Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của loại và nồng độ enzyme trên khả năng phóng thích tế bào trần từ lá in vitro, cụm chồi tăng sinh cao và hoa đực non của cây chuối Cau Mẵn được khảo sát. Các tế bào trần thu được từ các vật liệu này được nuôi cấy bằng các kỹ thuật khác nhau. Sự phát triển của tế bào trần được theo dõi nhờ kính hiển vi huỳnh quang.
SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL: NATURAL SCIENCE, VOL 1, ISSUE 6, 2017 Sự cô lập nuôi cấy tế bào trần từ vật liệu khác chuối Cau Mẵn (Musa spp.) Trần Thanh Hương Võ Quốc Cường Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Email: trthuong@hcmus.edu.vn (Bài nhận ngày 16 tháng 03 năm 2017, nhận đăng ngày 18 tháng 09 năm 2017) bào (6 ngày đầu) kỹ thuật lớp nuôi với tế bào ni cà rốt, mơi trường N6PKM có bổ sung 2,4Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng loại dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) 0,2 mg/L, αnồng độ enzyme khả phóng thích tế bào naphthalene acetic acid (NAA) mg/L zeatin trần từ in vitro, cụm chồi tăng sinh cao hoa 0,5 mg/L thích hợp cho phát triển tế bào đực non chuối Cau Mẵn khảo sát trần Các tế bào trần từ hoa đực non cụm chồi Các tế bào trần thu từ vật liệu tăng sinh cao có khả tạo vách phân chia ni cấy kỹ thuật khác Sự phát Đặc biệt, tế bào trần từ hoa đực non có phân triển tế bào trần theo dõi nhờ kính hiển chia khơng cân xứng Sự phát triển tế bào trần vi huỳnh quang Cường độ hô hấp hoạt tính từ hoa đực non chuối Cau Mẵn trải qua giai chất điều hòa tăng trưởng thực vật vật liệu đoạn: tạo vách (ngày 4), phân chia tế phân tích Khả phóng thích tế bào trần bào (ngày 6) hình thành cụm tế bào (ngày 28) đạt cao sau 16 xử lý hoa đực non với hỗn Mức độ phân hóa hoạt động sinh lý tế bào hợp enzyme cellulase 1,5 %, pectinase 0,25 % ban đầu định số lượng chất lượng tế hemicellulase 0,25 % (69,5 x 106 tế bào / g vật bào trần thu phát triển liệu) Sự phối hợp kỹ thuật nuôi cấy giọt treo tế tế bào trần Từ khóa: hoa đực non, kỹ thuật ni cấy giọt treo tế bào, kỹ thuật lớp nuôi, tế bào trần, Musa TÓM TẮT MỞ ĐẦU Chuối ăn trái ưa chuộng nhiều nước giới Trong trái chuối có chứa nhiều carbohydrat, potassium (một chất dinh dưỡng khoáng cần cho hoạt động nhịp nhàng tim), magnesium, potassium, vitamin vitamin C, vitamin B6, đặc biệt vitamin A, loại vitamin thường thiếu bữa ăn ngày người dân vùng nhiệt đới Ngồi ra, trái chuối sử dụng nguồn cung cấp lượng số nước Châu Phi Châu Á [1] Các nghiên cứu gần cho thấy trái chuối (Musa acuminata) có chứa Banlec, protein đặc biệt thuộc nhóm lectin có khả làm chậm lây lan HIV cách ngăn cản xâm nhập virus vào thể [2] Tuy nhiên, việc Trang 106 sản xuất chuối bị đe dọa chuối thường dễ bị nhiễm số bệnh bệnh đốm nấm Mycosphaerella fijiensis, bệnh héo Fusariumm oxysporum, bệnh virus bệnh trùng giun tròn… [3, 4] Do đó, việc vi nhân giống cải tiến giống chuối nhằm thu nhận giống có chất lượng tốt, bệnh, suất cao, qui mô công nghiệp nhà khoa học nhà trồng trọt quan tâm Vấn đề đặt đa số giống chuối trồng tam bội, khơng thụ tinh Do việc lai tạo cải tiến giống chuối trồng nhờ kỹ thuật lai giống truyền thống khó thực Theo Haicour cộng sự, kỹ thuật nuôi cấy dung hợp tế bào trần kỹ thuật giải vấn đề nêu [4] Tuy nhiên, để TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ: CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 1, SỐ 6, 2017 thực việc đòi hỏi phải có hệ thống tế bào trần có khả phát triển Chính vậy, lập nuôi cấy tế bào trần từ vật liệu khác chuối Cau Mẵn thực VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Các vật liệu khác chuối Cau Mẵn: in vitro 10 ngày tuổi tăng trưởng môi trường MS [5]; cụm chồi tăng sinh cao (CHP, highly proliferating meristem culture) nải hoa đực non vị trí từ đến 20 Dịch treo tế bào cà rốt 10 ngày tuổi, hình thành từ mơ sẹo có nguồn gốc trụ hạ diệp, tăng trưởng mơi trường MS có bổ sung 2,4Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) 1,2 mg/L zeatin 0,5 mg/L Các enzyme cellulase (Merck), hemicellulase (Sigma), pectinase (Himedia) macerozyme R10 (Phytotech) Môi trường nuôi cấy tế bào trần: N6PKM [4] có bổ sung 2,4-D 0,2 mg/L (Merck), NAA mg/L (Merck) zeatin 0,5 mg/L (Merck) [6] Khảo sát ảnh hưởng trạng thái sinh lý khả phóng thích tế bào trần Các non chưa mở mở chuối Cau Mẵn in vitro lập phân thành nhóm gam (mỗi nhóm) cắt thành lát song song, ngang qua gân chính, cách mm Sau đó, nhóm cho vào becher 25 mL chứa mL hỗn hợp enzyme gồm cellulase %, pectinase %, hemicellulase 1,5 % [6] Khảo sát ảnh hưởng loại nồng độ enzyme lên khả phóng thích tế bào trần từ non chưa mở gam non chưa mở chuối Cau Mẵn in vitro 10 ngày tuổi cô lập cắt thành lát song song, cách mm, ngang qua gân Sau cắt, mẫu cho vào becher 25 mL chứa mL hỗn hợp enzyme với loại nồng độ khác nhau: Cellulase %, pectinase % hemicellulase 1,5 %; cellulase %, pectinase %, hemicellulase % macerozyme %; cellulase 1,5 %, pectinase 0,5 %, hemicellulase 0,5 % macerozyme 0,5 % Khảo sát ảnh hưởng loại nồng độ enzyme khả phóng thích tế bào trần từ cụm chồi tăng sinh cao gam cụm chồi tăng sinh cao cô lập, cắt nhỏ cho vào becher 25 mL chứa mL hỗn hợp enzyme: cellulase %, pectinase % hemicellulase 0,5 %; cellulase %, pectinase % hemicellulase %; cellulase %, pectinase % hemicellulase 0,5 %; cellulase 1,5 %, pectinase 0,5 % hemicellulase %; cellulase 1,5 %, pectinase 0,5 % hemicellulase 0,5 % Khảo sát ảnh hưởng loại nồng độ enzyme thời gian xử lý khả phóng thích tế bào trần từ hoa đực non Các nải hoa đực non vị trí từ đến 20 cô lập gam hoa đực non cắt nhỏ cho vào becher 25 mL chứa mL hỗn hợp enzyme: cellulase 1,5 %, pectinase 0,25 % hemicellulase 0,25 %; cellulase 1,5 %, pectinase 0,5 % hemicellulase 0,5 %; cellulase 1,5 %, pectinase 0,5 %, hemicellulase 0,5 macerozyme 0,5 % Các enzyme hòa hỗn hợp dung dịch muối KCl % CaCl2 0,5 % Tất becher chứa mẫu xử lý đặt máy lắc với vận tốc 80 vòng/phút 30 phút, sau chuyển sang điều kiện lắc 30 vòng/phút, nhiệt độ 27 ± oC, tối, ẩm độ 65 ± % Khả phóng thích tế bào trần theo dõi theo thời gian nhờ kính hiển vi quang học, số tế bào trần phóng thích xác định buồng đếm hồng cầu Thu nhận tế bào trần khảo sát khả phát triển tế bào trần có nguồn gốc từ vật liệu khác Trang 107 SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL: NATURAL SCIENCE, VOL 1, ISSUE 6, 2017 Các tế bào trần từ non chưa mở in vitro, cụm chồi tăng sinh cao hoa đực non thu nhận cách lọc qua rây có kích thước lỗ 80 µm 30 µm, rửa với hỗn hợp dung dịch KCl % CaCl2 0,5 %, ly tâm vận tốc 650 vòng/phút phút, loại bỏ dịch để thu nhận tế bào trần (3 lần) hòa mơi trường lỏng N6PKM [4], có bổ sung 2,4-D 0,2 mg/L, NAA mg/L zeatin 0,5 mg/L mật độ 106 tế bào/mL [6] Tạo lớp tế bào nuôi: dịch treo tế bào cà rốt chuyển vào mơi trường lỏng N6PKM có bổ sung 2,4-D 0,2 mg/L, NAA mg/L zeatin 0,5 mg/L Môi trường đặc có thành phần (được bổ sung g/L agarose) giữ lỏng nhiệt độ 40 oC Sau đó, 40oC, dịch treo tế bào cà rốt (mật độ % thể tích tế bào lắng/thể tích mơi trường) vùi riêng rẽ vào mơi trường (theo tỉ lệ 1:1) để có mật độ tế bào sau % (thể tích tế bào lắng/thể tích mơi trường) đổ vào đĩa petri (5 mL cho đĩa có đường kính cm) [6] Một thể tích 300 µL dịch treo tế bào trần trải lên petri chứa tế bào lớp nuôi, ngăn cách với tế bào nuôi nhờ màng nylon có kích thước lỗ m Khảo sát ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên khả phát triển tế bào trần từ hoa đực non Tế bào trần có nguồn gốc hoa đực non sau thu nhận nuôi cấy theo cách sau: Dùng kỹ thuật giọt treo: 300 L dịch treo tế bào trần nhỏ trực tiếp lên petri thành giọt (50 L/giọt) Sau lật úp petri lại tạo thành giọt treo tế bào trần Dùng kỹ thuật tế bào lớp nuôi: 300 L dịch treo tế bào trần đặt nuôi petri chứa tế bào nuôi (1 giọt đường kính cm) ngăn cách với tế bào lớp nuôi nhờ màng nylon có kích thước lỗ m Trang 108 Phối hợp kỹ thuật giọt treo lớp nuôi: tế bào trần nuôi kỹ thuật giọt treo ngày, sau chuyển sang ni cấy kỹ thuật lớp nuôi Tất mẫu cấy đặt nuôi 27 oC, tối Sự phát triển tế bào trần quan sát kính hiển vi quang học theo thời gian Khả sống tế bào trần theo dõi nhờ nhuộm với 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC) % Sự thành lập vách khảo sát nhờ nhuộm với calcofluor 0,01 % phân chia nhân khảo sát nhờ nhuộm với 4,6-diamino-2phenilindol (DAPI) 0,005 %, phút điều kiện tối Sau đó, quan sát nhờ kính hiển vi huỳnh quang (Olympus CK41) Đo cường độ hô hấp Cường độ hô hấp (L oxygen/g trọng lượng tươi / giờ) non chưa mở chuối in vitro 10 ngày tuổi, cụm chồi tăng sinh cao nải hoa đực non xác định nhờ điện cực oxygen máy Oxylab Hansatech, 25 oC, tối Kết giá trị trung bình lần lặp lại Đo hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật auxin, cytokinin, gibberellin abscisic acid (dạng tự do) có vật liệu ly trích phân đoạn nhờ dung mơi hữu cơ, pH thích hợp thực sắc ký mỏng silicagel 60 F254 (Merk) 25 oC với dung môi di chuyển chloroform: methanol: acetic acid (80:15:5) Vị trí chất điều hòa tăng trưởng thực vật phát nhờ quan sát trực tiếp tia UV bước sóng 254 nm so với với indol acetic acid (IAA), zeatin, gibberellic acid (GA3) abscisic acid (ABA) tinh khiết (Yokota et al, 1980) Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật đo sinh trắc nghiệm: diệp tiêu lúa (Oryzasativa L.) cho auxin abscisic acid, tử diệp dưa leo (Cucumissativus L.) cho cytokinin, TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ: CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 1, SỐ 6, 2017 mầm xà lách (Lactucasativa L.) cho gibberellin [8] KẾT QUẢ Ảnh hưởng trạng thái sinh lý khả thu nhận tế bào trần tế bào trần quan sát thấy sau 14 Với mở, tế bào trần quan sát thấy sau 16 Khả phóng thích tế bào trần đạt cao sau 16 xử lý non chưa mở với hỗn hợp enzyme cellulase %, pectinase % hemicellulase 1,5 % (Bảng 1) Sự phóng thích tế bào trần từ non chưa mở xảy sớm so với mở Với non chưa mở, Bảng Ảnh hưởng trạng thái sinh lý khả phóng thích tế bào trần Thời gian xử lý Khả phóng thích tế bào trần Trạng thái sinh lý enzyme (giờ) (số tế bào trần x 106/g TLT) 15 0,43 ± 0,03b 16 0,50 ± 0,02ab Lá non chưa mở 17 0,53 ± 0,03a 18 0,20 ± 0,04d 18 0,20± 0,04d 19 0,23 ± 0,02cd Lá mở 20 0,29 ± 0,01c 21 0,09 ± 0,02 e Các số trung bình cột với mẫu tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,05 Ảnh hưởng loại nồng độ enzyme lên khả phóng thích tế bào trần từ non chưa mở Số tế bào trần phóng thích đạt cao sau 17 xử lý với hỗn hợp enzyme cellulase 1,5 %, pectinase 0,5 %, hemicellulase 0,5 %, macerozyme 0,5 % Sự phóng thích tế bào trần xảy sớm xử lý với hỗn hợp enzyme cellulase %, pectinase %, hemicellulase 1,5 % (12 giờ), chậm xử lý với hỗn hợp enzyme cellulase %, pectinase %, hemicellulase %, macerozyme % (13 giờ) chậm xử lý với hỗn hợp enzyme cellulase 1,5 %, pectinase 0,5 %, hemicellulase 0,5 %, macerozyme 0,5 % (14 giờ) (Bảng 2) Bảng Ảnh hưởng loại nồng độ enzyme lên phóng thích tế bào trần từ non chưa mở in vitro Hỗn hợp enzyme xử lý Cellulase % Pectinase % Hemicellulase 1,5 % Thời gian xử lý (giờ) 16 17 18 15 16 Khả phóng thích tế bào trần (số tế bào trần x 106/g TLT) 0,50 ± 0,02d 0,53± 0,03d 0,20 ± 0,02d 4,52 ± 0,30c 6,84 ± 0,32b Cellulase % Pectinase % Hemicellulase % 17 3,97 ± 0,40c Macerozyme % Cellulase 1,5 % 16 5,79 ± 0,73b Pectinase 0,5 % 17 9,76 ± 0,45a Hemicellulase 0,5 % 18 8,9 ± 0,12 a Macerozyme 0,5 % Các số trung bình cột với mẫu tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,05 Trang 109 SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL: NATURAL SCIENCE, VOL 1, ISSUE 6, 2017 Ảnh hưởng loại nồng độ enzyme khả phóng thích tế bào trần từ cụm chồi tăng sinh cao Khả phóng thích tế bào trần xảy sớm xử lý với hỗn hợp enzyme cellulase %, pectinase % hemicellulase 1,5 % (12 giờ), chậm xử lý với hỗn hợp enzyme cellulase %, pectinase %, hemicellulase % macerozyme % (13 giờ) chậm xử lý với hỗn hợp enzyme cellulase 1,5 %, pectinase 0,5 %, hemicellulase 0,5 % macerozyme 0,5 % (14 giờ) Số tế bào trần phóng thích đạt cao sau 17 xử lý với hỗn hợp enzyme cellulase 1,5 %, pectinase 0,5 %, hemicellulase 0,5 % macerozyme 0,5 % (Bảng 3) Bảng Ảnh hưởng loại nồng độ enzyme khả phóng thích tế bào trần từ cụm chồi tăng sinh cao Khả phóng thích tế bào trần Hỗn hợp enzyme xử lý Thời gian xử lý (giờ) (số tế bào trần x 106/g TLT) 17 11,42 ± 2,30def Cellulase 1,5% 18 18,67 ± 1,96a Pectinase 0,5% 19 17,33 ± 0,73ab Hemicellulase 0,5% 20 13,75 ± 0,52cde 17 6,58 ± 0,22hi Cellulase 2% 18 12,50 ± 2,17cdef Pectinase 1% 19 15,42 ± 1,46bc Hemicellulase 0,5% 20 8,33 ± 0,17gh 17 6,50 ± 0,14hi Cellulase 2% 18 14,33 ± 0,74cd Pectinase 1% 19 11,08 ± 0,65efg Hemicellulase 1% 20 9,75 ± 0,76fg 15 6,42± 0,17hi Cellulase 3% 16 8,17 ± 0,08gh Pectinase 1% 17 6,25 ± 0,50hi Hemicellulase 0,5% 18 4,58 ± 0,22ij Các số trung bình cột với mẫu tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,05 Ảnh hưởng loại nồng độ enzyme khả phóng thích tế bào trần từ hoa đực non Khả phóng thích tế bào trần xảy sớm xử lý với hỗn hợp enzyme cellulase 1,5 %, pectinase 0,5 %, hemicellulase 0,5 %, macerozyme 0,5 (12 giờ), chậm xử lý với hỗn hợp enzyme cellulase 1,5 %, pectinase 0,25 %, hemicellulase 0,25 % (13 giờ), hay hỗn hợp Trang 110 enzyme cellulase 1,5 %, pectinase 0,5 %, hemicellulase 0,5 %, macerozyme 0,5 % (13 giờ) Số tế bào trần phóng thích đạt cao sau 16–17 xử lý với hỗn hợp enzyme cellulase 1,5 %, pectinase 0,25 % hemicellulase 0,25 % sau 17 xử lý với hỗn hợp enzyme cellulase 1,5 %, pectinase 0,5 %, hemicellulase 0,5 %, macerozyme 0,5 % (Bảng 4, Hình 1C) TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ: CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 1, SỐ 6, 2017 Bảng Ảnh hưởng loại nồng độ enzyme khả phóng thích tế bào trần từ hoa đực non Khả phóng thích tế bào trần (số tế bào trần x 106/g TLT) 15 13,17 ± 0,07 e Cellulase 1,5% 16 63,00 ± 4,33 a Pectinase 0,25% 17 68,50 ± 1,73 a Hemicellulase 0,25% 18 21,75 ± 8,80 de 15 33,5 ± 2,60 c Cellulase 1,5% 16 30,33 ± 2,62 cd Pectinase 0,5% 17 69,50 ± 1,15 a Hemicellulase 0,5% 18 45,83 ± 0,44 b 14 16,50 ± 0,86 e Cellulase 1,5% 15 18,50 ± 1,73 e Pectinase 0,5% Hemicellulase 0,5% 16 17,00 ± 0,58 e Macerozyme 0,5 17 13,75 ± 1,87 e Các số trung bình cột với mẫu tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,05 Hỗn hợp enzyme Thời gian xử lý (giờ) Khả phóng thích tế bào trần đạt cao với vật liệu hoa đực non xử lý với hỗn hợp enzyme cellulase 1,5 %, pectinase 0,25 %, hemicellulase 0,25 % (16 giờ), thấp vật liệu cụm chồi tăng sinh cao xử lý với hỗn hợp enzyme cellulase 1,5 %, pectinase 0,5 %, hemicellulase 0,5 % (18 giờ), non chưa mở xử lý với hỗn hợp enzyme cellulase 1,5 %, pectinase 0,5 %, hemicellulase 0,5 %, macerozyme 0,5 % (17 giờ) thấp mở xử lý với hỗn hợp enzyme cellulase %, pectinase %, hemicellulase 1,5 % (20 giờ) chuối in vitro 10 ngày tuổi (Bảng 5) Đường kính trung bình tế bào trần cô lập từ mở, non chưa mở cụm chồi tăng sinh cao tương đương lớn nhiều so với tế bào trần cô lập từ hoa đực non (Bảng 5) Bảng Khả thu nhận tế bào trần từ loại vật liệu khác Loại vật liệu Lá non chưa mở Lá mở Cụm chồi tăng sinh cao Hoa đực non Hỗn hợp enzyme xử lý Cellulase 1,5% Pectinase 0,5% Hemicellulase 0,5% Macerozyme 0,5% Cellulase 6% Pectinase 3% Hemicellulase 1,5% Cellulase 1,5% Pectinase 0,5% Hemicellulase 0,5% Cellulase 1,5% Pectinase 0,25% Hemicellulase 0,25% Thời gian xử lý (giờ) Khả phóng thích tế bào trần (số tế bào trần x 106/g TLT) Đường kính trung bình tế bào (m) 17 9,76 ± 0,50c 16,80 ± 1,19 a 20 0,30 ± 0,01 d 19,5 ± 1,32 a 18 18,67 ± 1,96b 17,9 ± 0,59 a 16 69,50 ± 1,15a 8,75 ± 0,84 b Các số trung bình cột với mẫu tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,05 Trang 111 SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL: NATURAL SCIENCE, VOL 1, ISSUE 6, 2017 Cường độ hơ hấp hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật vật liệu dùng cô lập tế bào trần Cường độ hô hấp đạt cao nải hoa đực non, giảm mạnh cụm chồi tăng sinh cao thấp non chưa mở chuối in vitro 10 ngày tuổi (Bảng 6) Hoạt tính IAA zeatin cao nải hoa đực non, thấp cụm chồi tăng sinh cao non chưa mở Hoạt tính gibberellin cao non chưa mở, thấp cụm chồi tăng sinh cao hoa đực non Hoạt tính abscisic acid cao non chưa mở, giảm mạnh cụm chồi tăng sinh cao thấp hoa đực non (Bảng 6) Bảng Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật vật liệu dùng cô lập tế bào trần Vật liệu Lá non chưa mở in vitro Cụm chồi tăng sinh cao Hoa đực non Cường độ hô hấp (l O2/g TLT/giờ) Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật (mg/L) IAA Zeatin Gibberellin Abscisic acid 218,03 ± 7,50 c 0,13 ± 0,01 b 0,93 ± 0,32 b 0,14 ± 0,01 a 6,78 ± 0,19 a 288,35 ± 11,64 b 517,76 ± 5,42 a 0,12 ± 0,01 b 0,31 ± 0,03 a 0,89 ± 0,20 b 3,89 ± 0,68 a 0,10 ± 0,01 b 0,08 ± 0,01 b 3,41 ± 0,29 b 2,30 ± 0,35 c Các số trung bình cột với mẫu tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,05 Khả phát triển tế bào trần từ loại kỹ thuật giọt treo ngày chuyển sang vật liệu khác nuôi cấy nhờ kỹ thuật lớp nuôi (Hình 6) Sau ngày ni cấy mơi trường N6PKM có bổ sung 2,4-D 0,2 mg/L, NAA mg/L zeatin 0,5 mg/L kỹ thuật lớp nuôi, tế bào trần từ non chưa mở khơng có phát triển, không chuyển màu hồng nhuộm với TTC 1% (Hình 2) Các tế bào trần lập từ cụm chồi tăng sinh cao hay hoa đực non có khả sống, chuyển màu hồng nhuộm với TTC 1% phát triển với diện tế bào trạng thái phân chia (Hình 3) Các tế bào có nguồn gốc từ cụm chồi tăng sinh cao phân chia tương đối đồng (Hình 3) tế bào từ hoa đực non có phân chia khơng cân xứng (Hình 4) Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên phát triển tế bào trần từ hoa đực non Trong hai trường hợp nuôi cấy kỹ thuật giọt treo hay lớp nuôi, tế bào trần từ hoa đực non có thành lập vách sau ngày ni cấy (Hình 2) phân chia sau ngày ni cấy (Hình 3-5) Tuy nhiên, tế bào khơng có khả phát triển (tạo cụm) tiếp tục trì điều kiện giọt treo hay lớp ni Sự hình thành cụm tế bào xảy tế bào nuôi cấy nhờ Trang 112 THẢO LUẬN Ở chuối Cau Mẵn, khả phóng thích tế bào trần đạt cao hoa đực non, giảm dần cụm chồi tăng sinh cao, non chưa mở thấp mở chuối in vitro 10 ngày tuổi Có lẽ mức độ phân hóa tế bào vật liệu sử dụng yếu tố dẫn đến khác biệt độ nhạy vật liệu với enzyme Thật vậy, đa số tiết nhiều hợp chất thứ cấp bị tổn thương chuối thường cấu tạo lớp cutin dày, chất nhày (mucilage) đặc biệt phần vách tế bào rắn Các già, mức độ rắn vách tế bào cao [9, 10] Do đó, khả phóng thích tế bào trần từ non chưa mở cao so với mở Trong đó, hoa đực non cụm chồi tăng sinh cao chứa tế bào mơ phân sinh chồi với kích thước tế bào nhỏ, đẳng kính, vách mỏng, có khả phân chia hoạt động khơng giới hạn Chính vách tế bào mỏng nên tế bào đáp ứng tốt với enzyme phân hủy vách tế bào Do đó, khả phóng thích tế bào trần từ hoa đực non cụm chồi tăng sinh cao cao so với (Bảng 1-5) Nếu hoa đực non bao gồm tế bào TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ: CHUN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 1, SỐ 6, 2017 mô phân sinh (số liệu chưa công bố), cụm chồi tăng sinh cao thời điểm tuần tuổi có hình thành phát thể Sự hình thành phát thể cho thấy mức độ phân hóa tế bào cụm chồi cao so với hoa đực non Điều dẫn đến khả phóng thích tế bào trần từ hoa đực non cao so với cụm chồi tăng sinh cao (Bảng 5) Theo nghiên cứu cô lập tế bào trần chuối nói riêng hay đơn tử diệp khác lúa, bắp lúa mì, dịch treo tế bào vật liệu chủ yếu để cô lập nuôi cấy tế bào trần [11, 12] Mức độ phân hóa tế bào vật liệu ảnh hưởng đến mức độ đồng tế bào trần thu nhận Lá có mức độ phân hóa cao với diện nhiều loại tế bào bao gồm: tế bào biểu bì, nhu mơ libe, nhu mơ diệp lục với kích thước khác Trong đó, mơ phân sinh (ngọn chồi hoa) chứa tế bào có kích thước tương đối đồng Đặc biệt, tế bào mô phân sinh hoa trạng thái phân chia mạnh để chuyển từ trạng thái không hạn định (mô phân sinh chờ) sang hạn định (mơ phân sinh hoa) [11, 13] nên có kích thước nhỏ (Bảng 5, Hình 1) Vai trò tổ chức tế bào mô phân sinh, cường độ hơ hấp, hoạt tính IAA zeatin cao tế bào ban đầu yếu tố định phát triển tế bào trần Biểu cho thấy nuôi cấy tế bào trần thành công tái tạo lại vách tế bào (Hình 2) Sau phân chia tế bào để tạo nhóm tế bào Hoa đực non cụm chồi tăng sinh cao chứa tế bào trạng thái phân chia mạnh nên có cường độ hơ hấp mạnh, hoạt tích auxin cytokinin cao nhiều so với non chưa mở (Bảng 6) Auxin có vai trò kích thích tạo vách tế bào Auxin làm gia tăng cường độ hô hấp cách trực tiếp huy động chất dự trữ tạo nguồn nguyên liệu cho hô hấp tế bào Sự diện hoạt động phối hợp auxin cytokinin giúp gia tăng kích thước tế bào đồng thời tác động lên hai bước trình phân chia tế bào (phân nhân phân bào) [11] Chính vậy, sau ngày ni cấy mơi trường N6PKM có bổ sung 2,4-D 0,2 mg/L, NAA mg/L zeatin 0,5 mg/L, tế bào từ hoa đực non cụm chồi tăng sinh cao có tái tạo vách thực phân chia (Hình 35) Đặc biệt, tế bào trần từ hoa đực non có phân chia bất đối xứng tương tự bước hình phơi soma (Hình 4) Trong đó, tế bào trần từ non chưa mở khơng có phát triển sau ngày ni cấy, không chuyển sang màu hồng nhuộm với TTC 1% Theo Davey cộng [14], tế bào trần tất tế bào thể hệ khác, có tính tồn có khả tái sinh thành cách trực tiếp hay gián tiếp qua đường sinh phôi thể hệ thực tế điều tùy thuộc vào điều kiện mơi trường Thơng thường, vào giai đoạn đơn bào, tế bào trần không tiếp xúc với ảnh hưởng ổn định không cảm ứng từ tế bào lân cận, chúng đánh khả tái sinh Bên cạnh đó, đơn tử diệp, kỹ thuật “lớp ni” thường dùng tác nhân kích thích tăng trưởng tế bào trần [4, 11] Chính vậy, mơi trường N6PKM (giàu vitamin, chất hữu cơ) có phối hợp bổ sung auxin, cytokinin đặc biệt tế bào nuôi cà rốt giúp tái tạo vách cho tế bào trần kích thích phân chia Tuy nhiên, không thành phần môi trường định nuôi cấy tế bào trần thành công mà kỹ thuật nuôi cấy quan trọng Khi nuôi cấy kỹ thuật giọt treo, tế bào tiếp xúc trực tiếp với khơng khí nên hoạt động hô hấp tế bào diễn mạnh giúp tế bào dễ dàng phân chia, đặc biệt phân chia khơng cân xứng (Hình 4, 5), chuẩn bị cho tạo nhóm nhỏ tế bào Tuy nhiên, nhược điểm phương pháp thể tích mơi trường (50 L), môi trường lỏng dễ bay hơi, tế bào không phát triển tiếp tục nuôi cấy điều kiện Chính vậy, việc chuyển tế bào sang ni cấy điều kiện có diện lớp tế bào nuôi cần thiết để tế bào tiếp tục phân chia tạo cụm sau 28 ngày ni cấy (Hình 6) Trang 113 SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL: NATURAL SCIENCE, VOL 1, ISSUE 6, 2017 KẾT LUẬN Ở chuối Cau Mẵn, cô cập ni cấy tế bào trần thực từ cụm chồi tăng sinh cao hoa đực non Mỗi loại vật liệu cần loại, nồng độ enzyme thời gian xử lý thích hợp Hoa đực non cho hiệu suất thu nhận tế bào trần cao sau 16 xử lý với hỗn hợp enzyme cellulase 1,5 A %, pectinase 0,25 % hemicellulase 0,25 % Điều kiện thích hợp cho phát triển tế bào trần là: dùng mơi trường N6PKM có bổ sung 2,4D 0,2 mg/L, NAA mg/L zeatin 0,5 mg/L; nuôi cấy nhờ kỹ thuật giọt treo ngày, sau chuyển sang ni cấy nhờ kỹ thuật lớp nuôi với tế bào nuôi cà rốt B C 20m 20m 20m Hình Các tế bào trần từ vật liệu khác sau xử lý với hỗn hợp enzyme (A), Các tế bào trần từ non chưa mở in vitro sau 17 xử lý với hỗn hợp enzyme cellulase 1,5%, pectinase 0,5%, hemicellulase 0,5% macerozyme 0,5% (B), Các tế bào trần từ cụm chồi tăng sinh cao sau 18 xử lý với hỗn hợp enzyme cellulase 1,5%, pectinase 0,5% hemicellulase 0,5% (C), Các tế bào trần từ hoa đực non sau 16 xử lý với hỗn hợp enzyme cellulase 1,5%, pectinase 0,25% hemicellulase 0,25% A B 30 m 30 m Hình Các tế bào phát triển từ tế bào trần có nguồn gốc hoa đực non sau ngày nuôi cấy kỹ thuật giọt treo, mơi trường N 6PKM có bổ sung 2,4-D 0,2 mg/L, NAA mg/L zeatin 0,5 mg/L Mẫu nhuộm với TTC 1% (A) calcofluor 0,01% (B) Trang 114 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ: CHUN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 1, SỐ 6, 2017 10 m Hình Tế bào có nguồn gốc từ cụm chồi tăng sinh cao giống chuối Cau Mẵn sau ngày ni mơi trường N 6PKM có bổ sung 2,4-D 0,2 mg/L, NAA mg/L zeatin 0,5 mg/L 30µm Hình Tế bào p hát triển từ tế bào trần có nguồn gốc hoa đực non trạng thái phân chia (mũi tên) sau ngày nuôi cấy kỹ thuật giọt treo Mẫu nhuộm với calcoflour 0,01 % DAPI 0,0005 % 10m Hình Các tế bào có nguồn gốc từ hoa đực non sau ngày nuôi cấy môi trường N6PKM có bổ sung 2,4D 0,2 mg/L, NAA mg/L zeatin 0,5 mg/L nhuộm với TTC 1% (mũi tên) 40 µm Hình Cụm tế bào hình thành từ tế bào trần có nguồn gốc hoa đực non sau 28 ngày nuôi cấy (6 ngày kỹ thuật giọt treo 22 ngày kỹ thuật lớp nuôi) Protoplast isolation and culture from different explants of Musa spp Cau Man Tran Thanh Huong Vo Quoc Cuong University of Science, VNU-HCM ABSTRACT In this paper, the roles of type and concentration of enzymes on protoplast isolation from in vitro leaves, multi-scalps (highly proliferating meristem culture), and young male flower of banana cv Cau Man were studied Respiration rate and content of plant hormones of these materials were analysed Different techniques were used to culture these protoplasts The development of protoplasts was observed under fluorescence microscope The highest yield of protoplast (69.5 x 106 protoplasts / g fresh weight) was obtained from young male flowers after 16 hours treatment with 1.5 % cellulase, 0.25 % pectinase and 0.25 % hemicellulase The Trang 115 SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL: NATURAL SCIENCE, VOL 1, ISSUE 6, 2017 combination of hanging drop cell technique (in development of protoplasts from young male days), and carrot feeder layer cells in N6PKM flower began with cell walls creation after days, medium supplemented with 0.2 mg/L 2,4the cell division was after days, and small dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), mg/L αcolonies formation was after 28 days of culture naphthalene acetic acid (NAA), and 0.5 mg/L The differentiation and physiological activity of zeatin are suitable for protoplast development cells play an important role on quantity and Protoplasts that were isolated from multi-scalps quality of protoplasts, as on the well as protoplast and young male flowers created the wall and development divided when cultured by this method The Keywords: feeder layer, hanging drop cell culture, Musa, protoplast, young male flower TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] G Aurore, B Parfait, L Fahrasmane, [7] H Meidner, Class experiments in Plant Bananas, raw materials for making processed Physiology, George Allen and Unwin, food products, Trends Food Science London, 180 (1984) Technology, 20, 78–91 (2009) [8] T Yokota, N Murofushi, N Takahashi, Extraction, purification, and identification, [2] A.C.M.B Sansone, M Sansone, C.T dos Hormonal regulation of development Part I Santos Dias, J.R.O Nascimento, Oral Molecular aspects of plant hormones, J administration of banana lectin modulates MacMillan - Encyclopedia of plant cytokine profile and abundance of T-cell physiology, New series, Springer New York, populations in mice, International Journal of 9, 113–201 (1980) Biological Macromolecules, 89, 19–24 (2016) [3] N Roux, F.C Baurens, J Doležel, E Hřibová, P Heslop-Harrison, C Town, T Sasaki, T Matsumoto, R Aert, S Remy, M Souza, P Lagoda, Genomics of banana and plantain (Musa spp.), major staple crops in the tropics, In: Genomics of Tropical Crop Plants.Moore P.H and Ming R (eds.), Springer, 83–111 (2008) [4] R Haicour, A Assani, V Bui Trang, A Guedira, Protoplast isolation and culture for banana regeneration via somatic embryogenesis, Fruit, 64, 261–269 (2009) [5] T Murashige, F Skoog, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures, Plant Physiol., 15, 3, 473–497 (1962) [6] Trần Thanh Hương, Bùi Trang Việt, Sự cô lập nuôi cấy tế bào trần chuối cau mẵn, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 51(5B), 139–144 (2013) Trang 116 [9] Trương Thị Đẹp, Thực vật dược, Nhà xuất Y học, pp 311 (2007) [10] J.K.C Rose, The plant cell wall, Wiley Blackwell Publishing, pp 400 (2003) [11] Bùi Trang Việt, Sinh lý thực vật đại cương Trường Đại học Khoa học Tự nhiên -Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh, tr 753 (2016) [12] A Assani, R Haicour, G Wenzel, B Foroughi-Wehr, F Bakry, F Côté, G Ducreux, A Ambroise and A Grapin, Influence of donor material and genotype on protoplast regeneration in banana and plantain cultivars (Musa spp.), Plant Science, 162, 3, 355–362 (2002) [13] R.F Evert, Esau’s Plant Anatomy: Meristems, cells, and tissues of the plant body: their structure, function, and development, John Wiley and Sons, pp 601 (2006) [14] M.R Davey, P Anthony, Plant Cell Culture, John Wiley and Sons, pp.341 (2010) ... phải có hệ thống tế bào trần có khả phát triển Chính vậy, lập ni cấy tế bào trần từ vật liệu khác chuối Cau Mẵn thực VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Các vật liệu khác chuối Cau Mẵn: in vitro 10... nghiên cứu cô lập tế bào trần chuối nói riêng hay đơn tử diệp khác lúa, bắp lúa mì, dịch treo tế bào vật liệu chủ yếu để cô lập nuôi cấy tế bào trần [11, 12] Mức độ phân hóa tế bào vật liệu ảnh... lại tạo thành giọt treo tế bào trần Dùng kỹ thuật tế bào lớp nuôi: 300 L dịch treo tế bào trần đặt nuôi petri chứa tế bào nuôi (1 giọt đường kính cm) ngăn cách với tế bào lớp ni nhờ màng nylon