Chương 3 Nuôi cấy tế bào động vật phần 4 TS. Đặng Đức Long

Các k ỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật Các ph ương pháp chuyển gen • Phương pháp chuyển gen sử dụng virus • Phương pháp chuyển gen không sử dụng virus - Phương pháp hóa học -- Ph

Trang 1

CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

3.6 Các k ỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật

Trang 2

Các ph ương pháp chuyển gen

• Phương pháp chuyển gen sử dụng virus

• Phương pháp chuyển gen không sử dụng virus

- Phương pháp hóa học

Phương pháp vật lí

Trang 3

Trang 4

Trang 5

Trang 6

Trang 7

Trang 8

Trang 9

Trang 10

Chuy ển gen không sử dụng virus

Trang 11

• Phương pháp hóa học

- Sử dụng lần đầu tiên vào năm 1965

- Giúp cho DNA dễ dàng bám và di chuyển qua màng tế bào, màng nhân

- Hiệu quả thấp hơn so với các phương pháp chuyển gen sử

dụng virus

- Yêu cầu nghiêm ngặt về hóa chất sử dụng

- Không liên quan đến các vấn đề về an toàn sinh học

Trang 12

Trang 13

Trang 14

Trang 15

Trang 16

Trang 17

Trang 18

Trang 19

• Phương pháp vật lý

- Thường sử dụng khi các phương pháp chuyển gen bằng hóa học kém hiệu quả

- Không phụ thuộc vào loại tế bào

- Không có giới hạn về kích cỡ DNA chuyển

- Yêu cầu có các dụng cụ chuyên biệt (Súng bắn gen, Máy điện biến nạp, Hệ thống vi thao tác, …)

Trang 20

- Phương pháp điện biến nạp

Sử dụng dòng điện tạo một điện trường tác động lên màng tế bào trong thời gian cực ngắn (us – ms)

Xuất hiện các lỗ (pore) trên màng tế bào → vector dễ dàng di chuyển xuyên qua màng tế bào

Thông số điện biến nạp giữa các dòng tế bào rất khác nhau

Thường gây chết tế bào !!!

Trang 21

- Trộn tế bào với DNA trong cuvette điện biến nạp

- Thực hiện kích điện với các thông số thích hợp

- Nuôi cấy tiếp tục, sau 2 – 3 ngày kiểm tra sự biểu hiện của protein

Trang 22

- Phương pháp điện biến nạp

Trang 23

Thường áp dụng cho tế bào thực vật (Bắp, Lúa mạch, Đậu nành, …)

Trang 24

Trang 25

• Ứng dụng

- Bệnh ung thư và liệu pháp sử dụng virus oncolytic

o Chuyên biệt receptor

o Chuyên biệt sao chép

Không có sự xuất hiện của protein kháng virus

Sử dụng promoter thích hợp

Trang 26

• Ứng dụng

Trang 27

3.7 Các k ỹ thuật bảo quản tế bào

a/ Ky ̃ thuật Đông lạnh Tế bào

• Đông lạnh tế bào động vật là sử dụng môi trường đông lạnh, nhiệt độ thấp (-800C, -1960C) để lưu giữ các tế bào động vật phục

vụ cho nghiên cứu và ứng dụng

• Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đông lạnh gồm:

- Tốc độ đông lạnh

- Kỹ thuật đông lạnh

- Chất bảo quản lạnh

- Môi trường dinh dưỡng

- Nhiệt độ bảo quản

- Đặc trưng của tế bào đông lạnh…

Trang 28

• Quy trình bảo quản đông lạnh

Chuẩn bị

- Môi trường đông lạnh và các ống đông lạnh chuyên dụng

- Môi trường này thường là môi trường dinh dưỡng, bổ sung khoảng 20-90 % huyết thanh và khoảng 5-10 % chất bảo quảnlạnh ( DMSO, Glycerol…)

Trang 29

Ghi nhãn, dùng giấy nến, bao gói và các ống đông lạnh có

huyền phù vào tủ đông lạnh -800C trong một vài giờ, và chuyểnvào giữ trong bình chứa Nitơ lỏng

Trang 30

b/ Ky ̃ thuật Giải Đông Tế bào

Mục đích: Khôi phục lại trạng thái hoạt động, đặc điểm, tính

chất của tế bào trong nuôi cấy tế bào động vật

Kỹ thuật giải đông có ảnh hưởng đến chất lượng tế bào:

- Nếu quá trình giải đông chậm, các tế bào bị tổn thương hoặc

bị chết nhiều, ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy

- Nếu giải đông càng nhanh, đúng kỹ thuật, chất lượng tế bàocàng tốt

Trang 31

Quy trình giải đông tế bào động vật có vú trữ lạnh theo quy trình của Schrieber ’ s gồm có các bước chủ yếu sau:

Lấy ống tế bào đông lạnh từ trong

bình Ni tơ lỏng, đặt ngay vào bình

ổn nhiệt có lắc ở 37oC

Chuyển dịch huyền phù tế bào

trong ống đông lạnh sang ống ly

tâm 15ml vô trùng

Bổ sung huyết thanh bê bào thai

FBS

Trang 32

Ly tâm trong 5 phút với tốc độ

1000 vòng/phút

Bổ sung 5 - 6ml môi trường

dung dịch đã làm ấm

Chuyển sang bình nuôi, ủ ở

37 o C trong điều kiện nồng độ

CO2 5 %.

Sau 24h thì kiểm tra kết quả

nuôi cấy, bỏ môi trường cũ và

bổ sung 5 - 6ml môi trường mới

đã làm ấm và tiếp tục nuôi cấy

Trang 33

c/ Chu ẩn bị tế bào cho vận chuyển

Loại bỏ môi trường cũ trong

bình nuôi, cho môi trường mới

Trang 34

c/ Chu ẩn bị tế bào cho vận chuyển

V ận chuyển đông lạnh

Lấy các lọ có chứa tế bào

đông lạnh ra khỏi tủ nitơ lỏng

Đặt lên băng khô trong thùng

cách nhiệt

Trang 35

Gi ới thiệu 1 số môi trường nuôi cấy tế bào động vật

Định dạng
Số trang	35
Dung lượng	1,76 MB