nuôi cấy tế bào động vật thụ tinh trong ống nghiệm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC-CÔNG NGHỆ SINH HỌC Báo cáo THỰC TẬP CHUYÊN NGÀNH PHẦN PHẦN NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM ĐẶT VẤN ĐỀ CƠ SỞ LÝ THUYẾT VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP KẾT QUẢ - GIẢI THÍCH KHĨ KHĂN-KHẮC PHỤC PHẦN 1: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT THU XƯƠNG ĐÙI VÀ XƯƠNG CẲNG CHÂN CHUỘT 1.1 1.2 THU QUẦN THỂ TẾ BÀO TRONG TỦY XƯƠNG 1.3XÁC ĐỊNH MẬT ĐỘ TẾ BÀO NUÔI TẾ BÀO TỦY XƯƠNG SAU NGÀY 1.4 THAO TÁC THAY MÔI TRƯỜNG 1.5 CẤY CHUYỀN VÀ ĐƠNG LẠNH 1.6 1.7GIẢI ĐƠNG VÀ HOẠT HĨA TẾ BÀO Sơ đồ phịng thí nghiệm Phịng hấp rửa Phịng ni cấy tế bào Phòng IVF Phòng sinh học phân tử Phịng thay đồ *Cửa vào có máy qt phân quyền sử dụng -> an tồn, bảo mật *Các phịng phân cách bố trí dựa theo mức độ vơ trùng: phịng ni cấy tế bào cần mức độ vơ trùng cao -> trước vào cần qua phịng thổi khí (Air shower) Pha PBS: Dụng cụ: Duran 1L, Erlen 1L, giấy bac, giấy trắng, giấy thị nhiệt, máy hấp, máy khuấy từ, cá khuấy từ, cân phân tích, giấy cân, nước cất lần, nước cất lần, ống đong 1L, găng tay, thun Thành phần 1L Lý thuyết Thực tế NaCl 8g NaCl 8.0011g Na2HPO4.12H20 2.9384g Na2HPO4.12H20 2.9334g KCl 0.2g KCl 0.2033g KH2PO4 0.2g KH2PO4 0.2016g ĐẶT VẤN ĐỀ Nuôi cấy tế bào động vật kĩ thuật cần nắm để tiến hành thí nghiệm liên quan đến tế bào động vật, đóng vai trị quan trọng nghiên cứu Y, Sinh, Dược CƠ SỞ LÝ THUYẾT ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO GỐC TRUNG MƠ (MSC) Đặc điểm hình dạng Thuôn dài, nguyên bào sợi Đặc điểm in vitro (theo Dominici cộng sự, 2006) Bám dính lên plastic ( điều kiện ni cấy tiêu chuẩn) Kháng nguyên bề mặt đặc trưng (CD105, CD73, CD90), không biểu CD45, CD34, CD14 or CD11b, CD79α or CD19 and HLA-DR Biệt hóa thành nhiều loại tế bào: sụn, xương, mỡ (TBG đa năng) 1.1 THU NHẬN XƯƠNG ĐÙI VÀ XƯƠNG CẲNG CHÂN CHUỘT VẬT LIỆU MẪU VẬT: PHƯƠNG PHÁP Kéo giãn đốt sống cổ - Chuột nhắt trắng Sát trùng cắt ngang bụng 0 - Dung dịch PBS (kháng sinh 5X), cồn 90 , cồn 70 Loại da, cắt ngang khớp háng gót chân DỤNG CỤ: - Khay rác, kéo lớn, kéo nhỏ, kẹp, falcon 15ml, đèn cồn, găng tay, trang Thu chân lông, da => Falcon 15ml PBS có kháng sinh - Tủ kính lớn Tủ an tồn sinh học cấp II VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP HÓA CHẤT: 1.1 THU NHẬN XƯƠNG ĐÙI VÀ XƯƠNG CẲNG CHÂN CHUỘT KẾT QUẢ - GIẢI THÍCH Thu tồn vẹn chân chuột gồm xương đùi, xương cẳng chân, phần khớp khơng bị cắt phạm, cịn dính lơng Khó khăn Thao tác xử lý chuột chưa thục Cách khắc phục Luyện tập nhiều 1.2 THU NHẬN QUẦN THỂ TẾ BÀO TRONG TỦY XƯƠNG VẬT LIỆU Mẫu vật: Xương đùi chuột PHƯƠNG PHÁP Đùi chuột (PBS kháng sinh 5X) Hóa chất: - Dung dịch PBS kháng sinh 2X, 1X Falcon PBS kháng sinh 2X - Môi trường DMEM/F12 FBS 10% - Cồn 700 Dụng cụ: Petri PBS kháng sinh 1X Loại bỏ - Kẹp cong, Kẹp thẳng, Kéo thẳng - Đĩa petri đường kính 9-10cm, Becher 50ml - Giá để falcon, Pipette, Kim tiêm 1ml Petri PBS kháng sinh 1X Đếm mật độ Loại bỏ cịn sót lại - Bình flask 25cm2, Eppendorf 1.5ml flask - Găng tay, khăn lau Thiết bị: - Tủ an tồn sinh học - Kính hiển vi đảo ngược Soi kính hiển vi Cắt đầu xương, bơm rửa tủy xương DMEM/F12 FBS 10% nuôi 1.2 THU NHẬN QUẦN THỂ TẾ BÀO TRONG TỦY XƯƠNG KẾT QUẢ - GIẢI THÍCH Bảng 1: Các loại tế bào tủy xương cht Ø Hình thái Dự đốn loại tế bào 20-90µm Hơi tròn, viền lồi lõm Megakaryocyte, hủy cốt bào, Promegakaryocyte 12-20µm Trịn/hơi bầu dục, Pronormoblast, myeloblast, neutrophilic myelocyte, eosinophilic myelocyte, viền rõ eosinophil, basophilic myelocyte, lymphoblast, prolymphocyte, lymphocyte, plasma cell, monoblast, promonocyte, monocyte, Megakaryoblast, promyelocyte 10-15µm Khó khăn Cách khắc phục Mỏi tay trình loại bỏ Đặt kéo, kẹp gác lên miệng đĩa petri, để tay nghỉ Tròn/hơi bầu dục, basophilic normoblast, neutrophilic metamyelocyte, neutrophilic band, viền rõ segmented neutrophil, eosinophilic metamyelocyte, eosinophilic band, basophilic metamyelocyte, basophilic band, basophil, Khó tách Cắt riêng khúc xương -> tách khúc 8-10µm trịn Orthochromic normoblast, reticulocyte, Polychromatic erythroblast 7-8µm Trịn, lõm Hồng cầu (Bảng theo Bernadette F Rodak and Jacqueline H Carr, Clinical Hematology Atlas, 5th ed.2016) 2.1 THU NHẬN ỐNG DẪN TRỨNG VÀ MÀO TINH Vật liệu: Mẫu vật: - Chuột nhắt trắng (6-8 tuần) 18-22g, gây siêu noãn Phương pháp Kéo dãn đốt sống cổ (chuột đực) Tiêm thuốc mê (chuộc cái) - Chuột nhắt trắng đực (6-8 tuần) 18-22g Hóa chất: 0 - Cồn 70 ,90 ,chất sát trùng, Ketamin Cố định chuột lên khay Sát trùng, cạo lông PBS không kháng sinh Cắt da, Dụng cụ: - Khay inox, kéo thẳng, kẹp cong, kẹp thẳng - Kim tiêm, kim khâu, khâu, băng dính, dao lam, bơng thấm, đĩa petri, đèn cồn, bật lửa, Tìm vị trí ống dẫn trứng/ mào tinh băng cá nhân Khâu vết mổ, dán băng cá nhân Cắt, bảo quản PBS 2.1 THU NHẬN ỐNG DẪN TRỨNG VÀ MÀO TINH KẾT QUẢ - GIẢI THÍCH Thu được: buồng trứng, ống dẫn trứng nguyên vẹn phần tử cung mào tinh, phần cuối mào tinh đầu ống dẫn tinh phần ống dẫn tinh • Chuột khỏe mạnh sau mổ Khó khăn Cách khắc phục Khơng dám kéo đốt sống/chích thuốc mê Luyện tập nhiều Giữ nội tạng không chạm lông Sát trùng rộng, cạo lông kĩ rộng Xác định vùng cần thu Tìm vùng nhiều mỡ Cái ->kéo lật lên -> xác định tử cung -> buồng trứng Đực-> kéo xuống dưới-> tinh hoàn-> mào tinh-> ống dẫn Khâu không chặt Cố gắng kẹp chặt, kéo căng lần thắt Băng dính dính vào râu lơng chuột Tránh dán vào râu, gỡ thấm chất sát trùng vào băng dính (tránh dính mắt chuột) 2.2 THU NHẬN TRỨNG VÀ TINH TRÙNG VẬT LIỆU VẬT MẪU: Buồng trứng ống dẫn trứng, mào tinh ống dẫn tinh 0 HÓA CHẤT: Epp PBS, epp SWM, Đĩa có vi giọt Hyaluronidase, cồn 70 , 90 DỤNG CỤ: Đĩa Φ 35mm, khăn giấy, kim tiêm, kẹp, kéo nhỏ, đèn cồn THIẾT BỊ: Kính hiển vi, chuyển trứng, pipet pasteur Tử cung, buồng trứng ống dẫn trứng Cụm trứng 2.2 THU NHẬN TRỨNG VÀ TINH TRÙNG PHƯƠNG PHÁP THU TRỨNG PHƯƠNG PHÁP THU TINH Chodd ddPBS PBS vào đĩa Cho đĩaΦΦ35mm 35mm Lăn mào tinh ống dẫn tinh giấy, tách mỡ Chuyển ốngdẫn dẫntrứng trứng vào Chuyểnbuồng buồngtrứng trứng và ống vào Dồn tinh lên cấu trúc gấp Quan sát kính hiển vi, xác định Quan sát kính hiển vi, xác định đoạn bóng đoạn bóng Dùng kim tiêm chích Dùng xé xéđoạn đoạnbóng bóng Dùng22kim kimcố cố định định Thu dịch tinh trùng cho vào epp SWM, Quan sát KHV, xác định vị trí cụm trứng Chuyển cụm trứng sang vi giọt Hyaluronidase Chuyển trứng sang vi giọt fertimed cất giữ mào tinh 2.2 THU NHẬN TRỨNG VÀ TINH TRÙNG KẾT QUẢ - GIẢI THÍCH Thu tinh trùng: ống dẫn tinh bị đứt khỏi mào tinh, lượng tinh dịch thu không nhiều Thu trứng: cụm trứng Khó khăn : tinh dịch qnh, thất dính lên đầu kẹp Cách khắc phục Luyện tập nhiều 2.3 ĐẾM TINH TRÙNG CHUỘT VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP MẪU VẬT: epp chứa SWM+tinh trùng -epp chứa SWM+tinh trùng Swim-up 30’ VẬT LIỆU gồm: Hút dịch ( 300 µl) -Buồng đếm hồng cầu, Lamelle -Pipette, Eppendorf (2 epp), đầu tip 280µl -Cồn 70 , vải lau -epp chứa SWM Ly tâm, thu cặn 20µl epp 0.2ml HĨA CHẤT gồm: 10µl -Trypan blue -Fertimed THIẾT BỊ: FertiMed( 76µl) nhuộm Trypan Blue (1:1) -Kính hiển vi quang học -Máy ly tâm vi giọt 10µl (40µl/ vi giọt 1; 36µl/vi giọt 2) Đếm 2.3 ĐẾM TINH TRÙNG CHUỘT KẾT QUẢ - GIẢI THÍCH Đếm tinh trùng: ô buồng đếm (25 ô nhỏ)  Nguyên tắc đếm: tinh trùng di động tinh trùng không di động tinh trùng chết tinh trùng di động    tinh trùng không di động 18 trùng/ml) Mật độ tinh16trùng=37/(4x25)x 106x 2=74 x104(tinh tinh trùng chết Tổng số tinh trùng 37 % Tinh trùng chết=3/37x100= 8,1% % Độ di động=16/37x100=43,24% Khó khăn Cách khắc phục Tinh trùng di động khó đếm Đếm nhanh nguyên tắc Luyện tập nhiều 2.4 LOẠI CUMULUS: VẬT LIỆU - Đĩa vi giọt loại Cumulus: vi giọt 10 µl FertiMed+ 40ul Hyaluronidase(1), vi giọt 50 µl FertiMed(2,3,4) - Trứng chuột - Pipette Pasteur dây truyền nước biển - Kính hiển vi soi - Tủ ni tế bào PHƯƠNG PHÁP Chuyển cụm trứng tách vào vi giọt (1) để loại phần cumulus, tách trứng khỏi cụm trứng (15s)-> chuyển trứng qua vi giọt (2),(3), (4) để rửa enzyme KẾT QUẢ - GIẢI THÍCH KẾT QUẢ Thu cụm trứng, trứng chuyển qua vi giọt Hyaluronidase, trứng chuyển sang giọt fertimed GIẢI THÍCH Trứng cịn nhiều tế bào cumulus -> dính vào thành ống pipet Lực hút mạnh -> trứng kẹt chỗ gập Kính hiển vi mờ -> khơng thấy trứng 2.5 THỤ TINH VẬT LIỆU Đĩa vi giọt thụ tinh: giọt 10µl Fertimed+ 40µl(36µl) tinh trùng chuột (1, 2), giọt 10+40ul Fertimed (3, 4) Dụng cụ thiết bị tương tự phần loại cumulus PHƯƠNG PHÁP - Chuyển trứng từ vi giọt (4) đĩa loại cµmulus sang vi giọt (3), (4) đĩa thụ tinh để rửa chờ thụ tinh chuyển trứng vào vi giọt (1), (2) có chứa tinh trùng để thụ tinh ( vi giọt tối đa trứng) KẾT QUẢ - GIẢI THÍCH KẾT QUẢ Sau thụ tinh, trứng có tinh trùng xung quanh, thể cực, tế bào chất không mịn, khơng trịn dự đốn: trứng khơng thụ tinh GIẢI THÍCH Do chất lượng trứng khơng tốt Ghi chú: Do nhóm bị hết trứng từ bước loại cumulus nên từ bước thụ tinh nhóm mượn kết nhóm nhóm ( đồng ý nhóm bạn) để giải thích biện luận Trứng nhóm 2.6 NI PHƠI VẬT LIỆU Đĩa nuôi phôi gồm giọt 10ul+40ul Embryo Dụng cụ thiết bị tương tự phần • Phương pháp: ChuyểnPHƯƠNG trứng thụ tinh vào vào vi giọt (1) (2) để rửa tinh trùng quanh trứng PHÁP chuyển phôi vào vi giọt (3) (4) để nuôi (mỗi vi giọt tối đa phôi) KẾT QUẢ - GIẢI THÍCH KẾT QUẢ Trứng khơng thụ tinh, cịn ngun màng Zona, tế bào chất co lại, khơng mịn GIẢI THÍCH Trứng bị apoptosis, tế bào chất co lại-> vỡ thành phân tử nhỏ thoát qua lỗ nhỏ màng Zona thất thoát dần tế bào chất khoảng rỗng màng Zona màng sinh chất lớn (bình thường màng dính sát với nhau) Trứng nhóm 2.7 ĐÁNH GIÁ PHƠI SỐNG CHẾT Phơi sau nhuộm huỳnh quang (Phơi nhóm 6) Ánh sáng trắng Nhuộm Hoechst Nhuộm PI KẾT QUẢ GIẢI THÍCH Phôi chết Xuất ánh sáng nhuộm với PI KẾT LUẬN PHẦN 1: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG Nắm thao tác nuôi cấy tế bào động vật Phân lập nuôi cấy thành công tế bào đích (dự đốn tế bào gốc trung mơ MSC nhờ vào đặc điểm trải & bám dính) Cấy chuyền, đông lạnh giải đông tế bào ung thư vú MCF-7 PHẦN 2: THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM Nắm thao tác tinh trùng trứng Mất trứng trình thao tác (tách loại cumulus) Tinh trùng (thất thu nhận) => Kết luận: Khơng thực thao thác thụ tinh khơng cịn trứng Thụ tinh khơng thành cơng (khơng tạo phơi)( tham khảo kết nhóm 5) Nhuộm huỳnh quang Hoechst-PI: phơi chết (tham khảo kết nhóm 6) KIẾN NGHỊ PHẦN 1: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG  Mỗi nhóm thu quần thể tế bào từ chân chuột  Mật độ cao đủ để cấy chuyền thời gian thực tập  Các tế bào dự đoán MSC cần khảo sát đặc điểm invitro (theo Dominici cộng sự, 2006) nhằm khẳng định lại PHẦN 2: THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM Nếu trứng: dội rửa pipette Pasteur hyaluronidase tìm trứng kính hiển vi có độ phóng đại lớn Nếu Tinh trùng ít: giảm nồng độ tinh trùng cần cho thụ tinh từ 2.5x 106 xuống x106 (tinh trùng/ml), thu thêm tinh trùng từ epp dự trữ mào tinh ống dẫn tinh Đánh giá chất lượng trứng trước thụ tinh (tốt thụ tinh, không tốt khơng thụ tinh) Đề xuất phịng thí nghiệm làm phơi mẫu để quan sát hình thái phơi qua giai đoạn phát triển TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] M Dominici , K Le Blanc, I Mueller et al (2006), Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells The International Society for Cellular Therapy position statement [2] Trương Định, Trương Hải Nhung, Phạm Văn Phúc, Phan Kim Ngọc, Thu nhận biệt hố tế bào gốc trung mơ từ tuỷ xương chuột (mus musculus var albino) Đh Khoa Học Tự Nhiên TPHCM, Hội Nghị Khoa Học Và Công Nghệ 2007 [3] Giáo trình thực tập Chun Ngành Cơng Nghệ Sinh Học Y Dược, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Phịng Thí Nghiệm Nghiên Cứu Và Ứng Dụng Tế Bào Gốc [4] Bernadette F Rodak and Jacqueline H Carr, Clinical Hematology Atlas, 5th ed.2016 ...PHẦN PHẦN NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM ĐẶT VẤN ĐỀ CƠ SỞ LÝ THUYẾT VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP KẾT QUẢ - GIẢI THÍCH KHĨ KHĂN-KHẮC PHỤC PHẦN 1: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT THU XƯƠNG... LUẬN PHẦN 1: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG Nắm thao tác nuôi cấy tế bào động vật Phân lập nuôi cấy thành công tế bào đích (dự đốn tế bào gốc trung mơ MSC nhờ vào đặc điểm trải & bám dính) ? ?Cấy chuyền,... đếm tế bào Ô Số tế bào 28 sống 34 sống 34 sống 25 sống 22 sống chết chết chết chết chết Số TB trung bình=32 (Tế bào) Mật độ TB=32x 2x 10 = 6,4x10 (TB/ml) Tỉ lệ sống =28,6/32x100= 89,38% THỤ TINH