PHAN 1: NUOI CAY TE BAO DONG VAT
Tổng quan tài liệu
Vật liệu và phương pháp
Trang 2
1 TONG QUAN TAI LIEU
- Nudi cay té bào động vật là một kỹ thuật cơ bản, không
thể thiếu và được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và
ứng dụng y, sinh
- Bài thực tập này cung cấp những kiến thức và kỹ năng cơ bản trong kỹ thuật nuôi cấy tế bào từ tủy xương chuột,
bao gồm các thao tác cụ thể về thu nhận xương, mô tủy,
Trang 32 VAT LIEU VA PHUONG PHAP
2.1 VAT LIEU
2.1.1 Mau vat:
Chuột nhắt trắng do Phịng thí nghiệm Tế bào gốc cung 2.1.3 Dụng cụ cấp
Tế bào máu cuốn rốn (cấy chuyền) 2.1.2 Hóa chất
Con 70°
Dung dich PBS (khang sinh 5X, 2X va 1X) Trypsin/EDTA 0,25%/1%
Môi trường DMEM/F12 FBS 10% DMSO
Trypan blue
Erlen 250ml, 50ml; becher 50ml
Kẹp thẳng, kẹp cong; kéo thẳng, kéo cong
Đĩa petri đường kính 9-10cm
Ống ly tâm loại 15ml
Buồng đếm hồng cầu, lamelle
Đầu tip 1ml, 0.1ml; micropipette
Bình Flask 25cm
Khay rác Kim tiêm 1mI
Cell scraper
Ống bóp
Trang 42 VAT LIEU VA PHUONG PHAP
2.2 PHUONG PHAP
2.2.1 Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất
- Gói dụng cụ:
Y Becher 50ml: bọc giấy bạc bên trong và giấy thường bên ngoài miệng becher
* Kẹp cong và kẹp thẳng, kéo to, kéo nhỏ: gói giấy bạc ở mũi kẹp và mũi kéo > gộp chung và gói trong giấy A4
*« Duran: gói đầu hút trước, gói đầu cịn lại sau, gói không quá chặt hay quá lỏng
* Đĩa petri: gói bằng giấy thường, úp đĩa xuống trước khi gói
Y Pau tip 1 ml va 0.1 mI bo vao becher > bọc giấy bạc bên trong và giấy thường bên ngoài miệng
becher
- Hấp khử trùng đồ nhiệt độ ẩm: 120°C trong 30 phút, 1 atm
- Pha mồi trường PBS, V = 1l, pH=7,4: Y KCI:0.2g
VY NaCl: 8g
Trang 62 VAT LIEU VA PHUONG PHAP
2.2 PHUONG PHAP
2.2.2 Thu nhận xương đùi và xương cang chân chuột
Kéo dẫn đốt sống chuột Cắt da bụng chuột
Thu đùi chuột
Trang 7
2 VAT LIEU VA PHUONG PHAP
2.2 PHUONG PHAP
2.2.3 Thu nhận quần thể tế bào tủy xương e Rửa 2 chân bằng dung dịch PBS 2-3 lần
e Loại bỏ hoàn tồn phần cơ cịn sót lại
e Cắt rời đoạn xương đùi và xương cằng chân
e Hút 3ml môi trường nuôi tế bào vào becher
e Dùng kim tiêm 1ml hút và bơm môi trường nuôi tế bào vào tủy xương để dội rửa thu tế bào tủy xương
e Thực hiện đến khi ống xương chuyển sang màu trắng
se Dung dịch huyền phù tế bào được chia làm 2 phần:
e Phần 1: 1 giọt dung dịch cho vào eppendorf để xác định tỉ lệ sống chết
e Phan 2: dung dịch huyền phù tế bào cịn lại cho vào bình Roux, đem đi chụp hình ở vật kính 5X, 10X và 20X, sau đó ni cấy ở 379C, 5% CO 8
Trang 82 VAT LIEU VA PHUONG PHAP
2.2 PHUONG PHAP
2.2.4 Xác định tỉ lệ sống chết của tế bào
“ >
- Chuẩn bị buồng đếm hồng cầu (rửa sạch và lau khô)
- Pha lodng mau vdi trypan blue theo ti Ié 1:1 > Tron mau
bang 3 P PS pipet oo ¬ le Tinh mat do te bao: „ ¬
- Phu buong dém với lamelle va su dung pipet nap mau vao Số tế bào đếm đươc
góc lõm hình chữ V A= E — x 10* x 20 (té bao/ml)
`
IA x ~„ Số tế bào chết (bat mau) ọ
% Tỉ lệ sống chết: * tế bào đếm được x 100%
- Đặt buồng đếm lên kính hiển vi quang học
Trang 92 VAT LIEU VA PHUONG PHAP
2.2 PHUONG PHAP
2.2.5 Thao tac thay moi trudng
Hut bo toan bo mồi trường cũ Rửa tế bào bằng dung dịch PBS Bổ sung môi trường nuồi
cấy mới cho tế 10
Trang 102 VAT LIEU VA PHUONG PHAP
2.2 PHUONG PHAP
2.2.6 Thao tac cay chuyền
v
se Hút bỏ môi trường cũ |
e BO sung Trypsin / EDTA 0,25%, U 6 37°C, 5% CO, tur 3-5 phut
e BO sung 3ml moi trudng nudi cay, chuyén huyén phu té bao vao falcon 15m, ly tâm thu tế
bao
e Loại bỏ dịch nổi, huyền phù tế bào trong môi trường nuôi cấy tùy theo tỉ lệ cấy chuyền ( 1:2 :
_ fas hoac 1:3)
Trang 11
2 VAT LIEU VA PHUONG PHAP
2.2 PHUONG PHAP
2.2.7 Thao tác đồng lạnh tế bào
Thay möi trường - Bỏ mồi trường cũ
- Rửa PBS
- Thay mồi trường mới
Tách tế bào - Bổ sung trypsin - Ly tâm Thu cặn tế bào
- Huyền phù cùng môi trường nuôi
Bổ sung môi trường đông lạnh 2X
Huyền phù cùng môi trường nuôi
Chuyển dịch huyền phù vào Cryotube
Ghi thông tin và đồng lạnh chậm với nhiệt
độ giảm dần: 440C, / 30 phút;
-20°C/ th; -80°C/ 16h
Dat mau vao binh nito long
Do mật độ tế bào tủy xương chuột vẫn còn thấp nên nhóm được giao tế bào máu cuống rốn để thực hiện việc đông lạnh và giải đông tế bào
Trang 122 VAT LIEU VA PHUONG PHAP
2.2 PHUONG PHAP
2.2.8 Giải đông tế bao
se Lấy các ống đồng lạnh tế bào ra khỏi bình nitơ lỏng
e« Kiểm tra nhãn và nắp
se Giữ ống đơng lạnh ngồi khơng khí khoảng 30 giây
`
chi s Đặt tồn bộ ống đơng lạnh vào bể ổn nhiệt 37°C và lắc nhẹ cho đến khi khối rắn bên trong ống tan hết
2
e Rửa tế bào bằng li tâm dịch tế bào trong môi trường giải đông
maa se Tái huyền phù tế bào trong môi trường mới
e Trải tế bào vào đĩa nuôi với mật độ cao từ 2-3x10 tế bào/cm2
Trang 13
3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1 NGÀY 1: CHUAN BI DUNG CU VA HĨA CHẤT
» Gói hấp đầy đủ dụng cụ cho khóa thực tập
s*Pha được 1Ì dung dịch PBS
* Hiểu được một số quy trình an tồn phịng thí nghiệm và nguyên tắc
Trang 143 KẾT QUẢ VÀ BIỆNLUẬN |
3.2 NGAY 2: NUOI CAY SO CAP
Sau khi tách từ tủy xương, ta quan sát được các loại tế bào:
-Hồng cầu: tròn, nhỏ, lõm ở giữa,
kích thước khoảng 6m
‹Tế bào tủy xương chuột: đa dạng về kích thước, hình dạng
(tron, thoi, bau duc )
‹Có cả tế bào đơn và cụm tế bào, mảnh mồ nhỏ do khi thao tác
chưa huyền phù đủ mạnh và đủ
lâu
Mật độ tế bào: 1,032.107 (tế
Trang 15
3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ị
3.3 NGÀY 3: THAY MỖI TRƯỜNG LẦN 1
Trước Sau
Môi trường nuôi cấy chuyển từ hồng sang vàng cam do pH môi trường giảm
- Trước khi thay môi trường: Quan sát được có rất nhiều tế bào có hình dạng trịn (khơng bám
dính), rất ít tế bào hình thoi dài (bám dính) > lượng tế bào bám dính rất ít
- Sau khi thay mồi trường: °
Trang 16
3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ị
3.4 NGÀY 4: THAY MỖI TRƯỜNG LẦN 2
Lần 1 Lần 2
v S$o với sau khi thay môi trường lần 1 thì thay mơi trường lần 2: các tế bào bám dính (tế bào tủy xương chuột, hình thoi dài) xuất hiện nhiều hơn, mật độ dày đặc hơn do thời gian nuôi cấy đã đủ dài để tế bào phân chia, đồng thời các chất dinh dưỡng nuôi tế bào cũng được cung cấp đây đủ và môi
trường ni cấy thích hợp ‘
Trang 173 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.4 NGÀY 4: ĐÔNG LẠNH VÀ GIẢI ĐÔNG
- Mật độ tế bào khá thấp
- Sau giải đơng có một số tế bào sống và một số tế bào chết:
Tế bào có thể sống là những tế bào còn màng tế bào nguyên vẹn, trịn, và khơng có hiện tượng phóng thích nhân
v Tế bào chết là màng tế bào bị vỡ, có hiện tượng
phóng thích nhân ra ngồi - Giải thích:
v« Qúa trình giải đơng chậm làm tế bào chết khá
nhiều
«Phương pháp loại chất bảo quản lạnh không phù
hợp
v Một số lỗi thao tác mắc phải: nhỏ dung dịch giải
đồng quá nhanh, bị bọt ở miệng bình Roux
Trang 18
4 ĐỀ XUẤT VÀ KIẾN NGHỊ
Thời lượng khóa thực tập cần kéo dài hơn để sinh viên có thể quen
hơn với các thao tác nuôi cấy tế bào
Thời gian khóa thực tập cần sắp xếp hợp lý hơn để kéo dài thời
lượng
Cần có một ngày để sinh viên luyện tập trước các quy trình căn
Trang 19PHAN 2: THU TINH TRONG ONG NGHIÊM
Một số phương pháp được học trong
khóa thực tập
Kết quả và biện luận Những điều cần lưu ý
Trang 201 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐƯỢC HỌC TRONG KHÓA THỰC TẬP
1.1 PHƯƠNG PHÁP LỌC DẦU KHOÁNG
» Tác dụng của dầu khoáng:
* Ngăn cản sự xâm nhập của các vỉ khuẩn, bào tử nấm * Ngăn cản sự bốc hơi của môi trường
v Tạo sự ổn định về áp suất thẩm thấu, pH
‹»Phương pháp:
Hút dầu khoáng vào xilanh
+ Gắn xilanh lên màng lọc dầu khoáng
* Đặt bộ dụng cụ lọc dầu khoáng lên falcon
* Bơm dầu khoáng vào falcon thông qua màng lọc
s* Một số lưu ý
Không để màng lọc dầu tiếp xúc với các vật thể khác
Trang 211 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐƯỢC HỌC TRONG KHÓA THỰC TẬP
1.2 PHƯƠNG PHÁP KÉO PIPET PASTEUR
s* Pipette Pasteur là pipette thủy tỉnh, sử dụng trong thao tác
chuyển trứng, phôi vào các vi giọt trong quá trình giữ trứng, và thụ
tỉnh
s*Phương pháp:
- Để khoảng giữa ống thủy tỉnh trên ngọn lửa đèn cồn, xoay đều cho đến khi thủy tỉnh chảy ra, mang ra khỏi ngọn lửa và kéo đều tay
- Dùng dũa khứa một đường trên thân mới kéo > Dùng kẹp bẻ, bo
phần dư > dùng dũa để tạo phần đầu pipette bằng phẳng hơn
Trang 221 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐƯỢC HỌC TRONG KHÓA THỰC TẬP
1.2 PHƯƠNG PHÁP KÉO PIPET PASTEUR
ss» Một số lưu ý:
Tùy vào kích thước của trứng/ phơi mà ta kéo đầu pipette có
kích thước phù hợp
- Kéo đầu lớn: hơ đoạn dài
trên thân, kéo khoảng ngắn
- Kéo đầu nhỏ: hơ đoạn
ngắn, kéo khoảng dài
Trang 231 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐƯỢC HỌC TRONG KHÓA THỰC TẬP
1.3 PHƯƠNG PHÁP TẠO VI GIỌT
Vi giọt là mỗi trường giữ
trứng, phoi va la moi trường thụ
° Đĩa loại cumulus 1 giọt 10 u¡ Fertimed
tỉnh 3 giọt 50 u¡ Fertimed
s»Vi giọt ngập trong dầu khoáng 2 giọt 10 ul Fertimed
đề tránh sự xâm nhập của vị MS 2 giọt 10+40 ul Fertimed
sinh vật và ngắn sự thoát hol Beni 4 giọt 10+40 ui Embryo nước của vỉ giọt
s+» Có hai loại vi giọt: Vi giọt đứng
và vỉ giọt nằm
Trang 24
1 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐƯỢC HỌC TRONG KHÓA THỰC TẬP
1.4 PHƯƠNG PHÁP GAY ME CHUOT
Gây mê chuột để thuận tiện hơn trong quá trình thu trứng và thu tỉnh, tránh các tổn thương cho chuột cũng như ảnh
hưởng đến kết quả thí nghiệm
s* Liều lượng : 1mIl/ lần
s*Tùy vào tuổi đời và sức chịu đựng của chuột mà cần tiêm
liều lượng cho phù hợp
s+*Lưu ý: tiêm vào cơ, tránh tiêm vào xương, tránh gây chảy
máu, thời gian cho mỗi liều gây mê trung bình khoảng 30
Trang 251 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐƯỢC HỌC TRONG KHÓA THỰC TẬP
1.5 NGUYÊN TẮC CHỌN GIAO TỬ
*Nguyên tắc chọn giao tử cái:
Vv Mau sac: sang, thé cực lớn
Y Trifng tron déu, khong thay duoc nhân v Tế bào chất min
Nguyên tắc chọn giao tử đực:
v Thu tỉnh từ ống dẫn tỉnh, tách mỡ thừa
Trang 26
2 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Trang 272 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
2.1 CHUAN BI TRUNG
2.1.1 Thu nhận trứng
v Giao tử cái được thu từ một phần tử cung, ống dẫn trứng và buồng
trứng
Quan sát dưới kính hiển vi soi nổi> dò tìm đoạn phình to ra, đây
chính là đoạn bóng > xé đoạn bóng > cụm trứng chui ra > tiến hành thu cụm trứng bằng pipette pasteur và xử lý
2.1.2 Phân loại trứng
v«x Trứng trưởng thành: có một thể cực, một nỗn hồn lớn và khơng
thấy được nhân, có lớp tết bào cumulus bao quanh v Trứng non: không nhìn thấy nhân
Trang 282 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 2.1 CHUẨN BỊ TRỨNG m Thu trứng từ đoạn bóng -_ Hình dạng trứng: trịn, trắng, trong và thành cụm, có lớp tế bao
cumulus bao quanh tạo thành phức hợp trưứng/cumulus
- _ Số lượng trứng thu được: 3
Trang 292 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
2.2 CHUẨN BỊ TINH TRÙNG
2.2.1 Thu nhận tỉnh trùng
= Thu tỉnh trùng từ ống dẫn tỉnh và tỉnh hoàn
= Thu tinh dich sau do cho vao dung dich Swim up để thu nhận những tỉnh trùng “chất lượng"
2.2.2 Đánh giá chất lượng tỉnh dịch và tỉnh trùng
= Mật độ tỉnh trùng tối ưu là 1-2,5.10Ê (tỉnh trùng/mI)
= Số tỉnh trùng sống: 254
=_ Số tỉnh trùng di động: 12/254> % độ di động: 4.72% > độ di động quá thấp
254 4+25
—> Mật độ tỉnh trùng: x 10 x 2=B,08*10Ê > chưa đạt mức tối ưu
=_ Độ dị hình của tỉnh trùng: đa dạng nhiều loại như đầu vô định hình, khơng có đầu, đầu ghim, đầu
dạng chuối, "
Trang 302 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
2.3 THỤ TINH
Trứng sau khi thụ tinh/trước khi chuyển phôi
Trang 312 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
yam One
Đánh giá trứng sau khi chuyển phôi
1 Không xảy ra thụ tỉnh
2 Tể bào chất bên trong trào ra
ngoài nhưng vẫn cịn dính với tế
bào
3 Màng trứng còn nguyên hoặc tế
bào chất bị đầy ra ngoài
Trang 322 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
2.3 THU TINH
»Nguyên nhân:
1 Trứng: yếu và chết, do:
= Trứng rất nhạy cảm, đặc biệt với nhiệt độ nhưng thao tác lâu (thu
trứng, chuyển trứng) trên kính
= Thao tác hút, chuyển trứng làm tổn thương trứng
2.Tinh trùng: mật độ tỉnh trùng và phần trăm tỉnh trùng di động thấp
Trang 33
3 KẾT LUẬN
s* Thu giao tử cái:
- - Phẫu thuật chuột và thu một phần ống dẫn trứng + buồng trứng
°‹ - Thu cụm trứng > xé đoạn bóng và thu được 3 trứng
‹Ị - Trứng trịn, có lớp cumulus, té bao chất đều, khơng thấy nhân -© Chuột khỏe mạnh sau khi thu giao tử
s*Thu giao tử đực:
- - Phẫu thuật chuột và thu mào tỉnh + ống dẫn tinh ‹ - Thu tỉnh trùng từ ống dẫn tỉnh
‹ - Độ di động của tỉnh trùng thấp
Trang 343 KẾT LUẬN
s*»Thụ tỉnh:
“" Chuyển trứng vào đĩa thụ tỉnh thành công
s*» Phôi:
=" Trứng chết và tỉnh trùng yếu nên sau 43h thụ tỉnh không thu được phôi
: Không thực hiện được kỹ thuật nhuộm Hoechst — PI để phân biệt phôi
sống/chết
>Thụ tỉnh trong ống nghiệm không thành cơng
s» Chuột thí nghiệm
“" Chuột đực: chết, nguyên nhân có thể do sốc thuốc mê =" Chuột cái: hồi phục, vết mổ lành
Trang 35MỘT SỐ VẤN ĐỀ LƯU Ý/KHÓ KHĂN TRONG KHÓA
THỰC TẬP
- Khơng có đủ thời gian để luyện tập các thao tác như kéo kim, tạo vi giọt, chuyển trứng dẫn tới việc lúng túng và dễ mắc sai lầm trong lúc làm thí nghiệm
-_ Không đủ thiết bị và dụng cụ để tất cả các thành viên trong nhóm được làm quen
với tất cả các thao tác và thực hiện một cách nhuần nhuyễn
- _ Thao tác mổ chuột không nhanh, làm quá thời gian gây mê nên chuột phải tiêm
thuốc gây mê lần 2 > gây ảnh hưởng đến sức khỏe của chuột
-_ Thời gian khóa thực tập khá ngắn nên một số thao tác phải nhờ thầy cô làm giúp
- Kết quả thụ tỉnh không thành công nên không làm quen được các thao tác sau thụ tỉnh
Trang 364 ĐỀ XUẤT VÀ KIỂN NGHỊ
v Kéo dài khóa thực tập để sinh viên có cơ hội thực hành nhiều hơn
vThời gian thực tập hợp lý hơn, để sinh viên có thể làm quen với tất
cả các thao tác
v Mỗi nhóm cần ít nhất 2 chuột để tiến hành thu tỉnh và trứng, theo
dõi sức khỏe của chính chuột nhóm mình, từ đó biết được sự ảnh hưởng của các yếu tổ bên ngồi đến q trình làm thí nghiệm
Trang 37XIN CAM ON THAY CO DA CHU Y