Kỹ Thuật Nuôi Cấy Tế Bào Động Vật

KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT I GIỚI THIỆU CHUNG: • * Harrison (1907),Carrel (1912): nuôi cấy tế bào động vật • Ếch nguồn mô để nuôi cấy • * Sự thúc đẩy y học buộc người ta quan tâm đến loài động vật ổn nhiệt • * Dòng Hela Gey cộng thiết lập năm 1952 • * Năm 1961 Hayflick Moorhead nghiên cứu tế bào bình thường có đời sống xác đònh • * Tạo vaccin kháng virus nghiên cứu ung thư thúc đẩy kỹ thuật nuôi cấy TBĐV phát triiển • * Sự phát triển chung kỹ thuật công nghệ làm nuôi cấy mô quan tâm rộng rãi • * Kỹ thuật nuôi cấy mô ứng dụng nhiều vào lónh vực y học công nghiệp Những thuận lợi nuôi cấy mô  a Kiểm soát môi trường b Tính đồng mẫu c Kinh tế  Những khó khăn nuôi cấy mô a Sự thành thạo người thao tác b Số lượng  c Sự không ổn đònh Những khác biệt tế bào điều kiện in vitro •* Thay đổi không gian kết hợp •* Không tính tương tác tế bào chuyên biệt, tương tác đa chiều • * Không thực đại diện cho mô mà từ tế bào tách thiếu yếu tố điều hòa II ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Tính học yếu Tăng trưởng phân chia chậm Cơ chế kìm hãm ngược (negative feed-back) Tính chất cần giá đỡ Thay đổi kiểu gen kiểu hình Có thể bảo quản lâu dài phương pháp lạnh sâu Các đặc tính khác III.MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Môi trường • *Môi trường tổng hợp dần thay chiết phẩm sinh học (phôi gà, huyết ) • *Đa số dòng tế bào nuôi cấy môi trường tổng hợp có bổ sung – 10% huyết (có dòng tế bào cần bổ sung 20% huyết thanh) * Một vài loại môi trường thường sử dụng nuôi cấy tế bào mô động vật: • Môi trường BM (Basal Medium): tế bào Hela, tế bào L • Môi trường E’MEM (Eagle Minimum Essential Medium) • Môi trường D'MEM (Dulbecco – Modified Eagle Medium) • Môi trường F10, F12: R.G Ham thiết lập dùng cho nguyên bào sợi • Môi trường Iscove: N.N.Iscove thiết lập sở tiếp tục cải biến môi trường DMEM • Môi trường 5A: T.A Mc.Coy thiết lập, thường dùng cho tế bào bệnh bạch huyết • Môi trường RPMI-1640: G.E Moore thiết lập, dùng để nuôi tế bào mô bạch huyết • Môi trường 199: R.C Parker thiết lập dùng để nuôi tế bào mô phôi gà sản xuất vaccin phòng bệnh bại liệt Huyết thanh: • *Cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào amino acid thiết yếu, tiền chất nucleic acid, nguyên tố vi lượng… • *Cung cấp nhân tố tăng trưởng, kích thích cho tế bào tăng trưởng phân chia •* Kích thích phục hồi tổn thương tế bào cấy chuyền protein huyết làm bất hoạt trypsin tránh enzym gây tổn thương tế bào • *Cải thiện tính tan chất dinh dưỡng • *Cải thiện tính dính tế bào lên bề mặt bình nuôi nhờ yếu tố làm tăng độ dính tế bào lên giá đỡ • *Chống oxy hóa: huyết có tính kháng oxy hóa mạnh ức chế độc tính oxy Giới thiệu kỹ thuật pha môi trường Một số điều cần lưu ý pha môi trường • Thành phần môi trường: + Acid amin: cung cấp nguồn N cho tế bào + Glucose: cung cấp nguồn C cho tế bào + Vitamine: yếu tố vi lượng quan trọng hoạt động sống tế bào + Muối khoáng: tạo hệ đệm trì áp suất thẩm thấu phù hợp + Protein: quan trọng yếu tố tăng trưởng diện huyết có vai trò kích thích phân bào • Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ, độ ẩm, nồng độ CO2 • Sự vô trùng  IV KỸ THUẬT TÁCH TẾ BÀO, CHỌN DÒNG TẾ BÀO VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VÂÏT Kỹ thuật tách tế bào Một số khái niệm: • *Dòng tế bào (cell line) • *Dòng tế bào liên tục (continued cell line; established cell line) Ví dụ: CHO (chinese hamster ovary: tế bào buồng trứng chuột Trung Quốc), Schneider-2 (tế bào phôi ruồi giấm), COS1 (tế bào thận khỉ xanh Châu Phi), Hela (tế bào ung thư cổ tử cung người), Vero (tế bào thận khỉ xanh Châu Phi) • *Dòng tế bào tạm thời (temporary cell line) • *Tế bào sơ cấp (primary cell) • *Tế bào thứ cấp (secondary cell) Ceramic matrix Vài đặc điểm hệ thống là: • *Mật độ tế bào cao > 108/ml • *Nồng độ sản phẩm cao: hollow fibre 400mg/l IgM, 1100mg/l IgG; ceremic matrix module: 300mg/l • *Chất dinh dưỡng, oxy chất thải tạo thành gradient buồng nuôi • *Khoảng cách khuếch tán dài oxy chất dinh dưỡng hollow-fibre • *Sản phẩm thu không lẫn hay tế bào • *Đánh giá mật độ tế bào phòng nuôi lượng oxy tiêu thụ •* Không có chổ để lấy mẫu tế bào để kiểm tra mức độ sống hình thái tế bào trình nuôi cấy •* Không có lực thủy động lực học gây biến dạng hollow-fibre •* Màng hệ thống hollow-fibre bò bít lại •* Sự tăng quy mô bò giới hạn chiều dài ống vượt độ dài đònh gia tăng đường kính số lượng module đưa vào •* Khó chuyển tế bào phát triển hệ thống nhỏ vào hệ thống lớn * Bioreactor khuấy •*Tế bào huyền phù đồng • *Kiểm soát môi trường (pH, oxy, dinh dưỡng) • *Dễ lấy mẫu tế bào để kiểm tra • *Dễ chuyển tế bào sang bước tăng quy mô • *Cung cấp oxy số quan trọng bioreactor lớn hay mật độ nuôi cấy cao Các ống silicone/polypropylene thấm oxy tạo nên bọt khí tự do, chiều dài ống tùy theo lượng oxy yêu cầu • *Tế bào bò tác động lực thủy động học * Airlift bioreactor • *Không cần ống silicone dài để cấp không khí • *Tế bào bò phá hỏng lực gây biến dạng bóng khí • *Cần bổ sung chất chống tạïo bọt môi trường có nhiều protein • *Sự lưu thông tế bào gia tăng thiết bò khuấy học nhằm hạn chế tỷ lệ phun khí mật độ tế bào thấp đủ trì lượng oxy hòa tan Các hình thức nuôi cấy • Các hình thức nuôi cấy để sản xuất MAbs hệ thống nuôi cấy in vitro lớn: + Batch (theo mẻ) + Chemostat (nuôi cấy liên tục) • Batch dùng phổ biến • Hình thức chemostat cho phép tạo MAbs liên tục * Hình thức batch Cấy tế bào Vệ sinh thiết bò Tế bào phát triển đạt yêu cầu Thu hoạch •*Mật độ tế bào thấp so với nuôi c liên tục hay hệ thống không đồng (cuối trình, có 5x10 tế bào/ml) •*Mật độ sản phẩm thường thấp 100mg/l •*Yêu cần kiểm soát trình thấp *Có tích tụ chất biến đổi chất thải *Tỷ lệ thời gian sản xuất thời gian tái sản xuất thấp * Hình thức chemostat Hệ thống chemostat •* Mật độ tế bào đạt đến mật độ cuối hình thức batch trì ổn đònh •* Hàm lượng sản phẩm cao 300mg/l •* Điều kiện nuôi cấy không đổi •* Tối ưu cho việc tạo sản phẩm kháng thể không tối ưu cho tạo sinh khối •* Tối ưu cho thông số điều kiện ổn đònh với độ xác cao •* Năng xuất cao •* Tốc độ chảy môi trường mực chất lỏng bioreacter phải kiểm soát V MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT •* Nghiên cứu bệnh lý (bệnh di truyền, ung thư ); nghiên cứu độc tính hoạt chất (các chất ô nhiễm, chất chống ung thư); nghiên cứu (apoptosis, ung thư học tế bào, biệt hóa ) • * Ghép mô thể • * Tạo nên sản phẩm sinh học hormone insulin; tạo kháng thể đơn dòng • * Dùng tế bào nuôi cấy để sản xuất vaccin Ví dụ vaccin phòng HBV (Hepatitis B virus) sản xuất dòng tế bào ung thư gan người (tế bào Alexander, tế bào huGK-14) chuyển plasmid mang gen mã hóa kháng nguyên bề mặt HBs HBV • *Sản xuất virus cách gây nhiễm vào tế bào động vật Virus sản xuất dùng làm vaccin hay sản xuất enzym RTase (Reverse Transcriptase)… • *Sản xuất interferon tế bào động vật Interferon tế bào tiết bò virus công có tính chất kháng virus kháng khối u ... thường có đời sống xác đònh • * Tạo vaccin kháng virus nghiên cứu ung thư thúc đẩy kỹ thuật nuôi cấy TB V phát triiển • * Sự phát triển chung kỹ thuật công nghệ làm nuôi cấy mô quan tâm rộng rãi •