-Có thể thêm hoặc sắp xếp chương trình thực tế về ứng dụng của nuôi cấy tế bào.

- Phần thực tập kĩ thuật mổ thu trứng và tinh của chuột bọn em

có thể được tập huấn nhiều hơn để khi thao tác không quá bỡ ngỡ

CÁM ƠN THẦY CÔ ĐÃ LẮNG NGHE !

TÀI LIỆU THAM KHẢO

• Culture of Animal Cells của R Ian Freshney

• General Guide for Cryogenically Storing

Animal Cell Cultures của John Ryan, Ph.D

• Cryogenic Preservation and Storage of Animal Cells của John A Ryan, Ph.D