Bài Giảng Kĩ Thuật Nuôi Cấy Sơ Cấp Tế Bào Động Vật

Kĩ thuật ni cấy sơ cấp tế bào động vật Primary Cell Culture Ni cấy sơ cấp gì? Ni cấy sơ cấp q trình ni tế bào trực tiếp từ mơ trước lần cấy chuyền (subculture) Sau việc ni cấy gọi thứ cấp (secondary culture) Các kiểu ni cấy sơ cấp KIỂU 1: NI CẤY MƠ SƠ CẤP - Là việc ni cấy mảnh mơ in vitro Trong q trình ni cấy, tế bào từ mảnh mơ phát triển mọc lan từ vùng mơ trung tâm - Kĩ thuật ni cấy mơ thường tiến hành mẫu mơ có tế bào phát triển kém, số lượng mẫu lớn đơn giản KIỂU 2: NI CẤY SƠ CẤP HUYỀN PHÙ TẾ BÀO ĐƠN -Là việc ni cấy tế bào đơn tách từ mảnh mơ Trong q trình ni, tế bào phát triển tăng sinh thành nhiều tế bào - Kĩ thuật thường áp dụng cho ni cấy mảnh mơ với tế bào phát triển mạnh, số lượng mẫu lớn, nhiều giai đoạn Bước 1: Thu nhận mẫu xử lý sơ Thu nhận mẫu mơ Nguồn mẫu: từ quan, thể Quy trình: Thu nhận Làm Bảo quản, vận chuyển phòng thí nghiệm Xử lý sơ bộ: khử nhiễm, loại bỏ phần thừa, cắt nhỏ để chuẩn bị cho thao tác ni cấy Xử lý sơ mẫu mô bao gồm rửa nhiều lần dung dòch PBS có bổ sung kháng sinh (thường gentamicin hay penicillin streptomicin), kháng nấm (fungizone) Sau cắt bỏ phần mô chết, phần thừa (như mỡ…) Mẫu mô cần cắt nhỏ thành mảnh (2 - mm ) Các mảnh mơ sử dụng để nuôi (phát triển sơ cấp mảnh mơ – primary explant tissue culture), sử dụng để tách rời thành tế bào đơn sau Bước 2: Tách rời tế bào, xác định mật độ tế bào Tách tế bào học Cắt nhuyễn mơ: Sử dụng lực học bẻ gãy cầu nối liên bào Dùng kéo cắt nhuyễn mảnh mơ, sau huyền phù dung dịch PBS(-), thu hỗn hợp chứa tế bào đơn cụm tế bào Để lắng, thu dịch (đó huyền phù thu nhận tế bào đơn) Ép nhuyễn mơ:bằng hai phiến lame cách sử dụng để tách tế bào mơ có liên kết yếu (như mơ lách) Ngồi ra, sử dụng pittong syringe để ép mơ đĩa Petri, nhằm tách rời tế bào Tách màng lọc tế bào (Cell strainer): Màng lọc tế bào động vật thường có đường kính lỗ từ 70–100 µm, chế tạo để thu tếbào đơn Đường kính lỗ cho tế bào lọt qua, sử dụng chúng để làm cơng cụ tách rời tế bào hiệu Bước 3: NI CẤY NI CẤY MẢNH MƠ MẢNH MƠ DỤNG CỤ NI MƠI TRƯỜNG NI ĐIỀU KIỆN NI Đặt mảnh mơ vào dụng cụ ni có mơi trường ni Mảnh mơ Cố định mảnh mơ Cố định mảnh mơ nào? Sống Thành cơng Chết Thất bại PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH MẢNH MƠ PHƯƠNG PHÁP 1: Dùng lamel vơ trùng đè lên mảnh mơ PHƯƠNG PHÁP 2: Cố định mơ huyết Đĩa ni cấy Mảnh mơ Huyết PHƯƠNG PHÁP 3: Tăng kết dính & lật ngược bình ni Cho mảnh mơ tiếp xúc với huyết khoảng Đảo ngược bình ni qua đêm – Bổ sung mơi trường ni cấy ni bình thường PHƯƠNG PHÁP NI CẤY TẾ BÀO ĐƠN (1)Dùng pipetman hút vào eppendorf, ml dòch tách tế bào (2) Ly tâm 1000 vòng/ phút 10 phút, loại bỏ dòch (3) Cho vào eppendorf ml môi trường nuôi, huyền phù tế bào vortex (4) Hút dòch huyền phù tế bào eppendorf cho vào bình nuôi cấy (bình Roux) bổ sung 1-2 ml môi trường o (5) Ủ 37,5 C tủ nuôi, sau 24 thay môi trường tiếp tục ủ Sau lần nuôi cấy sơ cấp thu tế bào sơ cấp CẤY CHUYỀN (SUBCULTURE) Cấy chuyền bao gồm thao tác sau: - Tách bỏ môi trường nuôi cấy cũ - Rửa bề mặt giá thể nuôi (có tế bào bám) - Tách tế bào bám khỏi bề mặt dụng cụ nuôi - Pha loãng tế bào môi trường CẤY CHUYỀN TẾ BÀO BÁM DÍNH (1) Tách bỏ môi trường khỏi hộp nuôi (2) Rửa dụng cụ nuôi với PBS (5 ml/ bình Roux 25 cm2) (3) Bổ sung dung dòch trypsin (2–3 ml/ bình Roux 25 cm2) (4) Ủ tủ ấm 37 C (5) Khi tế bào có hình tròn lên bề mặt dung dòch, tiến hành huyền phù với môi trường có bổ sung huyết (5 ml/ bình Roux 25 cm2), rửa tế bào cách ly tâm 800 vòng/ phút 5–10 phút Tiếp theo, tái huyền phù môi trường nuôi (5 ml/ bình Roux 25 cm2) Bước bỏ tỷ lệ pha loãng cao (>1:50) môi trường có chứa huyết Tỷ lệ pha loãng đề nghò 1:4 CẤY CHUYỀN TẾ BÀO HUYỀN PHÙ Nuôi cấy tế bào flask hay spinner trì việc pha loãng lượng tương đương huyền phù tế bào môi trường tươi (1) Giữ flask đứng thẳng, dùng pipette huyền phù vài lần tách rời cụm tế bào (2) Hoặc tách lấy lượng huyền phù để đếm, chuyển 200 µl thành ml huyền phù vào bình nuôi chứa 10 ml môi trường phát triển Nếu tỷ số pha loãng 1/10, thể tích thích hợp huyền phù tế bào đặt vào ống ly tâm 15 ml, pha loãng thành 10 ml môi trường, sau ly tâm 900 vòng/ phút, vòng – phút Tái huyền phù cặn vón vào môi trường tươi lấy thể tích tương đương lượng tế bào mong muốn vào bình, tiến hành nuôi Hình ảnh minh họa Phân lập phơi chuột ni cấy tế bào Thu nhận phơi gà từ trứng