ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN ĐỨC QUANG Tên đề tài NGHIÊN CỬU NHÂN GIỐNG CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ (Polygonum multiflorum Thunb) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC[.]
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN ĐỨC QUANG Tên đề tài NGHIÊN CỬU NHÂN GIỐNG CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ (Polygonum multiflorum Thunb) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NI CẤY MƠ TẾ BÀO THỰC VẬT KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa : 2012 – 2016 Thái Nguyên, 2016 n ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN ĐỨC QUANG Tên đề tài NGHIÊN CỬU NHÂN GIỐNG CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ (Polygonum multiflorum Thunb) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NI CẤY MƠ TẾ BÀO THỰC VẬT KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa : 2012 – 2016 Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS Ngơ Xn Bình Th.S Nguyễn Thị Tình Thái Ngun, 2016 n i LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực tập viện Nghiên cứu Phát triển Lâm Nghiệp phía bắc, trường Đại học Nơng Lâm Thái Ngun, nhận nhiều giúp đỡ từ ban lãnh đạo, thầy cô hướng dẫn, bạn bè, gia đình Trước hết tơi xin chân thành cảm ơn thầy PGS.TS Ngơ Xn Bình Th.S Nguyễn Thị Tình tận tình bảo suốt thời gian thực tập Tôi xin chân thành cảm ơn chị Phạm Thị Thảo, cán kỹ thuật phịng thí nghiệm bạn thực tập tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn đến thầy cô khoa CNSH & CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Ngun nhiệt tình giúp đỡ st q trình học tập hồn thành khố luận Và cuối chân thành cảm ơn đến quan tâm sâu sắc từ gia đình, bạn bè, ln bên cạnh động viên, giúp đỡ tơi q trình thực khoá luận Thái Nguyên, ngày 27 tháng năm 2016 Sinh viên thực Nguyễn Đức Quang n ii DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT BAP : 6-Benzylaminopurine Cs : Cộng CT : Công thức CT NCKH : Cơng trình Nghiên cứu khoa học Đc : Đối chứng IBA : Indole-3-butyric acid Kinetin : 6-Furfurylaminopurine LSD : Least Significant Difference MS : Murashige and Skoog’s MT : Môi trường NAA : α-Naphlene axetic acid TB : Trung Bình TCDL : Tổ chức dược liệu TN : Thí nghiệm n iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Tỷ lệ emodin physcion Bảng 2.2 Một số công trình NCKH Hà thủ đỏ 18 Bảng 4.1 Kết ảnh hưởng thời gian khử trùng dung dịch HgCl2 0,1% đến khả tiêu diệt nấm vi khuẩn (sau ngày cấy) 29 Bảng 4.2 Kết ảnh hưởng số môi trường đến khả tạo chồi Hà thủ ô đỏ (sau 20 ngày nuôi cấy) 31 Bảng 4.3 Kết ảnh hưởng tổ hợp BA + NAA đến khả nhân nhanh chồi Hà thủ ô đỏ (sau 30 ngày nuôi cấy) .32 Bảng 4.4 Kết ảnh hưởng tổ hợp BA + NAA + Kin đến khả nhân nhanh chồi Hà thủ ô đỏ (sau 30 ngày nuôi cấy) 34 Bảng 4.5 Kết ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ Hà thủ ô đỏ (sau 25 ngày nuôi cấy) 36 Bảng 4.6 Kết ảnh hưởng nồng độ IBA đến khả rễ Hà thủ ô đỏ (sau 25 ngày nuôi cấy) .37 n iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Cây Hà thủ đỏ Hình 2.2 Hình ảnh số sản phẩm từ Hà thủ ô đỏ 20 Hình 4.1 Biểu đồ thể ảnh hưởng thời gian khử trùng dung dịch HgCl2 0,1% đến khả tiêu diệt nấm vi khuẩn .30 Hình 4.2 Biểu đồ thể ảnh hưởng số môi trường đến khả tạo chồi Hà thủ ô đỏ .31 Hình 4.3 Biểu đồ thể ảnh hưởng nồng độ BA + NAA đến khả nhân nhanh chồi Hà thủ ô đỏ 33 Hình 4.4 Biểu đồ thể ảnh hưởng tổ hợp BA + NAA + Kin đến khả nhân nhanh chồi Hà thủ ô đỏ 34 Hình 4.5 Biểu đồ thể ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ Hà thủ ô đỏ 36 Hình 4.6 Biểu đồ thể ảnh hưởng IBA đến khả rễ Hà thủ ô đỏ 38 n v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ii DANH MỤC CÁC BẢNG iii DANH MỤC CÁC HÌNH iv MỤC LỤC v PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu nghiên cứu 1.2.1 Mục đích nghiên cứu 1.2.2 Yêu cầu nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài .2 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn .2 PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung Hà thủ ô đỏ 2.1.1 Nguồn gốc phân bố .3 2.1.2 Đặc điểm hình thái 2.1.3 Tác dụng dược lý 2.2 Khái quát nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.1 Tính tồn (Totipotence) tế bào 2.2.2 Sự phân hóa phản phân hóa tế bào 2.2.3 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.3.1 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.3.2 Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.3 Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào 13 2.3.1 Giai đoạn chuẩn bị 13 2.3.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy 13 n vi 2.3.3 Giai đoạn nhân nhanh chồi 14 2.3.4 Tạo hoàn chỉnh 14 2.3.5 Thích ứng in vitro điều kiện tự nhiên 15 2.4 Những vấn đề nuôi cấy mô .15 2.4.1 Sự tạp nhiễm 15 2.4.2 Tính bất định mặt di truyền 16 2.4.3 Việc sản xuất chất gây độc từ mẫu cấy 17 2.4.4 Hiện tượng thuỷ tinh thể 17 2.5 Tình hình nghiên cứu, sản xuất Hà thủ ô đỏ Việt Nam giới .18 2.5.1 Tình hình nghiên cứu, sản xuất Hà thủ ô đỏ Việt Nam 18 2.5.2 Tình hình nghiên cứu, sản xuất Hà thủ ô đỏ giới 20 PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Vật liệu phạm vi nghiên cứu 22 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 22 3.3 Hóa chất thiết bị sử dụng .22 3.3.1 Hóa chất 22 3.3.2 Thiết bị sử dụng 22 3.4 Điều kiện nghiên cứu 23 3.5 Nội dung nghiên cứu 23 3.6 Phương pháp nghiên cứu 23 3.6.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro 23 3.6.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 23 PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Kết ảnh hưởng thời gian khử trùng dung dịch HgCl2 0,1% đến khả tiêu diệt nấm vi khuẩn .29 4.2 Kết ảnh hưởng số môi trường đến khả tạo chồi Hà thủ ô đỏ 31 4.3 Kết ảnh hưởng BA, Kin, NAA đến khả nhân nhanh chồi Hà thủ ô 32 n vii 4.3.1 Kết ảnh hưởng tổ hợp BA + NAA đến khả nhân nhanh chồi Hà thủ ô đỏ .32 4.3.2 Kết ảnh hưởng tổ hợp BA + NAA + Kin đến khả nhân nhanh chồi Hà thủ ô đỏ 34 4.4 Kết ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng đến khả rễ Hà thủ ô đỏ 35 4.4.1 Kết ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ Hà thủ ô đỏ 36 4.4.2 Kết ảnh hưởng nồng độ IBA đến khả rễ Hà thủ ô đỏ 37 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39 5.1 Kết luận 39 5.2 Đề nghị .39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC .43 PHỤ LUC 46 n PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Thảo dược nguồn nguyên liệu thực vật quý giá, cung cấp dược liệu để sản xuất chế biến loại thuốc hữu ích phục vụ cho việc chữa bệnh phục hồi sức khỏe cho người Hà thủ đỏ tìm thấy Trung Quốc vào năm 713 sử dụng loại thảo dược trường sinh người Trên giới Hà thủ đỏ có nhiều Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan Ấn Độ Ở Việt Nam Hà thủ ô đỏ mọc hoang từ tỉnh miền núi từ Nghệ An trở ra, có nhiều Lai Châu, Sơn La, Lào Cai, Hà Giang, số tỉnh khác Cao Bằng, Lạng Sơn, Hồ Bình có số lượng [6] Hà thủ ô đỏ chủ yếu biết đến vị thuốc bổ, trị suy nhược thần kinh, ích huyết, khoẻ gân cốt, đen râu tóc Theo y học cổ truyền, Hà thủ có vị đắng chát, ngọt, tính ấm, có tác dụng bổ gan thận, ích tinh huyết, mạnh gân xương, nhuận tràng Được dùng để bổ máu, chữa thận suy, gan yếu, thần kinh suy nhược, thiểu tuần hoàn, ngủ kém, đau lưng mỏi gối, khơ khát táo bón Trong củ Hà thủ ô đỏ có chứa nhiều chất quan trọng emodin, chrysophanol, rhein, physcion, tinh bột, lipit…Trong tự nhiên Hà thủ ô đỏ gây trồng hạt hay dây, sau 3-4 năm thu hoạch, lấy củ rửa sạch, bổ thành miếng phơi khô để làm thuốc Lá dùng làm rau, dây dùng làm thuốc [2] Theo Chang Lin (2003) Hà thủ đỏ ni trồng nhà kính cho tỉ lệ chất emodin physcion cao tự nhiên [15] Trước nguồn Hà thủ ô đỏ nước ta dồi gần khai thác mức nạn phá rừng nên lượng Hà thủ ô đỏ bị giảm sút nghiêm trọng, không cung cấp đủ nguồn dược liệu cho việc chế biến sản xuất thuốc chữa bệnh cho người dân Do đó, việc nhân nhanh số lượng Hà thủ ô đỏ phương pháp nuôi mô tế bào thực vật để đáp ứng cung cấp nguồn dược liệu cần thiết Xuất phát từ thực tế trên, để góp phần vào cơng tác nhân giống việc nhân nhanh Hà thủ ô đỏ nhằm nâng cao suất, chất lượng, hiệu sản xuất, tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Nghiên cứu nhân giống Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunb) phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ” n