báo cáo thực tập chuyên ngành công nghệ sinh học y dược

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH KHOA SINH HỌC – CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO THỰC TẬP CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC PHẦN 1: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT PHẦN 2: THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM Nhóm PHẦN 1: NI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT I/ Đặt vấn đề II/ Tổng quan tài liệu III/ Vật liệu, phương pháp IV/ Kết - Giải thích V/ Kết luận, kiến nghị Nhóm I/ Đặt vấn đề ản xuất kháng hể đơn dòng, interferon,… Ngh/c tương tác tế bào –tế bào Nuôi cấy tế bào động vật Sản phẩm tế bào Thu nhận Phân lập Ni cấy Quan sát, đánh giá Mơ hình thử thuốc Invitro Nhóm II/ Tổng quan tài liệu 1) Tế bào gốc trung mơ (MSC): • MSC tế bào gốc đa năng, có khả biệt hóa thành nhiều kiểu tế bào chức khác nhau: xương, sụn, mỡ,… • Đặc điểm nhận dạng: MSC tế bào bám dính, biểu marker bề mặt như: +CD73, +CD90, +105, -CD45, -CD34, -CD14, -CD79_alpha, -HLA_DR • MSC thu từ tủy xương, máu cuống rốn, mơ mỡ • Trong ni cấy invitro, MSC thu nhận nuôi cấy môi trường DMEM/F12 FBS 10% 2) Tủy xương: • Tủy xương nguồn chứa MSC dồi • MSC thu từ tủy xương dễ nuôi, dễ lên MSC thu từ máu cuống rốn 3) Tế bào MCF-7: Là dòng tế bào ung thư vú Nhóm III/ Vật liệu, phương pháp III.1/ Vật liệu: III.1.1/ Mẫu vật: Chuột nhắt trắng Swiss Albino, 6-8 tuần, 18-22g III.1.2/ Hóa chất: • Cồn 70o Trypsin/EDTA 0.25%/1% • Mơi trường DMEM/F12 FBS 10% PBS (kháng sinh 5X, 2X, 1X) III.1.3/ Dụng cụ: Erlen 250 ml, 50 ml Becher 50 ml Kẹp Kéo Đĩa petri φ9-10 Ống ly tâm loại 15 cm Buồng đếm hồng cầu, lamelle Đầu tip 1ml; 0.1ml Micropipette Flask 25 cm2 Khay rác Kim tiêm 1ml Nhóm III/ Vật liệu, phương pháp III.2/ Phương pháp: III.2.1/ Thu nhận xương đùi cẳng chân chuột III.2.2/ Thu nhận quần thể tế bào tủy xương III.2.3/ Thay môi trường III.2.4/ Cấy chuyền III.2.5/ Đông lạnh III.2.6/ Giải đông III.2.7/ Xác định mật độ, tỉ lệ sống chết tế bào Nhóm III/ Vật liệu, phương pháp III.1/ Phương pháp: III.2.1/ Thu mẫu sơ cấp: Thu nhận xương đùi cẳng chân chuột Giết chuột: kéo giãn đốt sống cổ Sát trùng, bật đèn cồn => Đảm bảo mt vô trùng Sát trùng - cồn 70o Cắt da bụng Đã loại bỏ da, lông Thu đùi, cẳng chân Tránh cắt phạm vào xương =>Hạn chế nhiễm Trữ mẫu PBS kháng sinh 5X Nhóm 7 III/ Vật liệu, phương pháp III.1/ Phương pháp: III.2.2/ Thu nhận quần thể tế bào tủy xương: Đảm bảo mt vô trùng Chuyển Falcon chứa mẫu vào tủ ATSH Rửa mẫu PBS 2X Cắt theo bó => Sạch, tiết kiệm thời gian Loại PBS 1X Cắt rời xương đùi xương cẳng chân Vừa đủ, nhanh, tránh làm vỡ xương Cắt hai đầu xương Rửa hai đầu => Thu nhiều tb Tránh làm rớt xương => Nhiễm Giữ kim vô trùng Dùng kim tiêm 1ml, hút mt, dội rửa tủy xương => Thu tb Huyền phù tb, chuyển vào flask, đem ni Nhóm Huyền phù kĩ, tránh tạo bọt Cho vào Flask => Tránh chạm miệng III/ Vật liệu, phương pháp III.1/ Phương pháp: III.2.3 Thay mơi trường: Mục đích: thay mơi trường mới, giúp tb tăng sinh đủ lượng để cấy chuyền Chiếu tủ, vô trùng dụng cụ Hút bỏ mt cũ Tránh chạm miệng Roux Nhỏ lên thành, không nhỏ trực tiếp lên bề mặt Rửa PBSTráng nhẹ Hút bỏ PBS- 3ml => Cung cấp đủ dinh dưỡng, oxi cho tb Hút nhả nhẹ nhàng => Tránh tạo bọt, văng ngồi, nhiễm Cho 3ml mt Tủ ni tế bào: 37 độ C, 5% CO2 Quan sát KHV, đem nuôi Nhóm III/ Vật liệu, phương pháp III.1/ Phương pháp: III.2.4/ Cấy chuyền: Mục đích: Cung cấp thêm khơng gian, dinh dưỡng cho tế bào Hút bỏ mt cũ Tạo điều kiện tối ưu cho trypsin hoạt động Rửa 2ml PBSTách 1ml trypsin Ủ 3’ (37độ, 5% CO2) Kiểm tra tế bào tách hết chưa? Quan sát KHV Thêm 1ml mt nuôi Bất hoạt Trypsin Chuyển falcon Ly tâm 2000 rpm, 5’ Thu cặn Thêm 1ml mt, huyền phù, cho vào Flask Không đổ trực tiếp, phải dùng pipette để hút Nhóm 10 PHẦN 2: THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM I/ Mục tiêu II/ Mẫu vật III/ Nguyên tắc IV/ Kết - Giải thích V/ Lưu ý VI/ Kết luận – Kiến nghị Nhóm 21 I/ Mục tiêu Nắm được: Các thao tác giao tử đực Phương pháp thụ tinh ống nghiệm Quá trình phát triển phôi II/ Mẫu vật Chuột nhắt trắng 6-8 tuần, 18-22g Nhóm 22 III/ Nguyên tắc Tiêm chuột a) Tiêm hoormon: - Cầm chuột ngửa, dốc ngược chuột xuống => tránh tiêm vào nội tạng - Tiêm vào khoang bụng vị trí: giao điểm hai đường chéo nối cặp vú - 5h45’ 03/11 tiêm PMSG: 0.1ml (100IU/ml) Sau 46-48h 17h15’ tiêm hCG: 0.1 ml (100IU/ml) b) Tiêm thuốc mê Ketamin: - Tiêm vào bó đùi - Mũi kim song song với xương đùi - Liều: 0.1 ml Lọc dầu khoáng: - Giữ màng lọc vơ trùng - Hút dầu khống lớp (vì lớp nước) - Khi bơm dầu khống qua màng lọc, bơm từ từ Nhóm 23 III/ Nguyên tắc Tạo vi giọt: • Các vi giọt khơng chạm vào nhau, khơng chạm vào thành • Dầu khống phải phủ kín vi giọt => Tránh nhiễm, tránh thay đổi nồng độ chất • Sau tạo vi giọt, tiến hành ủ ấm mt thời gian định để cân pha khí • Tạo vi giọt đứng nằm Kéo kim: • Kim đầu lớn: kéo chậm, đoạn kéo ngắn, góc kéo 135o • Kim đầu nhỏ: kéo nhanh, đoạn kéo dài, góc kéo 135o • Mài nhẹ, cách đầu kim khoảng 3cm, tránh để mẻ đầu kim Nhóm 24 III/ Nguyên tắc Chọn giao tử: a) Giao tử đực: • Chọn tinh trùng sống, không dị dạng, di động, tiến tới • Mật độ tinh trùng: 1- 2.5x106 tt/ml b) Giao tử cái: • Chọn trứng trịn, khơng phân mảnh, có lớp cumulus • Chọn trứng trưởng thành: cực thứ Nhóm 25 IV/ Kết - Giải thích Thu giao tử cái: • Thu buồng trứng, ống dẫn trứng phần tử cung • Thu cụm trứng đoạn bóng: 4-5 trứng, tế bào trứng suốt, dính với bao quanh tế bào cumulus • Chuyển cụm trứng sang giọt hyaluronidase để tách riêng loại bớt cumulus • Trong q trình chuyển trứng sau làm trứng thao tác không cẩn thận Thu giao tử đực: • Thu nhận mào tinh ống dẫn tinh • Thu tinh dịch khúc gấp đầu ống dẫn tinh • Swim-up thu nhận 0,3ml dd đem đánh giá Nhóm 26 IV/ Kết - Giải thích Số lượng Sống + di động Sống + không di động 31 19 Chết Độ di động Tỉ lệ sống Mật độ V fer (2.5 x10 tt/ml) 62% 92,5% 1,08 X 106 120,96 ul (25 ô) So với nhóm 8: Mật độ tinh trùng 0,74 x 106 (tt/ml) % tinh trùng sống: 91,9% Nhóm 27 IV/ Kết - Giải thích • Đánh giá trứng: 1) Trước thụ tinh 2) Sau thụ tinh 3) Đánh giá tỷ lệ phôi sống chết sau thụ tinh: Nhóm 28 IV/ Kết - Giải thích Hình 1: Hình trứng trước thụ tinh nhóm • • • Màng tế bào trịn rõ Màng zona nguyên vẹn Có thể cực thứ Nhóm 29 IV/ Kết - Giải thích Hình 2: Hình trứng sau thụ tinh nhóm  Màng tế bào cịn ngun  Có thể cực  Tế bào chất co lại => trứng chết (do khơng thụ tinh được) Nhóm 30 IV/ Kết - Giải thích  Nhuộm Hoechst: Sáng  Nhuộm PI: Sáng => Trứng chết (vì chưa thụ tinh) Hình 3: Kết nhuộm huỳnh quang miễn dịch: khơng nhuộm, nhuộm Hoechst, nhuộm PI (từ trái sang) nhóm Nhóm 31 V/ Lưu ý Phân biệt nhận biết xác quan sinh sản chuột đực chuột Tránh cắt sai, nhầm lẫn với quan khác • Mổ chuột thu buồng trứng phần ống dẫn trứng: mổ phần ½ nửa thân chuột • Mổ chuột đực thu mào tinh phần ống dẫn tinh: phần ½ nửa thân chuột đực • Thao tác mổ chuột nhanh, xác, tránh nhiễm trùng, khâu vết thương chặt phương pháp Thu giao tử cần thời gian Hiểu rõ nguyên tắc thí nghiệm, bước tiến hành trước thao tác Khi đếm tinh trùng buồng đếm hồng cầu: phân biệt tinh trùng loại tế bào bị trộn lẫn vào Phân biệt hình thái trứng tốt, trứng xấu, trứng trưởng thành, trứng thụ tinh, phôi sống, phơi chết Theo dõi quan sát hình thái phôi liên tục để nhận biết thay đổi kịp thời Nhóm 32 VI/ Kết luận – Kiến nghị 1) Kết luận: • Xác định quan sinh sản đực chuột=> thu giao tử đực cụm trứng- cumulus • Khơng thu trứng => thao tác sai dẫn tới trứng • Tạo vi giọt thụ tinh nuôi phôi Không thực thụ tinh ni phơi khơng có trứng (mất q trình thao tác) • Biết hình thái phát triển phôi qua giai đoạn (theo dõi kết nhóm khác) • Chuột chết sau phẫu thuật thao tác khâu vết thương không kĩ, bị bung 2) Kiến nghị: • Cần luyện tập thêm thao tác: khâu vết thương, chuyển trứng… Nhóm 33 Tài liệu tham khảo: Giáo trình thực tập chun ngành Cơng nghệ sinh học Y dược Sách Công nghệ Tế bào gốc Sách Công nghệ hỗ trợ sinh sản Sách Công nghệ sinh học người động vật Nhóm 34 Nhóm 35 ... luyện tập thêm thao tác: khâu vết thương, chuyển trứng… Nhóm 33 Tài liệu tham khảo: Giáo trình thực tập chuyên ngành Công nghệ sinh học Y dược Sách Công nghệ Tế bào gốc Sách Công nghệ hỗ trợ sinh. .. thích Thực tập chuyên ngành CNSH Y Dược – PTN TBG Thu mMSC từ t? ?y xương chuột Dòng MCF7 Thu mẫu sơ cấp Ng? ?y Ng? ?y C? ?y chuyền Thu mẫu thứ cấp Mật độ 70-90% C? ?y chuyền cell scrapper Đông lạnh Ng? ?y Giải... Thay mt C? ?y chuyền dịng MCF7 Trypsin Nhóm Ng? ?y 14 IV/ Kết quả- Giải thích Ni sơ cấp • Thu xương đùi, xương cẳng chân • Thu hỗn hợp tế bào từ t? ?y xương chuột  Cắt phạm đầu sụn xương đùi => Nguy