Nghiên cứu nhân giống cây quýt bắc kạn bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHÍ HỮU VIỆT NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY QUÝT BẮC KẠN BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHÍ HỮU VIỆT NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY QUÝT BẮC KẠN BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS TS NGUYỄN THỊ TÂM THÁI NGUYÊN - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan trực tiếp làm nghiên cứu luận văn Mọi kết thu trung thực, không chỉnh sửa, không chép từ kết nghiên cứu khác Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn chưa cơng bố Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm với lời cam đoan trên! Tác giả luận văn Phí Hữu Việt i LỜI CẢM ƠN Trong trình thực luận văn, nhận quan tâm giúp đỡ tận tình nhiều cá nhân, quan đơn vị Nay luận văn hồn thành, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới: PGS TS Nguyễn Thị Tâm, người tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện, giúp đỡ nghiên cứu thực đề tài Các thầy giáo, cô giáo thuộc khoa Sinh học, phận Sau đại học Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên nhiệt tình giảng dạy tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa học Cán kỹ thuật viên phịng Cơng nghệ tế bào thực vật – Khoa Sinh họcTrường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện cho tiến hành luận văn Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn người thân gia đình, bạn bè đồng nghiệp tạo điều kiện, giúp đỡ động viên suốt thời gian học tập Thái Nguyên, tháng năm 2017 Tác giả luận văn Phí Hữu Việt ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Đặc điểm phân loại, sinh học thành phần dinh dưỡng quýt 1.1.1 Đặc điểm phân loại đặc điểm sinh học .3 1.1.2 Thành phần dinh dưỡng quýt .4 1.2 Tình hình sản xuất quýt giới Việt Nam 1.2.1 Tình hình sản xuất quýt giới .5 1.2.2 Tình hình sản xuất quýt Việt Nam 1.3 Kỹ thuật nhân giống in vitro công nghệ tế bào thực vật .6 1.3.1 Ưu phương thức nhân giống in vitro 1.3.2 Quy trình nhân giống in vitro 1.4 Chất điều hịa sinh trưởng thuộc nhóm auxin cytokinin sử dụng nuôi cấy mô thực vật 11 1.4.1 Auxin .12 1.4.2 Cytokinin .13 1.5 Một số yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống trồng ống nghiệm 14 1.6 Một số thành tựu nhân giống ăn có múi kỹ thuật ni cấy in vitro 15 iii Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu, hoá chất, thiết bị địa điểm nghiên cứu 19 2.1.1 Vật liệu thực vật 19 2.1.2 Hoá chất, thiết bị 19 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Nhóm phương pháp nuôi cấy in vitro 20 2.2.2 Phương pháp đưa vườn ươm 22 2.2.3 Phương pháp xử lí số liệu 23 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến nảy mầm hạt quýt Bắc Kạn .24 3.2 Ảnh hưởng riêng rẽ BAP kinetin đến phát sinh chồi quýt Bắc Kạn .27 3.2.1 Ảnh hưởng BAP đến phát sinh chồi quýt Bắc Kạn 27 3.2.2 Ảnh hưởng kinetin tới phát sinh chồi quýt Bắc Kạn 30 3.3 Ảnh hưởng tổ hợp BAP kinetin với IBA đến phát sinh chồi quýt Bắc Kạn 33 3.3.1 Ảnh hưởng tổ hợp BAP IBA đến phát sinh chồi quýt Bắc Kạn 33 3.3.2 Ảnh hưởng tổ hợp kinetin IBA đến phát sinh chồi quýt Bắc Kạn 35 3.4 Ảnh hưởng α-NAA đến hình thành rễ quýt Bắc Kạn 38 3.5 Ảnh hưởng giá thể đến việc đưa in vitro giống quýt Bắc Kạn tự nhiên 40 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43 Kết luận 43 Đề nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC .47 iv DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4 - dichlorophenoxy acetic acid BAP : Benzylamino purine cs : Cộng CT : Công thức DNA : Deoxyribo nucleic acid ĐC : Đối chứng IAA : indol acetic acid IAA : indole acetic acid IBA : Indol butyric acid Kinetin : 6-furfurylamino purine MS : Murashige and Skoog (1962) α-NAA : α- naphthalene acetic acid iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần môi trường MS 19 Bảng 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến nảy mầm hạt quýt Bắc Kạn (sau tuần nuôi cấy) 25 Bảng 3.2 Ảnh hưởng BAP đến phát sinh chồi quýt Bắc Kạn 28 Bảng 3.3 Ảnh hưởng kinetin đến phát sinh chồi quýt Bắc Kạn 31 Bảng 3.4 Ảnh hưởng tổ hợp BAP IBA đến phát sinh chồi quýt Bắc Kạn 34 Bảng 3.5 Ảnh hưởng tổ hợp kinetin IBA đến phát sinh chồi quýt Bắc Kạn 36 Bảng 3.6 Ảnh hưởng α-NAA đến phát sinh rễ quýt Bắc Kạn 39 Bảng 3.7 Ảnh hưởng giá thể đến việc đưa in vitro giống quýt Bắc Kạn tự nhiên (sau tuần) 41 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1: Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến nảy mầm hạt quýt Bắc Kạn (sau tuần) 26 Hình 3.2 Ảnh hưởng BAP đến phát sinh chồi quýt Bắc Kạn 30 Hình 3.3 Ảnh kinetin đến phát sinh chồi quýt Bắc Kạn (sau tuần) 32 Hình 3.4 Ảnh hưởng tổ hợp BAP IBA đến phát sinh chồi quýt Bắc Kạn (sau tuần nuôi cấy) Hình 3.5 Ảnh hường tổ hợp kinetin IBA đến phát sinh chồi quýt Bắc Kạn (sau tuần ni cấy) Hình 3.6 37 Ảnh hưởng NAA đến hình thành phát triển rễ qt Bắc Kạn (sau tuần ni cấy) Hình 3.7 35 40 Ảnh hưởng giá thể đến việc đưa in vitro giống quýt Bắc Kạn tự nhiên (sau tuần) vi 42 Như vậy, môi trường tối ưu cho hình thành phát triển rễ quýt Bắc Kạn môi trường MS bổ sung agar 9g/l + sucrose 30g/l + nước dừa 50ml/l + α-NAA 0,5mg/l, với tỉ lệ chồi hình thành rễ 90%, số rễ/chồi 2,89 rễ, chiều dài trung bình rễ 2,10cm Đối chứng α-NAA 0,5mg/l Hình 3.6 Ảnh hưởng NAA đến hình thành phát triển rễ quýt Bắc Kạn (sau tuần nuôi cấy) 3.5 Ảnh hưởng giá thể đến việc đưa in vitro giống quýt Bắc Kạn tự nhiên Đưa môi trường tự nhiên khâu cuối quy trình nhân giống in vitro có vai trị quan trọng định đến thành công quy trình ni cấy Giá thể phù hợp phải cho tỉ lệ sống cao, sinh trưởng phát triển tốt Đất phù sa hình thành chủ yếu phù sa bồi tụ sông tạo nên vùng đồng rộng Đất phù sa trẻ, ngồi đê (đất phù sa bồi đắp) có màu nâu, độ phì nhiêu cao, tơi xốp, nhiều mùn, nhiều khoáng sét, giàu ion trao đổi, giữ nước tốt Đất phù sa cổ đất phù sa đê, bị đào xới nhiều hoạt động trồng trọt màu nhạt, độ phì nhiêu giảm [300] Qua tìm hiểu giá thể ươm tham khảo cơng trình nghiên cứu giá thể đưa quýt môi trường tự nhiên tác Phan Hữu 40 Tơn (2014) [14], chăm sóc in vitro bầu Lê Văn Hồng (2007) [4] tìm hiểu đặc điểm đất phù sa, tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến sinh trưởng, phát triển cấy quýt Bắc Kạn qua loại giá thể: đất phù sa, trấu hun, đất phù sa + trấu hun (tỉ lệ 1:1) Đất phù sa dùng làm giá thể loại đất phù sa trẻ, lấy bãi ven sơng Cây thí nghiệm chăm sóc Kết thu bảng 3.7 Bảng 3.7 Ảnh hưởng giá thể đến việc đưa in vitro giống quýt Bắc Kạn ngồi tự nhiên (sau tuần) Giá thể thí nghiệm Đất phù sa Trấu hun Đất phù sa+ trấu hun (tỉ lệ 1:1) Ghi chú: (+): Lá chuyển màu xanh nhạt, có nhiều bị rụng, khơng phát triển thêm mới; (++): Lá màu xanh đậm, chưa xuất mới; (+++): Lá màu xanh đậm, phát sinh thêm Qua bảng 3.7 cho thấy, loại giá thể khác tỉ lệ sống, chiều cao khác Chứng tỏ giá thể ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển quýt Bắc Kạn Giá thể tốt in vitro ngồi mơi trường tự nhiên đất phù sa + trấu hun (tỉ lệ 1:1), tỉ lệ sống sau tuần 83,33 %, đó, giá thể đất phù sa tỉ lệ sống 46,67% trấu hun tỉ lệ sống 56,67% Những trồng giá thể đất phù sa cịn sống khơng hình thành mới, cũ rụng nhiều, không màu xanh đậm lúc Cây trồng giá thể trấu hun, không rụng, không chuyển màu, nhiên không phát sinh Cây trồng giá thể đất phù sa + trấu hun (tỉ lệ 1:1) tỉ lệ sống cao (83,33%), bắt đầu hình thành mới, cũ phát triển, phiến rộng màu xanh đậm Cây chuyển từ môi trường nuôi cấy nhân tạo, khả hấp thụ nước chất dinh dưỡng 41 chưa tốt, giá thể đất phù sa + trấu hun có đủ độ tơi xốp, thống khí, nhiều chất khống, khả giữ nước tốt, thuận lợi cho rễ hấp thụ nước, tỉ lệ sống cao, sinh trưởng tốt Trấu hun Hình 3.7 Ảnh hưởng giá thể đến việc đưa in vitro giống quýt Bắc Kạn tự nhiên (sau tuần) 42 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Thời gian khử trùng dung dịch Javen 60% tốt lắc 20 phút Với lượng thời gian tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ nảy mầm cao, mầm to khỏe 1.2 Nồng độ BAP tốt cho tái sinh chồi trực tiếp từ gốc mang nách mầm quýt Bắc Kạn 3,0mg/l môi trường MS bổ sung agar 9g/l + sucrose 30g/l + nước dừa 50ml/l 1.3 Nồng độ phối hợp BAP IBA tốt cho tái sinh chồi từ gốc mang nách mầm quýt Bắc Kạn BAP 3,0mg/l + IBA 1,5mg/l mơi trường MS có bổ sung agar 9g/l + sucrose 30g/l + nước dừa 50ml/l, tỉ lệ phát sinh chồi 93,33% số chồi trung bình/mẫu 4,68 Các chồi to, khỏe, to phát triển cân đối 1.4 Môi trường tối ưu cho hình thành rễ quýt Bắc Kạn MS có bổ sung agar 9g/l + sucrose 30g/l + nước dừa 50ml/l + α-NAA 0,5mg/l Các rễ hình thành dài mập, khỏe có nhiều lơng hút 1.5 Giá thể tốt cho việc chuyển in vitro đất phù sa + trấu hun tỉ lệ 1:1, với tỉ lệ sống 83,33%, sinh trưởng tốt, phát sinh cành mới, to, xanh Đề nghị 2.1 Tiếp tục nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng chất phụ gia khác đến phát sinh chồi, sinh trưởng phát triển chồi nuôi cấy in vitro quýt Bắc Kạn 2.2 Ứng dụng quy trình nhân giống chuyển gen vào giống quýt Bắc Kạn, nhằm nâng cao chất lượng quýt Bắc Kạn 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ tế bào thực vật cải tiến giống trồng, NXB Nông nghiệp Hà nội Nguyễn Minh Chơn (2004), Giáo trình chất điều hịa sinh trưởng thực vật, khoa Nông nghiệp - Đại học Cần Thơ Nguyễn Hữu Đống (2003), Cây ăn có múi (cam chanh, quýt, bưởi), NXB Nghệ An Lê Văn Hồng (2007), Cơng nghệ ni cấy mơ tế bào thực vật, NXB Khoa học Kỹ thuật Lê Văn Trường Huân, Hoàng Ý Nhi (2007) , “Nghiên cứu tạo chồi in vitro chanh dây (Passiflora edulis Sims.)”, Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, NXB khoa học kĩ thuật (2007), tr 308-310 Nguyễn Như Khanh, Nguyễn Văn Đính (2011), Giáo trình chất điều hịa sinh trưởng thực vật, NXB Giáo dục Việt Nam Nguyễn Bá Lộc (1997), Giáo trình sinh lý học thực vật, NXB Giáo dục Mai Xn Lương (2005), Giáo trình Cơng nghệ Sinh học thực vật, NXB Đại học Đà Lạt Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền đại chọn giống trồng, NXB Đại học Thái Nguyên 10 Dương Tuấn Nhựt (2011), Công nghệ tế bào thực vật, NXB Nơng nghiệp 11 Hồng Thị Sản (1977), Phân loại thực vật, NXB Giáo Dục 12 Nguyễn Đức Thành (2002), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - nghiên cứu ứng dụng, NXB Nông nghiệp 13 Phan Hữu Tôn cs (2014), “Nuôi cấy in vitro trụ mầm giống cam (Citrus sinensis), quýt (Citrus reticulata)”, Tạp chí Khoa học Phát triển, tập 12, số 5; tr 641-649 44 14 Đỗ Năng Vịnh (2005), Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng , NXB Nông nghiệp Hà Nội 15 Đỗ Năng Vịnh, Ngơ Xn Bình (2008), Giáo trình cơng nghệ sinh học đại cương, NXB Nông nghiệp Hà Nội 16 Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2010), Công nghệ sinh học Tập II, NXB Giáo Dục Việt Nam 17 Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hồng Minh Tâm (1999), Sinh lí học thực vật NXB Giáo Dục II Tài liệu tiếng Anh 18 Adhikarimayum H., Kshetrimayum G., Huidrom S., Maibam D (2011), “In vitro propagation of Citrus megaloxycarpa”, Environmental and Experimental Biology, (9), pp.129-132 19 Saini H.K., Gill M.S and Gill M.I.S., (2010), “ Direct shoot organogenesis and plant regeneration in rough lemon (Citrus jambhiri Lush.)”, Indian Journal of Biotechnology, 9, pp 419-423 20 Sarker I cs (2015), “Establishment of a standard protocol for in vitro meristem culture and plant regeneration of Citrus aurantifollia”, Journal of Pharmacy and Biological Sciences, 10(2), pp 61-69 21 Ibrahim M A (2012), “In vitro plant regeneration of local pummelo (Citrusn Grandis (L.) Osbeck.) via direct and indirect organogenesis”, Genetics and Plant Physiology, (3-4), pp 187-191 22 Mohammad H R., cs (2013), “In vitro regeneration of sour orange (Citrus aurantium L.) via direct organogenesis”, Plant Knowledge Journal, Southern Cross Publishing Group, 2(4), pp 150 - 156 23 S Hawkat A., Ushra M.B., (2006), “Micropropagation of rough lemon (Citrus jambhiri Lush.): Effect of explant type and hormone concentration”, ActaBot.Croat, 65(2), pp 137-146 45 24 Savita cs (2010), “Effect of Explant Type and Different Plant Growth Regulators on Callus Induction and Plantlet Regeneration in Citrus jambhiri Lush”, Environ We Int J Sci Tech, 5, pp 97-106 25 Suneel S., Atam P., Ajinath T., (2009), “In vitro Propagation of Citrus Rootstocks”, Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca, Not Bot Hort Agrobot Cluj, 37 (1), pp 84-88 III Tài liệu mạng 26 http://www.caythuocquy.info.vn/old/modules.php?name=News&opcase= detailsnews&mid=975&mcid=245&pid=&menuid=) 27 http://botanyvn.com/cnt.asp?param=news&newsid=773( trung tâm liệu thực vật Việt Nam) 28 http://www.baobackan.org.vn/channel/1121/201512/quyt-bac-kan-trenduong-hoi-nhap-2419819/ 29 http://www.faostat.fao.org 30 http://www.tailieu.tv/tai-lieu/tinh-hinh-khoang-set-trong-nhom-dat-phusa-11208/ 31 Ngọc Lan (2015), Quýt Bắc Kạn - sản phẩm nông nghiệp “sạch” (https://www.backan.gov.vn/Pages/tin-tuc-su-kien-215/tin-trong-tinh289/xuc-tien-dau-tu-187/quyt-bac-kan-san-pham-nong-nghiep1888788d48aad96f.aspx) 46 PHỤ LỤC Kêt xử lí số liệu thực nghiệm Ảnh hưởng BAP đến phát sinh chồi (số chồi/mẫu) quýt Bắc Kạn (sau tuần) Anova: Single Factor SUMMARY Groups ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Ảnh hưởng kinetin đến phát sinh chồi (số chồi/mẫu) quýt Bắc Kạn (sau tuần) Anova: Single Factor SUMMARY Groups ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Ảnh hưởng tổ hợp BAP IBA đến phát sinh chồi (số chồi/mẫu) quýt Bắc Kạn (sau tuần) Anova: Single Factor SUMMARY Groups Đc CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Ảnh hưởng tổ hợp kinetin IBA đến phát sinh chồi (số chồi/mẫu) quýt Bắc Kạn (sau tuần) Anova: Single Factor SUMMARY Groups Đc CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Ảnh hưởng NAA đến phát sinh rễ (số rễ/chồi) quýt Bắc Kạn (sau tuần) Anova: Single Factor SUMMARY Groups ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Ảnh hưởng NAA đến chiều dài rễ (cm) (sau tuần) Anova: Single Factor SUMMARY Groups CT1 CT2 CT3 CT4 ANOVA Source Variation Between Groups Within Groups Total of Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến tỉ lệ nảy mầm hạt quýt Bắc Kạn 7.1 Hạt bóc vỏ (tỉ lệ hạt khơng nhiễm nảy mầm) Anova: Single Factor SUMMARY Groups CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 ANOVA Source Variation Between Groups Within Groups Total 7.2 Hạt bóc vỏ cắt 1/3 mầm (tỉ lệ hạt không nhiễm nảy mầm) Anova: Single Factor SUMMARY Groups CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 ANOVA Source Variation Between Groups Within Groups Total 7.3 Hạt khơng bóc vỏ (tỉ lệ hạt không nhiễm nảy mầm) Anova: Single Factor SUMMARY Groups CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 ANOVA Source Variation Between Groups Within Groups ...ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHÍ HỮU VIỆT NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY QUÝT BẮC KẠN BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN... nhân giống in vitro tạo giống bệnh nuôi cấy điều kiện vơ trùng, từ đáp ứng u cầu sản suất rau ngày Từ lí trên, chúng tơi chọn đề tài "Nghiên cứu nhân giống quýt Bắc Kạn kỹ thuật nuôi cấy mô tế. .. tế bào thực vật" Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu môi trường nhân giống quýt Bắc Kạn phù hợp ống nghiệm Xác định giá thể phù hợp cho việc chuyển từ môi trường nuôi cấy vườn ươm Nội dung nghiên cứu