Bài giảng kỹ thuật nuôi cấy sơ cấp tế bào động vật

Kỹ thuật nuôi cấy sơ cấp tế bào động vật ThS Phan Lữ Chính Nhân Khái niệm Nuôi cấy sơ cấp (primary culture) trình nuôi tế bào trực tiếp từ mô trước lần cấy chuyền (subculture) Sau đó, việc nuôi cấy gọi thứ cấp (secondary culture) Hai kiểu nuôi cấy sơ cấp KIỂU 1: NUÔI CẤY MẢNH MÔ SƠ CẤP KIỂU 2: NUÔI CẤY SƠ CẤP TẾ BÀO ĐƠN Là việc nuôi cấy mảnh mô in vitro Trong trình nuôi cấy, tế bào từ mảnh mô phát triển lan từ vùng mô trung tâm Là việc nuôi cấy tế bào đơn tách từ mảnh mô Trong trình nuôi, tế bào phát triển tăng sinh thành nhiều tế bào NUÔI CẤY MẢNH MÔ SƠ CẤP (mảnh mô ung thư vú) Thu nhận tế bào đơn nhân tủy xương chuột Nuôi cấy chọn lọc tế bào Tua (DC) từ tủy xương chuột NUÔI CẤY SƠ CẤP HUYỀN PHÙ TẾ BÀO ĐƠN (thu từ máu cuống rốn) Quy trình nuôi cấy sơ cấp Thu nhận mẫu Xử lí mẫu Nuôi cấy tế bào đơn: Tách mô thành tế bào đơn Nuôi cấy mảnh mô: Cố định mảnh mô Nuôi cấy Thu nhận mẫu • Các mẫu thu nhận bao gồm mô sống thể • Trước hết phải làm mô vị trí lấy mẫu cồn, cho mô vào dung dịch PBS, nhanh chóng chuyển phòng thí nghiệm • Tùy loại mẫu mô thời gian cần thiết vận chuyển phòng thí nghiệm: có kế hoạch vận chuyển chúng điều kiện thích hợp Thu nhận dung dịch chứa tế bào đơn đem li tâm tốc độ 2500 vòng/phút Đổ bỏ hoàn toàn dịch phía trên, thu cặn đáy Facol chứa tế bào đơn Nuôi cấy sơ cấp tế bào thần kinh a) c) b) d) Nuôi cấy sơ cấp tế bào tủy Tế bào sơ cấp (nuôi tế bào rời) d2 d5 d4 d7 Tế bào sơ cấp (nuôi mảnh mô) d2 d7 d12 d21 d19 d15 Quy trình thu phân tách tế bào tủy xương người Quy trình thu phân tách tế bào tủy xương người Quy trình thu phân tách tế bào tủy xương người Quy trình thu phân tách tế bào tủy xương người Quy trình thu phân tách tế bào tủy xương người Quy trình thu phân tách tế bào tủy xương người Quy trình thu phân tách tế bào tủy xương người [...]... bình nuôi Nuôi cấy (1) Ly tâm thu tế bào đơn (2) Tái huyền phù trong môi trường nuôi (3) Cho vào bình nuôi cấy Sau khi cố định mảnh mô, bổ sung môi trường nuôi cấy (1)ủ trong tủ nuôi cấy, 370C (2) Thay môi trường mới sau một thời gian tùy loại tế bào Cấy chuyền • • • • Hút bỏ môi trường nuôi cấy cũ Rửa bề mặt giá thể nuôi (có tế bào bám dính) Tách các tế bào bám khỏi bề mặt dụng cụ nuôi Pha loãng các tế. .. chuyền tế bào huyền phù Nuôi cấy tế bào trong các flask nuôi cấy hay các spinner có thể được duy trì bằng cách pha loãng tương đương của huyền phù tế bào bằng môi trường tươi: (1) Giữ flask thẳng đứng, dùng pipette huyền phù vài lần để tách cụm các tế bào (2) Hoặc tách một lượng huyền phù để đếm, hoặc chuyển 200µl thành 1mL huyền phù vào bình nuôi chứa 10mL môi trường Spinner bioreactor Quy trình nuôi cấy. .. phút Thu dịch huyền phù tế bào, xác định mật độ, tiến hành nuôi Ủ trong 40C, 6- 18 giờ Loại bỏ trypsin Tách tế bào bằng phương pháp khác • Phương pháp ly tâm theo gradient tỉ trọng • Phương pháp tách tế bào dựa vào marker bề mặt Phương pháp ly tâm theo gradient tỉ trọng Phương pháp tách tế bào dựa vào marker bề mặt tế bào Xử lí mẫu đối với nuôi cấy mảnh mô Đặt mảnh mô vào dụng cụ nuôi Mảnh mô nổi Cố định... mẫu đối với nuôi cấy huyền phù tế bào đơn Các tế bào động vật trong khối mô liên kết chặt chẽ với nhau nhờ các cầu nối hình thành giữa các tế bào với nhau Biện pháp: – (1) tác dụng một lực cơ học để bẻ gãy những cầu nối – (2) dùng enzym để phân hủy các cầu nối nói trên Cắt nhuyễn Biện pháp cơ học Ép nhuyễn Tách bằng màng lọc Phương pháp cắt nhuyễn Sử dụng lục sơ học bẻ gãy các cầu nối liên bào: dùng... các tế bào bằng môi trường mới Cấy chuyền tế bào bám dính Loại bỏ môi trường khỏi bình nuôi Rửa bề mặt bình nuôi với PBS (free Ca2+ Mg2+) Bổ sung dung dịch trypsin/EDTA 0.25% (12ml/bình) Ủ trong tủ ấm 370C Khi tế bào co tròn, nổi lên tiến hành bổ sung một lượng môi trường có chứa huyết thanh Rửa loại bỏ trypsin bằng cách ly tâm 3000 vòng/phút Tái huyền phù và pha loãng theo tỉ lệ đề nghị là 1:4 Cấy chuyền... dịch trong Phương pháp ép nhuyễn Ép nhuyễn mô: dùng 2 phiến lame ép chặt mảnh mô để thu tế bào đơn đối với những mô có liên kết yếu Phương pháp tách bằng màng lọc Tách bằng màng lọc tế bào (Cell strainer): kích thước lỗ trên màng từ 70–100 µm, chỉ cho những tế bào đơn có kích thước tương ứng qua màng Tách mô thành tế bào đơn bằng enzym • Quy trình trypsin ấm • Quy trình trypsin lạnh Quy trình trypsin... vài lần để tách cụm các tế bào (2) Hoặc tách một lượng huyền phù để đếm, hoặc chuyển 200µl thành 1mL huyền phù vào bình nuôi chứa 10mL môi trường Spinner bioreactor Quy trình nuôi cấy sơ cấp tế bào ADSC Bước 1: Xử lí sơ bộ mẫu • Nếu mỡ hút, cho trực tiếp • Nếu dạng khối mỡ nguyên vào bình dạng phễu thì phải cắt nhuyễn rồi cho vào bình dạng phễu 100mL mỡ Bước 2: Rửa mẫu bằng WB1 (2 lần) • Thêm 50mL ... NUÔI CẤY MẢNH MÔ SƠ CẤP KIỂU 2: NUÔI CẤY SƠ CẤP TẾ BÀO ĐƠN Là việc nuôi cấy mảnh mô in vitro Trong trình nuôi cấy, tế bào từ mảnh mô phát triển lan từ vùng mô trung tâm Là việc nuôi cấy tế bào. .. chuột NUÔI CẤY SƠ CẤP HUYỀN PHÙ TẾ BÀO ĐƠN (thu từ máu cuống rốn) Quy trình nuôi cấy sơ cấp Thu nhận mẫu Xử lí mẫu Nuôi cấy tế bào đơn: Tách mô thành tế bào đơn Nuôi cấy mảnh mô: Cố định mảnh mô Nuôi. .. niệm Nuôi cấy sơ cấp (primary culture) trình nuôi tế bào trực tiếp từ mô trước lần cấy chuyền (subculture) Sau đó, việc nuôi cấy gọi thứ cấp (secondary culture) Hai kiểu nuôi cấy sơ cấp KIỂU 1: NUÔI