Kỹ Thuật Nuôi Cấy Sơ Cấp Tế Bào Động Vật

Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên Kỹ thuật nuôi cấy sơ cấp tế bào động vật Khái niệm Nuôi cấy sơ cấp (primary culture) trình nuôi tế bào trực tiếp từ mô trước lần cấy chuyền (subculture) Sau đó, việc nuôi cấy gọi thứ cấp (secondary culture) Hai kiểu nuôi cấy sơ cấp KIỂU 1: NUÔI CẤY MẢNH MÔ SƠ CẤP Là việc nuôi cấy mảnh mô in vitro Trong trình nuôi cấy, tế bào từ mảnh mô phát triển lan từ vùng mô trung tâm KIỂU 2: NUÔI CẤY SƠ CẤP HUYỀN PHÙ TẾ BÀO ĐƠN Là việc nuôi cấy tế bào đơn tách từ mảnh mô Trong trình nuôi, tế bào phát triển tăng sinh thành nhiều tế bào NUÔI CẤY MẢNH MÔ SƠ CẤP (mảnh mô ung thư vú) Thu nhận tế bào đơn nhân tủy xương chuột NUÔI CẤY SƠ CẤP HUYỀN PHÙ TẾ BÀO ĐƠN (thu từ máu cuống rốn) Quy trình nuôi cấy sơ cấp Thu nhận mẫu Xử lí mẫu Nuôi cấy tế bào đơn: Tách mô thành tế bào đơn Nuôi cấy Nuôi cấy mảnh mô: Cố định mảnh mô Thu nhận mẫu • Các mẫu thu nhận bao gồm mô sống thể • Trước hết phải làm mô vị trí lấy mẫu cồn, cho mô vào dung dịch PBS, nhanh chóng chuyển phòng thí nghiệm • Tùy loại mẫu mô thời gian cần thiết vận chuyển phòng thí nghiệm: có kế hoạch vận chuyển chúng điều kiện thích hợp Quy trình trypsin lạnh Cắt mẫu mô [2 – 3mm], rửa nhiều lần với PBS vô trùng Thêm môi trường, sục nhẹ nhành mô rời Nếu mảnh mô chưa rời thêm môi trường để dễ huyền phù dùng màng lọc Thay PBS trypsin 0.25% ủ ống chứa mẫu mô 36,50C, 20 – 30 phút Thu dịch huyền phù tế bào, xác định mật độ, tiến hành nuôi Ủ 40C, 6- 18 Loại bỏ trypsin Tách tế bào phương pháp khác • Phương pháp ly tâm theo gradient tỉ trọng • Phương pháp tách tế bào dựa vào marker bề mặt Phương pháp ly tâm theo gradient tỉ trọng • “Tế bào quan tâm tế bào a Tế bào nằm khối mô rắn với loại tế bào khác b, c d Các tế bào có tỉ trọng sau: a = 1,070 g/cm3, b = 1,077 g/cm3; c = 1,067 g/cm3, d = 1,080 g/cm3” • c = 1,067 g/cm3 > a = 1,070 g/cm3 > b = 1,077 g/cm3 > d = 1,080 g/cm3 Phương pháp tách tế bào dựa vào marker bề mặt tế bào Xử lí mẫu nuôi cấy mảnh mô Đặt mảnh mô vào dụng cụ nuôi Mảnh mô Cố định mảnh mô Mảnh mô sống Thành công Phương pháp cố định mảnh mô • Lammel • Huyết • Tăng kết dính lật ngược bình nuôi Nuôi cấy Cấy chuyền • Hút bỏ môi trường nuôi cấy cũ • Rửa bề mặt giá thể nuôi (có tế bào bám dính) • Tách tế bào bám khỏi bề mặt dụng cụ nuôi • Pha loãng tế bào môi trường Cấy chuyền tế bào bám dính Cấy chuyền tế bào huyền phù Nuôi cấy tế bào flask nuôi cấy hay spinner trì cách pha loãng tương đương huyền phù tế bào môi trường tươi: (1) Giữ flask thẳng đứng, dùng pipette huyền phù vài lần để tách cụm tế bào (2) Hoặc tách lượng huyền phù để đếm, chuyển 200µl thành 1mL huyền phù vào bình nuôi chứa 10mL môi trường Spinner bioreactor