Bài giảng Nuôi cấy tế bào trần slide

Phương pháp cơ bản để tách protoplast từ lá cây  Khử trùng mẫu lá  Ngâm mẫu trong dung dịch thẩm thấu để tế bào co nguyên sinh chất... Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triể

 Protoplast là gì?

 Đặc điểm của protoplast

 Mục đích nghiên cứu protoplast?

Phương pháp tách Protoplast

 Nguyên liệu:

 2 phương thức phân lập protoplast

- Cơ học (không dùng các enzyme)

- Sử dụng enzyme :

+tuần tự (qua hai bước)

+Sử dụng hỗn hợp enzyme (xử lý đồng thời)

* Kỹ thuật từng bước của Hanaka

Phương pháp cơ học

Phối hợp các enzym phân hủy màng tế bào đã được thực hiện trên một số cây trồng

Thành phần dịch enzyme (trên lít) gồm có:

- Các enzyme (pectinase, cellulase, hemicellulase) từ 0,1-2%

- Điều chỉnh pH 5,6 và khử trùng dung dịch enzyme

bằng màng lọc Millipore.

Tinh sạch protoplast

www.themegallery.com

Xác định chất lượng của protoplast

 Phát hiện thành tế bào: calcoflour

 Xác định khả năng sống sót của protoplast

+ quan sát trực tiếp

+ FDA( Fluorescein diacetate)

+ nhuộm xanh Evan

www.themegallery.com

Đếm protoplast bằng buồng đếm hồng cầu

www.themegallery.com

Nhuộm xanh evan

www.themegallery.com

Xác định mật độ protoplast và khả năng sống sót

 Fluorescein diacetate:

thấm vào bên trong lớp

plasmalemma của

protoplasts, có thể được phát hiện

dưới kính hiển vi với đèn huỳnh

quang hoặc /UV

Tế bào không thấm đối với Evans

blue chứng tỏ tế bào đang sống

 Sự chuyển động vòng hay sự sự

xắp xếp của nguyên sinh chất thể

hiện khả năng sống được của

protoplast

Phương pháp cơ bản để tách protoplast

từ lá cây

 Khử trùng mẫu lá

 Ngâm mẫu trong dung dịch thẩm thấu để tế

bào co nguyên sinh chất

Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và

phát triển protoplast

 Môi trường nuôi cấy

 Điều kiện nuôi cấy

 Mật độ nuôi cấy

www.themegallery.com

Môi trường nuôi cấy protoplast

- Thành phần dinh dưỡng

- MS hoặc B5 có cải tiến ( giảm Fe, Zn, NH 4 + ,

tăng Ca 2+ )

- Auxin + cytokinin cao

- Tăng áp suất thẩm thấu

Điều kiện nuôi cấy

 Hệ thống nuôi cấy:

- nuôi cấy trên môi trường lỏng

- nuôi cấy trên môi trường bán rắn

- Nuôi cấy trong giá thể cố định (alginate, đĩa

Nuôi cấy tái sinh cây bằng protoplast từ lá cây

Nuôi cấy tái sinh cây bằng protoplast từ lá cây

Các acid hữu cơ

(chỉnh pH tới 5,5 bằng NH 4 OH) Sodium pyruvate

Citric acid Malic acid Fumaric acid

Các vitamin

Inositol Nicotinamide Pyridoxine-HCl Thiamine-HCl D-Calcium pantothenate Folic acid

p-Aminobenzoic acid

5 10 10 10 100 1 1 10 0,5 0,2 0,01

Choline chloride Riboflavin

Ascorbic acid Vitamin A

0,5 0,1 1 0,005 0,005 0,01

10 ml/L

hoặc N glauca

0,2 0,5 1 - -

Áp lực thẩm thấu của môi trường

 Vì sao cần duy trì áp suất thẩm thấu ?

Kỹ thuật nuôi cấy protoplast

 Kỹ thuật tầng nuôi dưỡng

 Đồng nuôi cấy các protoplast

 Nuôi cấy vi giọt

Tái sinh cây từ protoplast

 Tạo vách tế bào

 Tăng trưởng và phân chia tế bào

 Phát triển callus/cây hoàn chỉnh

Sử dụng chất mang oxi để tăng khả năng sống sót của protoplast

 Perfluorocarbon liquids(PFCs)

 Hemoglobin (Hb)

www.themegallery.com

 Dung hợp Protoplast phải xuất hiện trước khi thành tế bào mới được hình thành

 Thành tế bào mới tái sinh sau vài giờ

 Xác định bằng kính hiển vi với tia UV sử

www.themegallery.com

 Có thể thực hiện với các loài khác nhau, các

họ khác nhau và các giới khác nhau!

 Citrus sinensis X Poncirus trifoliata

 HeLa X Nicotiana tabacum

 Esculentum species

 Nicotiana species

 Datura species

Xử lý bằng PEG

 C Dung hợp bằng điện

Dung hợp bằng điện

 - Huyền phù tế bao trần để dung hợp được đặtt giữa hai điệc cực Một dòng AC yếu

(400000 Hz, 1,5V) được cho qua điện cực

làm cho tế bào trần tích điện dương dồn về một phía và tích điện âm về một phía khác

thay thế bởi xung điện áp cao một chiều

khoảng 1000V/cm Khi những tế bào trần

tiếp xúc với nhau, vách sinh chất vỡ và dung hợp lai tạo thành vách liên tục quanh chuỗi ngọc Sau đó là sự dung hợp bào chất.

trước.

www.themegallery.com

Dung hợp protoplast bằng polyethylen glycol (PEG)

trường

- Màng ngoài được làm mất cân bằng bằng cách thêm 2 ml PEG (30% w/v PEG mol.wt 6000, 4% w/v sucrose, 0,01M CaCl2.H2O và được hấp khử trùng) và để trong 10 phút.

-Tế bào trần được dung hợp bằng cách pha loãng PEG mỗi 5 phút bằng cách thêm môi trường nuôi cấy tế bào trần

- Hỗn hợp được ly tâm ở 100 g trong 10 phút rồi tế bào trần được rửa trong môi trường nuôi cấy không PEG, ly tâm

- Huyền phù tế bào trần được sắp lớp trên môi trường agarose

Dung hợp giữa protoplast của huyền phù tế bào nuôi cấy với protoplast từ lá dưới tác dụng của PEG

Cơ sở tế bào học của dung hợp

 Dung hợp tế bào trần bao gồm 3 pha:

- Pha kết dính: Màng sinh chất của 2 hay nhiều

tế bào trần tiến sát nhau

- Pha dung hợp: Dung hợp màng tại những

vùng nhỏ liên kết chặt dẫn đến hình thành tế bào chất liên tục hoặc cầu giữa các tế bào

trần

- Pha giãn nở:Giãn nở của các cầu nguyên sinh chất và hình thành thể đồng nhân hoặc dị

nhân hình cầu

Lục lạp

Ty thể Nhân Dung hợp

Thể dị nhân

Chọn lọc các thể lai soma

 Dựa vào đặc điểm hình thái

 Môi trường chọn lọc

Phương pháp mẫn cảm dược phẩm

Các đột biến khuyết dưõng

Chọn lọc bổ sung di truyền

 Nhuộm mầu

FITC( fluorescein isothiocyanate)xanh

RITC(Rhodamine iso thiocyanate) đỏ

 Con lai: vàng

Sơ đồ chọn lọc các thể lai soma bằng cách ứng dụng sự mẫn cảm khác nhau của các protoplast thịt lá đối với actinomycin D

www.themegallery.com phương thức chọn lọc bổ sung di truyền chỉ có callus lai tái sinh cây

Phương thức dùng cho lai soma khác chi của Atropa

belladonna

Lai hai tế bào soma có khả năng tự dưỡng

auxin

www.themegallery.com

Tồn tại của kỹ thuật protoplast

 Hạn chế ở cây ngũ cốc và hòa thảo

 Chưa hoàn thiện các phương pháp

Khi protoplasts đã tái sinh thành tế

bào, chúng sẻ phân chia và tạo thành

mô sẹo Mô sẹo này tiếp tục được

nuôi cấy có thể phát sinh phôi và cơ

quan sau 3-4 tuần trong điều kiện

nuôi cấy tốt Các phôi hoặc cơ quan

này có thể phát triển như hầu hết các

phương pháp nuôi cấy khác

Protoplast tạo thành cây con trong điều kiện nuôi cấy thích

hợp

Nuôi cấy protoplast lúa

www.themegallery.com RMAN

Tạo cây cam lai bằng dung hợp protoplast

www.themegallery.com

Chuyển gen bằng protoplast

 Hấp thụ DNA vào nhân của protoplast phân

lập

 Chuyển cơ quan vào protoplast

 Chuyển gen để biểu hiện các protein tái tổ

hợp

www.themegallery.com

Chọn lọc biến dị soma bằng maker phân tử

 AFLP

 Simple sequence repeat (SSR)

 Cleaved amplifiedpoly morphicsequence

(CAPS)

 Restriction fragment length

polymorphism(RFLP)

www.themegallery.com

Cây lai mới được tạo thành từ dung hợp protoplast