NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Giới thiệu Để thực hiện phương pháp nuôi cấy tế bào thành công, việc chuẩn bị hệ thống nuôi cấy có điều kiện phù hợp để tế bào sống và biểu hiện các đặc điểm di truyền là rất cần thiết. Nhìn chung có thể chia làm hai kiểu nuôi cấy là: hệ thống nuôi cấy khép kín (đóng không liên tục) và hệ thống nuôi cấy mở (nuôi cấy liên tục). Trong nuôi cấy khép kín, một số thành phần thiết yếu không được cung cấp cũng như không loại bỏ các sản phẩm và chất loại thải trong suốt quá trình nuôi cấy. Trái lại, hệ thống nuôi cấy mở nuôi cấy liên tục có thể duy trì điều kiện nuôi cấy ( thành phần chất dinh dưỡng, pH, chất thải loại,…) ổn định trong suốt quá trình nuôi cấy.

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH HỌC TIỂU LUẬN MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chủ đề: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Giáo viên hướng dẫn: Học viên thực hiện: PGS.TS TRẦN QUỐC DUNG 1) PHAN MAI MINH TÂM Lớp: LL & PPDH SINH HỌC K24 2) PHẠM THÀNH ĐỊNH Lớp: Động vật học - K24 Huế, 4/ 2016 NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT CƠ SỞ KỸ THUẬT NI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT CĨ VÚ Trình bày bởi: Kiran N.Birje M.Sc.II Giới thiệu - Để thực phương pháp nuôi cấy tế bào thành cơng, việc chuẩn bị hệ thống ni cấy có điều kiện phù hợp để tế bào sống biểu đặc điểm di truyền cần thiết - Nhìn chung chia làm hai kiểu ni cấy là: hệ thống ni cấy khép kín (đóng/ khơng liên tục) hệ thống nuôi cấy mở (nuôi cấy liên tục) - Trong ni cấy khép kín, số thành phần thiết yếu không cung cấp không loại bỏ sản phẩm chất loại thải suốt q trình ni cấy - Trái lại, hệ thống ni cấy mở / ni cấy liên tục trì điều kiện ni cấy ( thành phần chất dinh dưỡng, pH, chất thải loại,…) ổn định suốt q trình ni cấy HỆ THỐNG NI CẤY KHÉP KÍN (Ni cấy khơng liên tục) - Trên sở tính đồng thành phần hệ thống, ni cấy khép kin/khơng liên tục có hai hình thức ni cấy theo mẻ ni cấy dòng đệm; hai hình thức phải đảm bảo vị trí chất trộn - Mẻ nuôi cấy: Một lô hay hệ thống nuôi cấy xếp thông thường thêm chất chủng ngừa(trong trường hợp tế bào ATC) vào bể nuôi cấy từ đầu q trình; sau ủ nhiệt độ thích hợp mơi trường khí thời gian thích hợp HỆ THỐNG NI CẤY THEO MẺ ( Batch culture system) Nuôi cấy theo mẻ sử dụng rộng rãi số q trình sản xuất cơng nghiệp, ví dụ cơng nghiệp rượu bi; mục đích làm dễ q trình ni cấy; khử trùng nghiêm ngặt hơn; dễ điều chỉnh thành phần dinh dưỡng Thuận lợi sử dụng lao động phổ thơng khơng u cầu kỹ thuật rủi ro tài Nhược điểm: Q trình hình thành sản phẩm giới hạn khoảng thời gian định Ví dụ sản phẩm lên men HỆ THỐNG NI CẤY MỞ (Hệ thống ni cấy liên tục) ( Open culture system) - Để day trì ổn định trạng thái nuôi cấy, nghĩa điều chỉnh điều kiện nuôi cấy đáp ứng nhu cầu sinh lý tế bào, cần phải thường xuyên bổ sung chất (chất dinh dưỡng thành phần thiết yếu khác) đồng thời loại bỏ sản phẩm cuối khỏi bể nuôi cấy - Như vậy, môi trường nuôi cấy vô trùng liên tục bổ sung chất thêm vào bình ni cấy (bể phản ứng sinh học = bioreactor), đồng thời làm loãng sản phẩm cuối tích lũy hệ thống Đây thường gọi hệ thống nuôi cấy liên tục Có kiểu hệ thống ni cấy mở khác biệt là: Nuôi cấy liên tục chemostat (Chemostat culture) phương pháp ni cấy liên tục dòng chảy mơi trường đưa vào bể nuôi cấy với tỷ lệ xác định tốc độ tăng trưởng giữ khơng đổi Trong ni cấy hóa ổn định (chemostat culture) tỉ lệ pha lỗng (D= F/V) khơng đổi • Ưu điểm: - Biết tốc độ tăng trưởng dòng tế bào q trình ni cấy - Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường nuôi cấy mà không can thiệp vào tốc độ tăng trưởng - Duy trì sản lượng tối đa sinh khối hay sản phẩm Nuôi cấy liên tục Turbidostat (Turbidostat culture) phương pháp ni cấy liên tục mật độ tế bào giữ mức độ xác định cách hòa lỗng mơi dịch ni cấy với môi trường hệ thống tự động - Trong turbidostat, nồng độ sinh khối dòng dịch ni cấy trì mức khơng đổi cách giám sát độ đục dịch nuôi cấy thông qua việc sử dụng tế bào quang điện điều chỉnh tỷ lệ cung cấp dung dịch dinh dưỡng vào hệ thống - Ưu điểm: Phù hợp trường hợp tế bào sinh trưởng chậm; sinh vật nhỏ bé tế bào có chu kỳ phức tạp Nuôi cấy liên tục Fed-batch(Fed-batch culture): cách ni cấy theo mẻ có phương tiện hỗ trợ để thêm chất dưỡng vào nhằm ngăn chặn suy giảm chất dinh dưỡng môi trường nuôi cấy, không loại bỏ sản phẩm kết thúc q trình ni cấy NI CẤY TẾ BÀO SƠ CẤP - Các tế bào di chuyển cách phẫu thuật enzyme từ phận thể vào mơi trường ni cấy thích hợp tế bào thích ứng phát triển gọi nuôi cấy sơ cấp - Tế bào sơ cấp có tuổi thọ định - Ni cấy sơ cấp tạo tập hợp tế bào phức tạp không đồng - Sự truyền cấy tế bào sơ cấp tạo hệ dòng tế bào - Dòng tế bào có tuổi thọ xác định, chúng biến đổi thời gian ngắn trước bị lão hóa - Các đại thực bào tế bào thần kinh khơng phân chia - Dòng tế bào thể hình thành từ ni cấy sơ cấp gọi dòng tế bào • DÒNG TẾ BÀO LIÊN TỤC (CONTINUOUS CELL LINES) - Hầu hết dòng tế bào phát triển qua số hệ sau dừng, khơng tiếp tục phân chia - Dòng tế bào bình thường tự động tác động virut biến đổi sinh hóa tạo thành dòng tế bào liên tục - Đặc điểm dòng tế bào liên tục là: + Nhỏ, tuổi thọ dài/ trải qua nhiều hệ, bám dính với tỉ lệ nhân/tế bào chất cao + Chắc chắn sinh trưởng mơi trường thích hợp có NST khơng đổi + Giảm lượng nước tế bào; phụ thuộc vào neo đậu phát triển mạnh điều kiện treo + Có khả phát triển/ phân chia đến mật độ tế bào mơi trường cao CÁC DỊNG TẾ BÀO ĐỘNG VẬT ĐÃ NUÔI CẤY THÀNH CÔNG ( Common cell lines) • Human cell lines/ Các dòng tế bào người: - MCF-7 breast cancer / tế bào ung thư vú - HL 60 Leukemia / tế bào bạch cầu - HEK-293 Human embryonic kidney / tế bào thận - HeLa Henrietta lacks/ • Primate cell lines/ Các dòng tế bào bản: - Vero African green monkey kidney epithelial cells/ Các tế bào biểu mô thận khỉ xanh châu Phi - Cos-7 African green monkey kidney cells/ Các tế bào thận khỉ xanh châu Phi -Và nhiều dòng tế bào khác dòng tế bào buồng trứng (CHO) chuột, sf9 sf21 từ trùng • CÁC BƯỚC NI CẤY TẾ BÀO SƠ CẤP Ni cấy tế bào sơ cấp gồm bước sau: Thu mẫu Tách mô Mổ xẻ mô/ pân tách tế bào Đưa tế bào vào bể nuôi cấy(bioreactor) thực q trình ni cấy • LƯU Ý KHI TÁCH TẾ BÀO Có cách phân tách tế bào: - Cắt nhỏ mô thu - Phân tách tế bào học/ xay nghiền cần không cần ngâm - Dùng enzyme để tế bào KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ CƠ BẢN - Phát triển ban đầu Harrison vào năm 1907 - Một mảnh mô nhúng huyết tương máu bạch huyết +huyết chiết xuất từ phôi thai - Được đặt lam kính có chỗ lõm - Ngưng đọng tổ chức mô lại với - Tế bào phát triển, phân chia, tăng số lượng - Nó gọi ni cấy giọt treo KỸ THUẬT NI CẤY MƠ CẢI TIẾN - Cắt nhỏ mơ Rửa với PBS BSS Cấy lên bề mặt chất nuôi cấy Rồi bổ sung thêm huyết Tế bào bám vào bề mặt phân chia PHÂN TÁCH BẰNG ENZYME - Enzyme sử dụng phân tách tế bào trypsin + EDTA trypsin - Trypsin ấm (warm trypsin): Ngâm mô với trypsin 37oC + sau di chuyển( tách) cách ly tâm + trung hòa với huyết - Trypsin lạnh (cold trypsin): Ngâm mô trypsin 4oC đến 18 sau ủ nhiệt độ 37oC 20 đến 30 phút tế bào bị tách rời Hiệu loại enzyme khác Trypsin Pronase cho phân tách Trypsin Pronase làm hoàn toàn hỏng tế bào Collagenase dispase phân tách Collagenase dispase gây tổn khơng hồn tồn thương tế bào Hyaluronidase + Collagenase tiêu hóa nội bào chất gian bào DNase – phân giải DNA giải phóng từ tế bào bị tan Sự khác trypsin ấm trypsin lạnh Trypsin ấm - Thời gian ngăn - Năng suất thấp - Đòi hỏi phải ly tâm sau ngâm Trypsin lạnh - Cho suất cao nhờ cải thiện sống tế bào sau nuôi cấy 24 - Không cần thiết khuấy ly tâm - Ủ 4oC, thực qua đêm - Đối tượng quan phôi thai Các điều kiện cần thiết cho trính nuôi cấy thành công: - Mỡ mô hoại tử loại bỏ q trình bóc tách tế bào Khi cắt (mô) nên dùng dụng cụ thật sắc nhọn Nên sử dụng Enzyme khác phân tách tế bào Mật độ tế bào sơ cấp lớn nuôi cấy thay thế/ truyền cấy Nên lựa chọn phương tiện vừa phải Nên lựa chọn nguyên liệu nuôi cấy tế bào mô phôi thai PHÂN TÁCH CƠ HỌC Thu thập tế bào tách cắt mơ.(tế bào dính nạo ra) Nhấn Sieving( dụng cụ có đầu có lỗ nhỏ rây) lên mô để tế bào bị tách qua lỗ rây Lấy tế bào mảnh vỡ sót vào xilanh Dùng pipette trộn mẫu mơ liên tục, nhẹ nhàng, khéo léo để tế bào tách rời Các mẫu mơ lách, gan phôi thai, não phôi thai người lớn số khối u mềm người động vật PHÂN TÁCH TẾ BÀO - Có phương pháp phổ biến để tách tế bào phân biệt kích cỡ, mật độ, điện diện tích bề mặt Đo dòng tế bào (Flow cytometry): đo lường độ sáng tế bào bề mặt nuôi cấy Flow cytofluorimetry: fluorochromes cụ thể gắn liền với tế bào tế bào tách sở phát sáng số chất tác dụng xạ Cả hai phương pháp thực thành cơng sử dụng chất phát sáng tác dụng xạ Kích hoạt tế bào Sorter (FACS) Các phương pháp vật lý: Tách dựa kích cỡ tế bào: nằng máy ly tâm v = r2.4 Tách dựa mật độ tế bào: mật độ chênh lệch gradient thích hợp sử dụng Chủ yếu ATC percoll, Metrazami Tách dựa điện bề mặt: điện Tách dựa mối quan hệ cấu trúc: sắc ký Sử dụng kháng sinh lectin SỐ LƯỢNG TẾ BÀO TỒN TẠI Hemacytometer: Hemacytometer có số lượng xác định bề mặt mơi trường ni cấy Nó xác định số lượng tế bào sống số lượng tế bào chết ml môi trường Nồng độ tế bào dịch treo tương tự tế bào gốc ngưng hoạt động, giống buồng bất kỳ- ngoại trừ pha loãng Các tế bào chết bắt đầu bị loãng màu, chuyển màu xanh xuất vết loang màu xanh kính hiển vi Các tế bào sống ngăn chặn chuyển màu có màu sáng trắng Vì thể tính tốn số lượng tỉ lệ tế bào sống sót - Xác định số lượng tế bào sống theo công thức sau: Tổng số tế bào sống % Tế bào tồn = - x 100 Tổng số tế bào sống không sống Số tế bào/ml = Tổng số tế bào sống ô/4 x 10,000 Số tế bào/ml= Tổng số tế bào sống ơ/5 x 10,000 10 DUY TRÌ NI CẤY HẰNG NGÀY - u thích cơng việc - Quan sát ngày!!! + Về hình thái + Về mức độ phù hợp pH + Chất thải môi trường/ mức ô nhiễm môi trường nuôi cấy Kiểm tra bình ni cấy điều kiện thiết lập mức độ CO2 Xem mức độ lồng ủ thùng về: + Nhiệt độ + Mực nước/ lượng nước DUY TRÌ DINH DƯỠNG TRONG NI CẤY - Để q trình ni cấy thành cơng đòi hỏi phải trì nguồn dinh dưỡng đầy đủ hàng ngày - Thiết lập trì nguồn dinh dưỡng cho chuỗi thí nghiệm với mật độ tế bào xác định, phương tiện thiết bị điều kiện lồng kính - Bổ sung thêm bình qn hàng ngày, theo định kỳ trước chất bị cạn kiệt - Lượng cung cấp dinh dưỡng tùy thuộc vào mật độ tế bào bình ni cấy - Sự cung cấp nguồn dinh dưỡng tuân theo lịch trình xác định NI CẤY KHƠNG CĨ KHÁNG SINH - Việc gián đoạn sử dụng kháng sinh điều kiện nuôi cấy bình thường đáng giá mức độ xâm nhiễm vi sinh vật lên tế bào - Một số phòng thực hai mẫu nguồn dự trữ dòng tế bào, mẫu bình thường đầy đủ nguồn dự trữ mẫu có chất kháng sinh chống nấm tự trung bình - Ni cấy có kháng sinh thơng thường tự cần thiết - Một loại kiểm tra đơn giản sử dụng mơ hình vỏ bọc - Sự nhiễm khuẩn Mycoplasma khó khăn dẫn đến hủy diệt/ chết hang loạt - Các loại sinh vật gây số vấn đề nghiêm trọng tính tốn tế bào chết dẫn đến thay đổi cấu trúc chức tế bào nhân thực, trao đổi chất tăng trưởng đặc điểm mà khơng biểu rõ ràng nhiều hệ tế bào 11 CÁC LOẠI HÌNH NI CẤY TẾ BÀO A Nuôi cấy đơn lớp (Monolayer culture) - Trong nuôi cấy tế bào lớp có lớp tế bào mà khơng có tế bào phát triển tế bào khác tất chúng phát triển bên cạnh thường xuyên chạm vào bề mặt tăng trưởng - Hầu hết dòng tế bào động vật nuôi cấy sơ cấp tăng trưởng dày lên lớp tế bào gắn liền với loại chất nhựa thủy tinh - Một phần bề mặt chất che phủ tế bào (một tập hợp nuôi cấy), phát triển chậm lại sáu chấm dứt Do để giữ tế bào khỏe mạnh phát triển cách mạnh mẽ cần thiết phải nuôi cấy lại chúng cách thường xuyên Ưu điểm nuôi cấy tế bào lớp: - Dễ dàng thực hiện, đòi hỏi kiểm tra số lượng tế bào khả sống chúng hàng ngày - Khơng đòi hỏi tách tế bào enzyme học - Tăng trưởng bị hạn chế tập trung tế bào môi trường, dễ dàng mở rộng quy mô - Được sử dụng cho sản xuất số lượng lớn protein, thu hoạch hàng loạt, nhiều ứng dụng nghiên cứu B.Nuôi cấy huyền phù (Suspension culture) - Phần lớn nguồn gốc tế bào lấy từ động vật có xương sống, ngoại lệ có dòng tế bào tạo máu vài loại tế bào khác, neo phụ thuộc 12 phải nuôi cấy chất thích hợp xử lý đặc biệt phép tế bào kết dính lan rộng (nghĩa xử lý mơ ni cấy) Cho phép nhiều dòng tế bào thích hợp với ni cấy huyền phù Tương tự, số dòng tế bào trùng có bán sẵn phát triển tốt nuôi cấy đơn lớp nuôi cấy huyền phù - Các tế bào ni cấy huyền phù trì bình ni cấy mà khơng phải xử lý ni cấy mơ, khối lượng ni cấy có diện tích bề mặt tăng cao mà khơng đủ khí trao đổi (thường 0,2 – 0,5 ml/cm2) cần khuấy, lắc xoay mòng bình ni C Ni cấy MICROCARRIER - Một microcarrier khuôn hỗ trợ tăng trưởng tế bào dính bể phản ứng sinh học (bioreactor) - Các microcarrier chế tạo từ số vất liệu quan trọng gồm DEAEdextran, thủy tinh, nhựa giữ nhiệt, acrylamide, collagen chất liệu này, với chất hóa học bề mặt khác nhau, ảnh hưởng đến tế bào hình thái học phát triển - Một vài loại microcarriers có bán thị trường bao gồm microcarrier dextran-based (cytodex, GE Healthcare), microcarrier collagen-base (cultispher, percell), microcarrier polystyrene- base (Solo Hill Engineering) Chúng khác trạng thái rổ nó, trọng lượng riêng, tính chất quang học, diện thành phần động vật chất hóa học bề mặt 13 - Kiểu ni cấy tế bào Microcarrier thường thực bình spinner, khác bình phản ứng sinh học quay khơng trọng lực bình phản ứng sinh học tầng sơi hỗ trợ ni cấy microcarrier - Nuôi cấy Microcarrier giới thiệu khả lần làm cho ni cấy tế bào neo phụ thuộc thực tế có suất cao - Trong nuôi cấy microcarrier tế bào phát triển lớp bề mặt bình cầu nhỏ - Bằng cách sử dụng microcarriers hệ thống ni treo đơn giản, để đạt suất triệu tế bào mililit • Những ưu điểm công nghệ microcarrier ngành sản xuất vaccine là: (a) Dễ thiết lập quy mô sản xuất lớn, (b) Khả kiểm sốt xác điều kiện tăng trưởng tế bào cách tinh vi nhờ hệ thống máy tính, (c) Giảm khơng gian sàn khối lượng lồng ấp cần thiết cho hoạt động sản xuất kích thước, (d) Giảm nhu cầu lao động kỹ thuật 14 D Nuôi cấy tế bào gốc • Tế bào gốc có khả đặc biệt phát triển thành loại tế bào khác thể từ bé đến trưởng thành • Các tế bào gốc biệt hóa thành loại tế bào khác hai đặc điểm quan trọng: Thứ nhất, chúng tế bào chưa biệt hóa tự làm tế bào phân chia thời gian sau thời kỳ dài hoạt động Thứ hai, điêu kiện sinh lý thí nghiệm thích hợp chúng biệt hóa phát triển thành tế bào mơ, quan đặc trưng với chức riêng Các nhà khoa học chủ yếu ứng dụng hai loại tế bào gốc từ động vật người là: tế bào gốc phôi thai tế bào gốc xoma trưởng thành • Các tế bào gốc phát triển bề mặt môi trường nuôi cấy sinh sản/ phân chia khơng biệt hóa Ví dụ tế bào ngun sợi chuột (SCO) • Yếu tố bệnh bạch cầu ức chế (LIF) dường yếu tố giữ tế bào khoang tế bào gốc, mạng lưới, vitamin D3, hợp chất phân cực phẳng gây biệt hóa cụ thể chuột người; trường hợp nuôi cấy tế bào u ác tính người • Phần lớn dòng tế bào ES người hình thành lớp MEF conc cao Trong mơi trường khơng có huyết tương người phần lớn có sẵn dòng tế bào hES cần nuôi cấy đồng thời với MEFs để trì cấu tạo khơng bị biệt hóa • Hạn chế ni cấy ES người thời gian yêu cầu kỹ thuật cao 15 16 ...NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT CƠ SỞ KỸ THUẬT NI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT CĨ VÚ Trình bày bởi: Kiran N.Birje M.Sc.II Giới thiệu - Để thực phương pháp nuôi cấy tế bào thành công, việc... phát triển gọi ni cấy sơ cấp - Tế bào sơ cấp có tuổi thọ định - Nuôi cấy sơ cấp tạo tập hợp tế bào phức tạp không đồng - Sự truyền cấy tế bào sơ cấp tạo hệ dòng tế bào - Dòng tế bào có tuổi thọ... tế bào sống sót - Xác định số lượng tế bào sống theo công thức sau: Tổng số tế bào sống % Tế bào tồn = - x 100 Tổng số tế bào sống không sống Số tế bào/ ml = Tổng số tế bào