Điều kiện kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật slide - Bài giảng quan trọng

Nguồn carbon C  Đường sucrose saccharoza là nguồn cacbon chủ yếu và được sử dụng thường xuyên trong hầu hết các môi trường nuôi cấy mô, kể cả khi mẫu nuôi cấy là các chồi xanh có khả n

Các nội dung chính

2.1 Bảo đảm điều kiện vô trùng

2.1.1 Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô

 2.2.1 Thành phần hoá học của các môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật

 2.2.1.1 Các chất khoáng

 2.2.1.2 Các nguyên tố đa lượng

 2.2.1.3 Các nguyên tố vi lượng (Fe, B, Cl, Co, Cu, Mn, Mo, Zn )

 2.2.1.4 Các vitamin

 2.2.1.5 Các chất bổ sung vào môi trường cấy mô

 2.2.1.6 Các chất điều hoà sinh trưởng

 2.2.1.7 Các chất kháng sinh

 2.2.2 Các chất khử trùng

 2.3 Độ pH môi trường

 2.4 Các tác nhân làm rắn môi trường

 2.5 Một số loại môi trường cơ bản

 2.6 Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô

 2.6.1 Các thiết bị , dụng cụ cần thiết của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô

Đảm bảo điều kiện vô trùng

2.1.1 Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô

và tế bào thực vật

- mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô

và tế bào thực vật đòi hỏi rất nghiêm ngặt

Đảm bảo điều kiện vô trùng

2.1.2 Khử trùng

2.1.2.1 Khử trùng phòng cấy và tủ cấy

Hơi formon

Đèn cực tím

Đảm bảo điều kiện vô trùng

-bông không thấm nước

-nhựa chịu nhiệt có thể hấp ở 120 0 C mà không bị biến dạng Môi trường

-môi trường khoáng được hấp tiệt trùng ở 1210C, 1 atm

-phin lọc micropore

Đảm bảo điều kiện vô trùng

 2.1.2.3 Khử trùng mẫu cấy thực vật

 Các mô thực vật thường được sử dụng để nuôi cấy là:

 Đỉnh sinh trưởng thân, rễ

Bảng 2.2 Nồng độ và thời gian sử dụng 1 số chất diệt khuẩn xử

 3 Nhúng ngập mẫu vào dung dịch khử trùng

trong điều kiện vô trùng Đậy nắp lọ rồi lắc nhẹ trong thời gian khử trùng

 4 Chắt dung dịch khử trùng đi rồi rửa vài lần

bằng nước cất vô trùng

Quy trình khử trùng thường được áp

dụng:

 1 Rửa mẫu dưới vòi nước chảy khoảng 30

phút

 2 Nhúng ngập mẫu trong cồn 70%

 3 Ngâm mẫu trong dung dịch CLOROX 10%

cộng với 2 - 3 giọt Tween 20 trong 15 phút

 4 Ngâm mẫu trong dung dịch CLOROX 5%

cộng với 2 - 3 giọt Tween 20 trong 10 phút

 5 Rửa lại mẫu 3 lần với nước cất vô trùng

Môi trường Nuôi cấy mô tbtv

 - Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

 - Các vitamin

 - Các amino axít

 - Nguồn các- bon: một số các loại đường

 - Các chất điều hoà sinh trưởng

 - Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch

chiết nấm men, dịch chiết khoai tây, bột chuối

khô

 - Chất làm thay đổi trạng thái môi truờng: các

loại thạch (agar)

Tại sao cẩn những chất này?

Các muối khoáng đa lượng và vi

 - Các ion của các muối hoà tan đóng vai trò quan trọng ổn định áp suất thẩm thấu của môi trường và tế bào, duy trì thế điện hoá của thực vật Ví dụ, K và C rất quan trọng trong điều hoà tính thấm lọc của tế bào, duy trì điện thế và tham gia hoạt hoá nhiều enzym

2.2.1.1.1 Các nguyên tố đa lượng

 NH4NO3 Ammonium nitrate

 KNO3 Potassium nitrate

 CaCl2 -2 H2O Calcium chloride (Anhydrous)

 MgSO4 -7 H2O Magnesium sulfide (Epsom Salts)

 KH2PO4 Potassium hypophosphate

 FeNaEDTA Fe/Na ethylene-diamine-tetra acetate

 MnSO4 - 4 H2O Manganese sulfate

 ZnSO4 - 7 H2O Zinc sulfate

 Na2MoO4 - 2 H2O Sodium molybdate

 CuSO4 - 5 H2O Cupric sulfate

 CoCl2 - H2O Cobaltous sulfide(C)

a Nguồn carbon (C)

 Đường sucrose (saccharoza) là nguồn cacbon chủ yếu

và được sử dụng thường xuyên trong hầu hết các môi trường nuôi cấy mô, kể cả khi mẫu nuôi cấy là các chồi xanh có khả năng quang hợp

 nồng độ thích hợp phổ biến là 2-3%, song cũng còn phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy mà thay đổi có khi giảm

xuống tới 0,2% (chọn dòng tế bào) và tăng lên đến 12%

 lactose, galactose, rafinose, maltose, cellobiose,

melibiose và trehalose, tinh bột, pectine, dextrine ??

b Nitơ (N):

 Nitơ vô cơ dưới dạng nitrat (NO3-) hoặc amonium

(NH4+) Các muối được dùng phổ biến là kali nitrat

(KNO3), nitrat amon (NH4NO3) và canxi nitrat

(Ca(NO3)2.4H2O) Những hợp chất này cung cấp nitơ

vô cơ cho thực vật để tổng hợp các phân tử chất hữu cơ phức tạp.

 Nitrogen – ảnh hưởng chỉ số phát triển của cây, đặc

biệt trong quá trình phát triển của nhân, protein, diệp lục, amino acid và các hocmon

 Tổng nồng độ của NO3+ và NH4+ trong môi trường

nuôi cấy thay đổi tùy theo đối tượng nuôi cấy và mục

đích nghiên cứu

c Phospho (P):

 Phosphorus – có nhiều trong đỉnh sinh trưởng, các mô

phát triển nhanh, quan trọng trong quá trình quang hợp,

hô hấp.

 Nó tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nuclêic và tham gia cấu trúc của màng.

 Trong môi trường nuôi cấy, Photpho được cung cấp

dưới dạng mono hay dihydrogenphosphate potasium hay sodium

 Nồng độ photphate hòa tan cao trong môi trường sẽ

làm giảm sự tăng trưởng của mô, Nồng độ ion

photphate cho vào môi trường cao nhất là 18,9 mM,

trung bình là 1,7 mM, hầu hết các môi trường chứa

photphate khoảng 1.3 mM.

d Lưu huỳnh (S):

 Sulfur – Tham gia trong chuyển hóa của ti

thể và hệ thống quang tông hợp, thành

phần của aminoacids và enzimes

Lưu huỳnh như SO42- được hấp thụ ở rễ cây với tốc độ chậm Giống như nitrat, lưu huỳnh phải

được khử trước khi sử dụng để sinh tổng hợp

các hợp chất có chứa lưu huỳnh như amino axít, protein và enzym Lưu huỳnh ở dạng chưa khử được kết hợp trong các sulpholipid và các

polysaccharid

e Kali (K):

 Potassium – cần thiết cho phân chia tế bào, mô phân

sinh, tham gia chu trình C, Protein và quang tổng hợp

 K+ là một cation chủ yếu trong cây, giúp cho cây cân

bằng các anion vô cơ và hữu cơ Ion K+ được chuyển qua màng tế bào dễ dàng và có vai trò chính là điều hòa

pH và áp suất thẩm thấu của môi trường nội bào Sự thiếu hụt K+ trong môi trường nuôi cấy mô thực vật sẽ dẫn đến tình trạng thiếu nước

 K+ được cung cấp dưới dạng muối KNO3, KCl 6H2O,

KH2PO4

f Canxi (Ca):

 Calcium – tham gia biệt hóa thành tế bào,

phát triển lá và rễ Đặc biệt trong chuyển hóa đường, amino acids

Trong nuôi cấy tế bào, Ca2+ có vai trò trong sự phát sinh hình thái đồng thời với sự cảm ứng của các chất điều hòa sinh trưởng đặc biệt là auxin và cytokinin

g Magiê (Mg):

 Magnesium – tham gia qt quang tự dưỡng

và hệ thống hô hấp, hoạt hóa photphate và vận chuyển photphate và tinh bột

Môi trường nuôi cấy mô thực vật thường chứa

Mg với nồng độ không thay đổi nhiều trung bình

là 6,8mM MgSO4 là nguồn bổ sung ion Mg+

duy nhất cho mô cấy

2.2.1.1.2 Các nguyên tố vi lượng (Fe,

B, Cl, Co, Cu, Mn, Mo, Zn )

Nhu cầu của thực vật đối với các nguyên tố đa lượng là lớn hơn, với nồng độ > 0.5 mM Các nguyên tố vi lượng được sử dụng trong môi

trường ở nồng độ < 0.5 mM

Các nguyên tố vô cơ cần một lượng nhỏ nhưng không thể thiếu cho sinh trưởng

a Sắt (Fe):

Trong cây, sắt chủ yếu được gắn với các phức chất Hàm lượng Fe2+, Fe3+ tự do rất thấp (10-

10 mM) Hầu hết thực vật chỉ hấp thu Fe2+ Do

đó, Fe3+ cần được khử thành Fe2+ ở bề mặt rễ trước khi nó được chuyển vào trong tế bào chất

 – tham gia trong qt hô hấp, tổng hợp chlorophin và

quang tự dưỡng Cây hấp thu tốt sắt ở dạng FeNaEDTA

b Bo (B):

Bo cần thiết cho sự hoạt động của đỉnh sinh

trưởng bởi vì nó có mặt trong sự sinh tổng

hợpcác base nitơ đặc biệt là uracil, cũng như

cần thiết cho sự sinh tổng hợp lignin và acid

phenolic

 Boron - tham gia qt hình thành hocmon tăng trưởng và lục lạp Hoạt hóa qt hô hấp và tổng hợp hydro cac bon

d Mangan (Mn):

Manganese là một trong những nguyên tố vi

lượng quan trọng nhất, gần như luôn có mặt

trong môi trường nuôi cấy Nồng độ của Mn

trong môi trường tương đương với Fe và B Mn

có tác động hóa học tương tự như Mg+ nên có thể thay thế cho Mg+ trong một số hệ thống

enzim

 Manganese – tạo mối quan hệ giữa các

enzymes và hocmon tăng tưởng, hỗ trợ

quang tổng hợp và hô hấp

f Molybden (Mo):

 Molybdenum – tham gia trong enzime phân hủy nitrate và

amonium Trợ giúp trong qt chuyển hợp chất photphat vô cơ sang phot phat hữu cơ

Thực vật hấp thu Mo dưới dạng MoO42-

Molydate thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với nồng độ đến 1 mm

g Kẽm (Zn):

kẽm là một thành phần trong enzim có liên quan đến sự tổng hợp tiền chất của IAA là trytophan Nồng độ của kẽm bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy thay đổi từ 0,1-70 mm, như vậy sự dư kẽm trong môi trường nuôi cấy ít gây độc cho mô

2.2.1.2 Các vitamin

Các vitamin được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (PP),

pyridoxine (B6) và myo-inositol

photphate là 1 phần của màng tế bào, bào quan

chu trình citric acid

2.2.1.3 Các chất bổ sung vào môi

trường cấy mô

 a Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác

hầu hết các nguồn N phổ biến trong mt nuôi cấy

là hỗn hợp amino acids, (vd., dịch thủy phân casein , L-glutamine, -asparagine, và adenine) Khi amino acids được thêm vào 1 mình, chúng có thể hạn chế tế bào

phát triển Tyrosine được sử dụng để kích thích phát

sinh hình thái nhưng chỉ nên dùng trong agar Bổ sung adenine sulfate có thể kích thích tế bào phát triển và ra chồi mạnh L-tyrosine – kích thích phát sinh chồi.

b Than hoạt tính

Sử dụng như tác nhân khử độc, khử nước độc

từ mô nuôi cấy Nồng độ hay dùng là 0,3% hoặc thấp hơn

Than sử dụng cho nuôi cấy mô

 Khử sạch acid và phải trung tính

 Không sử dụng lại

d Bột chuối

Bột chuối khô hoặc bột nghiền từ quả chuối xanh được sử dụng trong nuôi cấy mô một số cây trồng như phong lan Hàm lượng sử dụng vào khoảng 40g bột khô/l

f Agar

Agar thường được sử dụng ở nồng độ 0,6 đến 1%

2.2.1.4 Các chất điều hoà sinh

 Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào:

 - Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu

 - Hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy

 - Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy

 - Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh

 - Đặc tính của auxin: Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào

Thí nghiệm đầu tiên về vai trò của tín hiệu( ánh sáng) đến thực vật

 Auxin gia tăng plasticity của thành tế bào do đó làm tế bào dài ra.

 Arpad Paál (1919) – thí nghiệm về ảnh hưởng của auxin đến tính hướng động của cây

 Frits Went (1926) phát hiện khả năng kéo dài tb của auxin

Auxins

Cơ chế tác động của auxin

Kéo dài tế bào

Sự Vận chuyển điện tử của auxin

 Chức năng chủ yếu của các cytokinin được khái quát như sau:

 - Kích thích phân chia tế bào

 - Tạo và nhân callus

 - Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô

 - Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh

 - Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào

 - Có thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài

 - Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao)

 - Ức chế sự hình thành rễ

 - Ức chế sự kéo dài chồi

 - Ức chế quá trình già (hoá vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục

Cytokinins

 1964, hợp chất thiên nhiên thuộc nhóm cytokinin được tìm thấy trong nước dừa là zeatin

 Cytokinins di chuyển không có hướng

Chức năng của cytokinin

Tăng cường phân chia tế bào.

 Sự phân hóa cơ quan

 Phát triển chồi ngủ

Cytokinins, kết hợp với auxin:kích thích sự phân chia tế bào và sự biệt hóa

Hầu hết cytikinin tạo ra ở đầu rễ, và vận chuyển

đi khắp cơ thể thực vật

Cytokinins

Interaction of cytokinin and auxin in tobacco callus

(undifferentiated plant cells) tissue

 Phát sinh cơ quan: Cytokinins và auxin ảnh hưởng đến

phát sinh cơ quan

 Tỉ lệ cytokinin/auxin cao: phát sinh chồi

 Tỉ lệ cytokinin/auxin thấp: phát sinh rễ

H H \ /

/ \

H H

Sự phát hiện ethylene

 năm 1800, khí gas cháy làm các cây bên

cạnh phát triển chồi ngắn và là nguyên nhân gây rụng Iá

 1901, Dimitry Neljubow xác nhận rằng hợp chất gas đốt cháy đó là etylen, nó có ảnh

hưởng lên cây trồng

 Sự tổng hợp etylen bị ức chế bởi CO2 và cần O2

QUANG HƯỚNG ĐỘNG

Gibberellin

Gibberellin

 - Các mô phân sinh trẻ, đang sinh trưởng, các phôi non, tế bào đầu rễ, quả non,

hạt chưa chín hoặc đang nảy mầm đều có chứa nhiều gibberellic axit

 - Kích thích kéo dài chồi do tăng cường phân bào và kéo dài tế bào, ví dụ kéo dài

thân và đòng lúa sau khi phun GA3, kéo dài đốt thân Các cây lùn thường bị thiếu gibberellin

 - Phá ngủ hạt giống hoặc củ giống, ví dụ phá ngủ khoai tây sau thu hoạch

 - Kiểm soát sự ra hoa của các cây 2 năm tuổi Năm đầu thân mầm nằm in, sau

mùa đông mầm hoa kéo dài đốt rất nhanh và phân hoá hoa

 - Ức chế sự hình thành rễ bất định

 - Kích thích sinh tổng hợp của α-amylase ở hạt cây ngũ cốc nảy mầm, giúp tiêu

hoá các chất dự trữ trong nội nhũ để nuôi mầm cây

 - Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo củ (thân củ, thân hành và củ)

 - Kích thích sự nảy mầm của phấn hoa và sinh trưởng của ống phấn

 - Có thể gây tạo quả không hạt hoặc làm tăng kích thước quả nho không hạt

 - Có thể làm chậm sự hoá già ở lá và quả cây có múi

ảnh hưởng của gibberelin

• Kéo dài tế bào.

• GA tác động lên qt phân chia và kéo dài; auxin chỉ tác động lên quá trình kéo dài

• GA-kích thích kéo dài tế bào mà không tác động đến

thành tế bào

• Phá ngủ chồi bên và hạt giống

• Nảy mầm của hạt

• Kích thích sự nở hoa

• Vận chuyển không có hướng

Gibberellins ảnh hưởng kích thước

quả

Năm 1 năm1

Kích thích ra hoa

Năm 1

Năm 2

Kích thích nảy mầm

e Abscisic axít (ABA)

 - Tham gia vào sự rụng lá, hoa, quả ở hầu hết

các cây trồng và gây ra sự nứt quả

 - ABA thường được sản sinh khi có các yếu tố

ức chế cây trồng như mất nước và nhiệt độ

thấp đóng băng

 - Tham gia vào sự ngủ nghỉ, kéo dài thời gian

ngủ nghỉ và làm chậm sự nảy mầm của hạt

 - Ức chế sự kéo dài thân và được sử dụng để

kiểm soát sự kéo dài thân cành

 - Gây ra sự đóng khí khổng

Abscisic acid

Functions of abscisic acid

 Là 1 tác nhân kìm hãm sự phát triển

 Là nguyên nhân gây đóng khí khổng

 Được sản xuất khi cây bi stress

Abscisic Acid

Abscisic acid được sản xuất ở lá trưởng thành hoặc quả

f Ethylene

 - Gây già hoá lá, kích thích sự rụng lá và quả

 - Làm chín quả

 - Sinh tổng hợp ethylene được tăng cường khi quả

đang chín, cây đang bị úng, lão hoá, tổn thương cơ

giới và bị nhiễm bệnh

 - Điều khiển sự chín của một số loại quả

 - Ethylene kìm hãm sự ra hoa của đa số cây Tuy vậy,

sự ra hoa của xoài, dứa, một số cây cảnh lại được kích thích bởi ethylene

 - Kích thích nở hoa, kích thích sự lão hoá của hoa và lá

2.2.1.7 Các chất kháng sinh

 - Ngăn chặn sự lây nhiễm của các vi khuẩn vào môi

trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật

 - Ngăn chặn nấm mốc và nấm men lây nhiễm vào

mô, tế bào nuôi cấy

 - Loại trừ các chủng vi khuẩn Agrobacterium dùng

trong chuyển gen ra khỏi môi trường và mô nuôi cấy

(sau nuôi cấy, hỗn hợp Agrobacterium với tế bào thực

vật để chuyển gen hoàn thành)

 - Sử dụng kháng sinh trong môi trường chọn lọc để

chọn các tế bào hoặc mô đã được chuyển gen (mang gen chỉ thị kháng kháng sinh) Các tế bào không được chuyển gen sẽ bị chết trong môi trường có kháng sinh

ở nồng độ thích hợp

Phát sinh phôi

Bước 1: cảm ứng tạo phôi

Nồng độ auxin cao

Bước 2: Hình thành cơ quan hoặc chồi

- Không có hoặc rất thấp auxin

- Có thể thêm ABA 10mg/l, NH4 và K

Tạo chồi và phát triển rễ

Skoog và Miller kết luận rằng:

 Sự phát sinh chồi hoặc rễ có thể điều khiển bằng điều chỉnh tỉ lệ auxin và cytokinin

 cao auxin/thấp cytokinin = phát triển rễ

 Thấp auxin/cao cytokinen = phát triển chồi

 Áp dụng hầu hết cây có hoa hằng năm và dễ dàng để nhân giống cây trồng