Chương 3 Nuôi cấy tế bào động vật phần 2 TS. Đặng Đức Long

Kỹ thuật phân tách tế bào cell separation Kích thước và phương pháp tách dựa vào vận tốc lắng: Định luật Stoke Vt: Vận tốc lắng của tế bào; R: bán kính của tế bào a: gia tốc ly tâm của m

Trang 1

CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

3.4 Kỹ thuật cơ bản trong nuôi cấy tế bào

Khởi đầu việc nuôi cấy

Trang 2

3.4.1 Kỹ thuật phân tách tế bào (cell separation)

• Tách một loại hay nhiều loại tế bào từ một quần thể gồm

nhiều loại tế bào khác nhau

• Ứng dụng:

- Tạo nguồn tế bào cho nuôi cấy

- Chẩn đoán và điều trị bệnh

- Nghiên cứu cho liệu pháp miễn dịch

- Nghiên cứu cho liệu pháp tế bào gốc

- Nghiên cứu ung thư

Trang 3

Phương pháp

Kích thước

Phương pháp lọc

(Filtration))

vật lí

thước Hình dạng

Tỉ trọng

)

Phương pháp li tâm (Centrifugation))

Trang 4

Trang 5

Trang 6

Trang 7

Trang 8

Trang 9

Trang 10

Phương pháp ly tâm theo gradient tỉ trọng

Trang 11

Kích thước và phương pháp tách dựa vào vận tốc lắng

Trang 12

Kích thước và phương pháp tách dựa vào vận tốc lắng:

Định luật Stoke

V(t): Vận tốc lắng của tế bào; R: bán kính của tế bào

a: gia tốc ly tâm của máy ; p(s): tỉ trọng tế bào

p: tỉ trọng của môi trường ; µ: độ nhớt của môi trường

Trang 13

Li tâm r ửa (Centrifulgal Elutriation)

Trang 14

T ế bào trong buồng phân tách chịu tác động bởi 2 lực Khi 2 lực này

cân b ằng nhau thì tế bào sẽ cố định ở vị trí xác định Bởi các tế bào

khác nhau v ề kích thước, bề mặt cấu hình do đó các tế bào sẽ có xu

h ướng cân bằng tại những vị trí khác nhau trong buồng phân tách.

Trang 15

B ởi vì buồng phân tách được thiết kế nhỏ dần về phía biên của rotor

nên t ốc độ dòng chảy sẽ tăng dần về phía biên Như vậy cộng với lực ly

tâm, m ột dãy liên tục về tốc độ dòng chảy được hình thành.

Trang 16

Trang 17

• Ái lực và các phương pháp tách dựa vào kháng thể

- CD (Cluster of differentiation): Marker bề mặt tế bào

- Có hơn 300 loại CD (người)

-Ví dụ:

Trang 18

• Ái lực và các phương pháp tách dựa vào kháng thể

G ắn kết miễn dịch (Immune panning)

Trang 19

• Tách bằng Cryogel

Trang 20

• Tách bằng Cryogel

Trang 21

• Tách dựa vào hạt có từ tính -Magnetic activated cell sorting

(MACS)

Trang 22

Trang 23

Trang 24

Tách d ựa vào hạt được kích hoạt huỳnh quang - Flourescent

activated cell sorting (FACS)

Trang 25

Tách d ựa vào hạt được kích hoạt huỳnh quang - Flourescent

activated cell sorting (FACS)

Trang 26

Trang 27

Trang 28

Trang 29

Trang 30

Trang 31

FACS Calibur

Trang 32

Trang 33

Chọn phương pháp phân tách tế bào phù hợp:

Trang 34

3.4.2 Kỹ thuật cấy truyền tế bào lớp đơn

• là kỹ thuật chọn lọc và tách các tế bào dạng lớp đơn từ kết quả nuôi cấy sơ cấp, chuyển sang nuôi cấy các loại tế bào khác

nhau

• Giai đoạn cấy chuyển vào gần cuối pha log

Trang 35

V ật liệu

Các bình nuôi cấy tế bào sơ cấp

dung dịch HBSS (Hanks' balanced salt solution) không có

Ca2+ và Mg2+, 37 °C

Ca và Mg , 37 °C

Dung dịch Trypsin/EDTA, 37°C

Môi trường được bổ sung huyết thanh, vd: DMEM

(Dulbecco's Modified Eagle's Medium ) với 10% - 15% (V/ V)

d/d FBS (Fetal bovine serum) với DMEM-10 hay -15, 37°C

Pipet, đầu côn vô trùng

Khay ấm 37°C hoặc máy ủ

Bình nuôi cấy 25cm2 hoặc đĩa petri

Trang 36

Trang 37

Hút bỏ môi trường cũ

- Loại bỏ tất cả các môi trường từ nuôi

cấy sơ cấp với một ống pipet vô trùng.

Trang 38

Trypsin là một serine protease tìm thấy trong hệ tiêu hóa của

nhiều động vật có xương sống, có vai trò thủy phân các protein.

Môi trường hoạt động

pH: 6-9 (tối ưu ở pH 8-9)

Rửa và tách các tế bào

- Đặt đĩa trên một khay ấm 37°C từ 1-2 phút

- Gõ nhẹ đáy đĩa trên mặt bàn để tách các tế bào

- Kiểm tra quá trình nuôi cấy bằng kính hiển vi hồng ngoại.

- Thêm huyết thanh hoặc môi trường có chứa huyết thanh để ức chế trypsin.

pH: 6-9 (tối ưu ở pH 8-9)

Trang 39

Chọn các tế bào thích hợp chuyển sang môi trường mới

- Thêm một lượng bằng nhau dung dịch huyền phù tế bào cho các đĩa hoặc bình nuôi cấy đã được dán nhãn thích hợp.

- Thêm 4 ml môi trường mới vào, bảo quản trong tủ nuôi cấy điều

kiện 37 0 C, CO 5%.

kiện 37 0 C, CO2 5%.

- Cung cấp dinh dưỡng cho các mảng nhỏ nuôi cấy (subconfluent cultures) sau 3 hoặc 4 ngày bằng cách loại bỏ môi trường cũ và thay môi trường mới, 37 0 C.

- Chuyển qua lần nuôi cấy tiếp theo khi môi trường nghèo chất dinh dưỡng.

Trang 40

3.4.3 Kỹ thuật cấy truyền trong nuôi cấy huyền phù tế bào

• Nuôi cấy huyền phù tế bào là

phương thức nuôi cấy các tế bào

trong môi trường lỏng trong bình

nuôi có dung tích phù hợp và lắc

nhẹ nhàng.

• C ấy chuyển các dung dịch huyền

phù ít phức tap hơn cấy chuyển

nuôi cấy lớp đơn do không cần thiết

trước khi khi cấy chuyển.

Trang 41

VẬT LIỆU

• Các bình nuôi cấy chứa dung dịch

huyền phù tế bào

• Bình Shaker mà không có vách

ngăn hoặc bình spinner

• Môi trường sinh trưởng hoàn chỉnh,

được làm ấm tới 37 0 C

• Tủ ủ 37 0 C với nồng độ CO2 5%

• Máy khuấy từ, giá đựng bình

• Hóa chất và trang thiết bị để xác

định kết quả và đếm tổng số tế bào.

Trang 42

trường để duy trì mật độ 1 × 106 tế bào /ml Nhẹ nhàng lắc bình để làm phân tán các tế bào.

• Đặt bình vào buồng ủ:

Vmt <15ml: đặt bình nằm ngang

Vmt ≥15ml: đặt bình đứng.

Trang 43

Các bước thực hiện

Trong những ngày nuôi cấy không cung cấp dinh dưỡng, kiểm tra tế bào thông qua quá trình làm vẩn đục bình và quan sát sự thay đổi màu sắc trong môi trường để phát hiện sự sinh trưởng phát triển các

tế bào là tốt

Khi các tế bào nuôi cấy kết tụ (~2.5 × 10 2cell/ml) sẽ cấy chuyển như sau:

• Lấy bình từ buồng ủ và lắc bình cho tới khi các tế bào tách rời

nhau trong môi trường

• Lấy 1/2 thể tích tế bào huyền phù và chuyển sang một bình mới

• Cung cấp dinh dưỡng cho mỗi bình 7-10 ml môi trường đã được làm ấm và tiếp tục đưa vào buồng ủ.

Trang 44

3.4.3 Kỹ thuật xác định số lượng tế bào

Sử dụng buồng đếm hồng cầu và thuốc nhuộm trypan blue

Cấu tạo buồng đếm hồng cầu:

Buồng đếm hồng cầu là một bản

kính dầy với phần trung tâm là

buồng đếm, được dùng để định

lượng tế bào.

Trang 45

Cấu tạo buồng đếm hồng cầu:

Trang 46

Thuốc nhuộm trypan blue

Trang 47

Màng tế bào của những tế bào

sống có khả năng thấm chọn

lọc, ngăn không cho trypan

blue xâm nhâp vào tế bào →

không bắt màu.

Đối với những tế bào chết hay

mô chết, màng tế bào không có

khả năng thấm chọn lọc, trypan

blue có thể vượt qua màng →

bắt màu xanh

Trang 48

Vật liệu

Ethanol 70 % (v/v)

Huyền phù tế bào

Thuốc nhuộm trypan blue 0.4% (w/v) hoặc nigrosin 0.4% (w/v)

được chuẩn bị trong HBSS

Buồng đếm hồng cầu có lá kính đậy

Máy đếm cầm tay

Trang 49

Các bước thực hiện:

Chuẩn bị buồng đếm hồng cầu

Chuẩn bị huyền phù tế bào

Trang 50

Chuẩn bị buồng đếm hồng cầu:

- Làm sạch lá kính đậy và buồng đếm hồng cầu bằng cồn 70 %.

- Làm ướt mép của lá kính đậy (lamen) và ấn thành đường rãnh trên buồng đếm hồng cầu

Chuẩn bị huyền phù tế bào

- Đối với các tế bào phát triển trong nuôi cấy lớp đơn, tách tế bào từ bề mặt của đĩa bằng cách sử dụng trypsin.

- Pha loãng tế bào cần thiết để thu được huyền phù đồng nhất hoặc phân tán một số cụm tế bào.

Trang 51

Nạp buồng đếm hồng cầu

- Sử dụng một pipet Pasteur vô trùng

để chuyển huyền phù tế bào tới cạnh

buồng đếm.

- Giữ đầu pipet dưới lá kính đậy và

nạp đầy huyền phù vào buồng đếm.

Trang 52

Tính tổng số lượng tế bào

- Xác định số tế bào/ ml sử dụng công thức sau:

Tế bào/ml = (số lượng trung bình tế bào ở mỗi ô vuông) x (hệ số pha loãng) x 104

10 4 là h ệ số điều chỉnh thể tích buồng đếm hồng cầu

Tổng số tế bào = (tế bào/ml) x (tổng thể tích ban đầu của huyền phù tế bào)

Trang 53

• Nhuộm tế bào để xác định sức sống của tế bào:

- Thêm 0,5ml thuốc nhuộm trypan

blue 0,4%; 0,3ml HBSS; 0,1 ml

huyền phù tế bào vào 1ống nhỏ

- Trộn thật kỹ và để yên trước khi nạp

buồng đếm hồng cầu 0,4 % thuốc

nhuộm trypan blue hoặc 0,4 %

nigrosin có thể được sử dụng để xác

định số lượng tế bào có khả năng

tồn tại và phát triển độc lập

- Các tế bào chết sẽ bắt màu nhuộm,

các tế bào sống sẽ không bắt màu

nhuộm.

Trang 54

Trang 55

3.4.4 Kỹ thuật tạo dòng tế bào

Khái niệm

Trang 56

Khái niệm: phân biệt giữa cell clones và cell lines

Trang 57

Khái niệm: phân biệt giữa cell clone và cell lines

Trang 58

Khái niệm: phân biệt giữa cell clone và cell lines

• Cell clone: là 1 nhóm các tế bào giống hệt nhau và chúng có cùng tổ tiên (phát sinh từ cùng 1 tế bào)

• Cell line: một tập hợp tế bào được nuôi cấy được lựa chọn trên

cơ sở đồng nhất của các tế bào và chúng thường xuất phát từ một nguồn mô đồng nhất

Trang 59

Khái niệm:

Trang 60

Trang 61

Định dạng
Số trang	77
Dung lượng	5,7 MB