Luận văn thạc sĩ nghiên cứu nhân giống cây sói rừng (sarcandra glabra (thunb ) nakai) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM DƯƠNG THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY SÓI RỪNG (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên – 2020 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM DƯƠNG THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY SÓI RỪNG (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO Ngành : Công nghệ sinh học Mã số ngành: 8.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRẦN THỊ THU HÀ TS NGUYỄN XUÂN VŨ Thái Nguyên - 2020 i LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu nhân giống Sói rừng (Sarcandra glabra (thunb.) Nakai) kỹ thuật nuôi cấy in vitro” trung thực, thực Viện Nghiên cứu Phát triển Lâm nghiệp Đại học Nông lâm - Đại học Thái Nguyên Ngồi ra, báo cáo có sử dụng số nguồn tài liệu tham khảo trích dẫn rõ ràng phép cơng bố Em xin hồn tồn chịu trách nhiệm tính trung thực nội dung đề tài Học viên ii LỜI CẢM ƠN Trong q trình học tập hồn thành luận văn tốt nghiệp, em nhận giúp đỡ nhiều mặt cấp lãnh đạo, tập thể cá nhân Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến giáo viên hướng dẫn PGS.TS Trần Thị Thu Hà TS Nguyễn Xn Vũ ln tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt q trình thực hồn thành luận văn Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến Viện Nghiên cứu Phát triển Lâm nghiệp cán bộ, quý đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu Cuối em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè động viên, giúp đỡ em suốt trình học tập thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, tháng 11 năm 2020 Học Viên iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Chương 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Chi Sói rừng lồi Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) 1.1.1.Phân loại, phân bố 1.1.2 Đặc điểm thực vật học 1.1.3 Giá trị Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) 1.2 Cơ sở việc định danh loài xác định quan hệ di truyển 1.3 Tình hình nghiên cứu nhân giống Sói rừng 1.3.1 Tình hình nghiên cứu nhân giống Sói rừng giới 1.3.2 Tình hình nghiên cứu nhân giống Sói rừng nước ta 1.4 Cơ sở phương pháp nhân giống in vitro (vi nhân giống) 1.4.1 Ưu điểm phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 10 1.4.2 Nhược điểm phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 10 1.4.3 Các phương pháp nuôi cấy mô 10 1.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô thực vật 11 1.4.5 Các giai đoạn nhân giống invitro 15 Chương 2.ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .18 2.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 18 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 iv 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Điều tra đánh giá thực trạng phân bố thu thập mẫu nghiên cứu .18 2.3.2 Phương pháp nhận dạng mẫu nguồn gen Sói rừng đặc điểm hình thái 21 2.3.3 Phương pháp nhận dạng mẫu nguồn gen Sói rừng thị DNA 22 2.3.4 Phương pháp nhân giống in vitro Sói rừng 25 2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 28 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29 3.1 Điều tra, đánh giá thực trạng phân bố, giá trị sử dụng của lồi Sói rừng thu thập mẫu 29 3.2 Kết nhận dạng mẫu nguồn gen Sói rừng đặc điểm hình thái 34 3.2.1 Đặc điểm mẫu Sói rừng thu thập huyện Xín Mần .34 3.2.2 Đặc điểm mẫu Sói rừng thu thập huyện Mèo Vạc 35 3.2.3 Đặc điểm mẫu Sói rừng thu thập huyện Quản Bạ .36 3.2.4 Đặc điểm mẫu Sói rừng thu thập huyện Hồng Su Phì .37 3.2.5 Đặc điểm mẫu Sói rừng thu thập huyện Vị Xuyên 38 3.3 Kết nhận dạng mẫu nguồn gen Sói rừng chị thị DNA 40 3.3.1 kết tách chiết DNA tổng số mẫu Sói rừng nghiên cứu .40 3.3.2 Kết PCR mẫu Sói rừng nghiên cứu 41 3.3.3 Kết giải trình tự vùng ITS-rDNA mẫu Sói rừng nghiên cứu 42 3.3.4 Kết phân tích đa dạng di truyền, xác định mối quan hệ di truyền 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu 43 3.4 Kết nghiên cứu nhân giống in vitro Sói rừng 45 3.4.1 Chọn vật liệu khởi đầu 45 3.4.2 Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến khả tạo mẫu vô trùng 45 3.4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng đến khả nhân nhanh chồi Sói rừng 47 v 3.4.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng chất kích thích sinh đến khả rễ chồi Sói rừng 55 3.4.5 Nghiên cứu đưa nhà kính 58 3.4.6 Chăm sóc giai đoạn in vitro KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 1.Kết luận 64 Kiến nghị 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 Từ, thuật ngữ viết tắt DNA PCR SR Cs IAA NAA BAP IBA MS CT LSD CV vii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Đặc điểm phân bố Sói rừng theo tuyến điều tra 31 Bảng 3.2 Đặc điểm mẫu thu thập 33 Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái mẫu Sói rừng thu thập huyện Xín Mần 34 Bảng 3.4 Đặc điểm hình thái mẫu Sói rừng thu thập huyện Mèo Vạc 35 Bảng 3.5 Đặc điểm hình thái mẫu Sói rừng thu thập huyện Quản Bạ 36 Bảng 3.6 Đặc điểm hình thái mẫu Sói rừng thu thập huyện Hồng Su Phì 37 Bảng 3.7 Đặc điểm hình thái mẫu Sói rừng thu thập huyện Vị Xuyên .38 Bảng 3.8 Danh sách 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu 40 Bảng 3.9 Độ dài trình tự 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu 42 Bảng 3.10: Hệ số tương đồng di truyền 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu mẫu tham chiếu 44 Bảng 3.11 Kết ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến khả tạo mẫu vô trùng (sau tuần nuôi cấy) 46 Bảng 3.12 Ảnh hưởng nồng độ BAP đến khả nhân nhanh chồi Sói rừng (sau tuần nuôi cấy) 48 Bảng 3.13 Ảnh hưởng tổ hợp BAP Kinetin đến hệ số nhân chồi sau tuần nuôi cấy (sau tuần nuôi cấy) 50 Bảng 3.14 Ảnh hưởng tổ hợp BAP Kinetin với NAA đến hệ số nhận chồi (sau tuần nuôi cấy) 52 Bảng 3.15 Ảnh hưởng tổ hợp BAP, Kinetin với IBA đến hệ số nhận chồi sau tuần nuôi cấy 54 Bảng 3.16 Kết ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ chồi Sói rừng 56 Bảng 3.17 Kết ảnh hưởng nồng độ IBA đến khả rễ chồi Sói rừng 57 Bảng 3.18 Ảnh hưởng số loại giá thể đến tỷ lệ sống Sói rừng in vitro sau tuần theo dõi 59 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây Sói rừng Hình 3.1 Mẫu Sói rừng thu thập huyện Xín Mần 35 Hình 3.2 Mẫu Sói rừng thu thập huyện Mèo Vạc 36 Hình 3.3 Mẫu Sói rừng thu thập huyện Quản Bạ 37 Hình 3.4 Mẫu Sói rừng thu thập huyện Hồng Su Phì 38 Hình 3.5 Mẫu Sói rừng thu thập huyện Vị Xuyên 39 Hình 3.6 kết tách chiết DNA tổng số 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu 41 Hình 3.7 Kết PCR 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu với cặp mồi ITS4/ITS5; M: Marker generuler 1kb plus DNA 42 Hình 3.8 Cây phát sinh chủng loại 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu với mẫu tham chiếu MH270480.1 Chloranthus erectus KP317601.1 Sarcandra glabra 44 Hình 3.9 Kết khử trùng mẫu đoạn thân Sói rừng HgCl2 0,1% 47 Hình 3.10 Ảnh hưởng nồng độ BAP đến hệ số nhân chồi Sói rừng 49 Hình 3.11 Ảnh hưởng nồng độ BAP kết hợp với Kinetin đến hệ số nhân chồi Sói rừng 51 Hình 3.12 Ảnh hưởng tổ hợp BAP Kinetin với NAA đến đến hệ số nhận chồi chồi Sói rừng 53 Hình 3.13 Ảnh hưởng tổ hợp BAP Kinetin với IBA đến khả nhân nhanh chồi Sói rừng 55 Hình 3.14 Ảnh hưởng NAA đến kết rễ chồi Sói rừng 57 Hình 3.15 Ảnh hưởng IBA đến kết rễ chồi Sói rừng 58 Hình 3.16 Ảnh hưởng số loại giá thể đến tỷ lệ sống Sói rừng .59 Hình 3.17 Sói rừng giai đoạn sau in vitro PHIẾU THU THẬP THƠNG TIN LIÊN QUAN ĐẾN LỒI SĨI RỪNG PHỎNG VẤN CÁN BỘ CHỦ CHỐT PHẦN A: THÔNG TIN CHUNG NGƯỜI ĐƯỢC PHỎNG VẤN Tên người vấn:………………………………… - Tuổi:………………… - Chức vụ/Lĩnh vực phụ trách: ………………………………………… - Đơn vị cơng tác: …………………………………………………… - Dân tộc:………………………………………… ………………… - Trình độ………………………………………….………………… - Số điện thoại liên hệ: ………………………………………………… Ngày vấn: …… /……/……… Người vấn:………………………………………… PHẦN B: THÔNG TIN VỀ LỒI SĨI RỪNG Ơng/bà cho biết trạng gây trồng Sói rừng địa phương? Khu vực phân bố Ý kiến khác:….……………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… Mức độ phong phú (nhiều/ít) Ơng/bà cho biết việc phát triển, gây trồng lồi Sói rừng địa phương thực từ hình thức nào? (tự gây trồng, dự án cung cấp, doanh nghiệp đầu tư,…): ……………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… Nguồn giống Sói rừng gây trồng lấy từ chủ yếu từ nguồn nào?: ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… Ông/bà cho biết thông tin biện pháp kỹ thuật áp dụng gây trồng địa phương? - Về mật độ trồng: …………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… -Về thời vụ trồng: …………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… - Về phương thức xử lý thực bì: ……………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… - Về kỹ thuật trồng cây: ……………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… - Về kỹ thuật chăm sóc, quản lý bảo vệ: ……………………………………………… ……………………………………………………………………………………… - Về kỹ thuật khai thác, thu hái: ……………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… Ơng/bà cho biết thơng tin sách phát triển lồi Sói rừng địa phương? ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… 6.Ơng/bà cho biết thơng tin thuận lợi khó khăn việc phát triển lồi Sói rừng địa phương? TT Các nhân tố Điều kiện sinh thái (Đất đai, khí hậu) Kỹ thuật nhân giống/ nguồn giống Kỹ thuật trồng, chăm sóc, thu hoạch Sơ chế, bảo quản Thị trường/giá Khác Ơng/bà cho biết thơng tin nhu cầu thị trường sản phẩm lồi Sói rừng địa phương? - Giá thị trường? ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… - Dạng sản phẩm tiêu thụ thị trường? ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… - Sản lượng tiêu thụ/năm? ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… - Đối tượng tiêu thụ chủ yếu? ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… - Hình thức tiêu thụ sản phẩm? ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… Ơng/bà cho biết giống lồi Sói rừng địa phương lấy từ chủ yếu từ nguồn nào?: ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… Ông/bà cho biết thơng tin phương thức trồng lồi Sói rừng áp dụng địa phương? ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… 10 Ơng/bà cho biết loại hình giống Sói rừng đưa vào gây trồng địa phương? + Cây nhân giống từ gieo hạt + Cây nhân giống từ giâm hom + Cây nhân giống từ nuôi cấy mô + Cả 03 loại hình 11 Ơng/bà cho biết thơng tin sở sản xuất giống Sói rừng (nếu có) địa phương? - Quy mơ, diện tích:…………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… - Cơng suất sản xuất:………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… - Hình thức vườn ươm:……………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… - Loài sản xuất chủ yếu:………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… - Loại hình giống sản xuất (cây hạt, hom, mô):………………………… ……………………………………………………………………………………… - Hình thức cung ứng giống:………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… 12 Ông/bà cho biết số thông tin tiềm phát triển Sói rừng địa phương? - Những sách/quy hoạch phát triển Sói rừng: ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… - Về nhu cầu sử dụng Sói rừng địa phương? ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… - Về nguồn vốn đầu tư cho phát triển Sói rừng? ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… - Về thị trường tiêu thụ sản phẩm Sói rừng? (thời điểm thu mua, số lượng, giá cả) ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… - Về khoa học công nghệ cho phát triển Sói rừng ? ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… 11 Ông/bà cho biết nhu cầu sử dụng sản phẩm từ Sói rừng địa phương? ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… 13 Ơng/bà cho biết thơng tin nhu cầu loại hình giống Sói rừng (hom, mô) sử dụng để phục vụ gây trồng địa phương? ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… 14 Ơng/bà có nhận định khả phát triển lồi Sói rừng tương lai (về diện tích gây trồng, loại hình giống, đối tượng có nhu cầu…)? ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… 15 Đề xuất Ơng/bà để phát triển lồi Sói rừng bền vững giai đoạn tới? ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… Xin trân trọng cảm ơn! Người vấn (Ký, ghi rõ họ tên) PHIẾU THU THẬP THƠNG TIN LIÊN QUAN ĐẾN LỒI SĨI RỪNG Phỏng vấn người dân PHẦN A: THÔNG TIN CHUNG NGƯỜI ĐƯỢC PHỎNG VẤN Tên người vấn:………………………………… - Tuổi:………………… - Dân tộc:………………………………………….…………………….………… - Trình độ………………………………………….…………………….………… - Địa chỉ: ………………………………………….…………………….………… - Số điện thoại liên hệ: ………………………………………………… ….…… Ngày vấn: …… /……/……… Người vấn:………………………………………… PHẦN II: THƠNG TIN VỀ SĨI RỪNG STT Câu hỏi Ơng/bà (hay gia đình ơng/bà) có biết Sói rừng dùng làm dược liệu khơng? Ơng/bà cho biết Sói rừng thường dùng để làm gì? Ơng/bà thường thu hái Sói rừng từ nguồn nào? Lưu ý: Đánh dấu vào nhiều phương án ghi nguồn chủ yếu? Theo ý kiến ông/bà, lồi Sói rừng thu hái từ địa phương so với năm/10 năm trước biến động nào? Theo ơng/bà, địa phương khu vực cịn nhiều Sói rừng Lưu ý: Điều tra viên đề nghị người trả lời cho biết rõ tên cụ thể khu vực Ơng/bà cho biết mục đích chủ yếu gia đình việc thu hái/gây trồng Sói rừng ? Ơng/bà cho biết số thông tin loại sản phẩm Sói rừng chủ yếu bán thị trường? Ơng/bà cho biết Sói rừng chủ yếu trồng theo hình thức/phương thức trồng nào? Ơng bà thường thu hái Sói rừng vào lúc nào? 10 Ơng/bà cho biết kỹ thuật trồng Sói rừng áp dụng địa phương? 11 Ông/bà cho biết kỹ thuật/kinh nghiệm chăm sóc Sói rừng ? (Có bón phân khơng? Phân gì? ) 12 Ơng/bà nghĩ nhu cầu sử dụng Sói rừng địa phương sau 5/10 năm nữa? 13 Để khuyến khích người dân tham gia phát triển Sói rừng địa phương, theo ơng/bà cần phải làm nào? 14 Ông/bà cho biết thị trường tiêu thụ Sói rừng địa phương? Bán đâu? bán cho ai? nào? 15 Ơng/bà cho biết thêm số thơng tin lồi Sói rừng ? Đặc điểm hình thái 16 Ơng/bà cho biết thêm kiến thức, kinh nghiệm ông/bà việc khai thác, chế biến, gây trồng, nhân giống Sói rừng ? DT trồng 16 Ơng/bà cho biết thông tin biện pháp kỹ thuật áp dụng gây trồng địa phương? - Về mật độ trồng: …………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… -Về thời vụ trồng: …………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… - Về phương thức xử lý thực bì: ……………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… - Về kỹ thuật trồng cây: ……………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… - Về kỹ thuật chăm sóc, quản lý bảo vệ: ……………………………………………… ……………………………………………………………………………………… - Về kỹ thuật khai thác, thu hái: ……………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… 17 Ơng/bà cho biết thơng tin thuận lợi khó khăn việc phát triển lồi Sói rừng địa phương? Điều kiện sinh thái (Đất đai, khí hậu) Kỹ thuật nhân giống/ nguồn giống Kỹ thuật trồng, chăm sóc, thu hoạch Sơ chế, bảo quản Thị trường/giá 18 Ông/bà cho biết nhu cầu sử dụng giống Sói rừng để gây trồng?: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… 19 Đề xuất Ông/bà để phát triển lồi Sói rừng bền vững giai đoạn tới? - Diện tích hộ muốn trồng (m2): ……………………………………………………… - Cung cấp giống - Hướng dẫn kỹ thuật trồng - Thu mua sản phẩm - Các đề xuất khác: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Xin trân trọng cảm ơn! ... NHUNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY SÓI RỪNG (Sarcandra glabra (Thunb. ) Nakai) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO Ngành : Công nghệ sinh học Mã số ngành: 8.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC... CAM ĐOAN Em xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu nhân giống Sói rừng (Sarcandra glabra (thunb. ) Nakai) kỹ thuật nuôi cấy in vitro? ?? trung thực, thực Viện Nghiên cứu Phát triển... cứu "Nghiên cứu nhân giống Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb. ) Nakai) kỹ thuật nuôi cấy in vitro? ?? làm sở khoa học cho cơng tác bảo tồn phát triển lồi Sói rừng tỉnh Hà Giang Mục tiêu nghiên cứu