Bài giảng Nuôi cấy tế bào động vật, kỹ thuật và ứng dụng: Bảo quản đông lạnh tế bào

Bài giảng Nuôi cấy tế bào động vật - Kỹ thuật và ứng dụng: Bảo quản đông lạnh tế bào trình bày khái niệm bảo quản đông lạnh; vai trò của bảo quản động lạnh; nguyên tắc trong bảo quản đông lạnh tế bào; quy trình bảo quản đông lạnh tế bào...

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TPHCM KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC VIỆN TẾ BÀO GỐC NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT: KĨ THUẬT VÀ ỨNG DỤNG BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO CRYOPRESERVATION Lê Thị Ngân Hà ltnha@hcmus.edu.vn TPHCM 03/2018 …"I want to live and live longer and I think that in the future they may find a cure for my cancer and wake me up," the 14-year-old wrote to a British judge before her recent death She said "being cryopreserved gives me a chance to be cured and woken up — even in hundreds of years' time.”… o Tái lưu thông máu o Thuốc hỗ trợ bảo vệ tế bào o Thay máu dịch lỏng thể chất chống đông o Giảm nhiệt với tốc độ 0,5/giờ đến nhiệt độ nito lỏng o Bảo quản tủ đơng hình trụ Lịch sử now 1987 Tạm dừng bảo quản trứng 1970s Phát triển nghiên cứu đông lạnh tinh trùng người 1959 Lovelock, Bishop: DMSO – red blood cell 1953 Sherman: đông lạnh tinh trùng người – rã đông 1949 Polge: glycerol – tinh trùng gà 1866 Mantagazza: ngân hàng tinh trùng cho tinh trùng người đông lạnh 1776 Spallanzani: tinh trùng người di chuyển gặp nhiệt độ thấp Bảo quản đơng lạnh gì? Bảo quản: quy trình sinh học nhằm đảm bảo •nh ổn định về mặt di truyền và cấu trúc nguyên vẹn củ a tế bào sống; đảm bảo thành phần nucleic acid và protein tế bào không thay đổi Bảo quản lạnh việc sử dụng nhiệt độ thấp để bảo vệ tế bào mơ sống cịn ngun vẹn thời gian dài Vì phải bảo quản đông lạnh tế bào? Thuận lợi bảo tồn gen Ngân hàng tế bào Giảm rủi ro nhiễm Tiết kiệm thời gian nguyên vật liệu Thuận lợi phân loại, tạo dòng Ngăn cản biệt hố / lão hố Dịng tế bào quý Thuận lợi vận chuyển Đáp ứng tế bào với stress đông lạnh Tác nhân stress Phản ứng tế bào Giảm nhiệt độ Biến đổi lớp màng lipid, khử polymer hoá xương tế bào Tăng nồng độ chất hoà tan Giảm áp suất thẩm thấu Tăng nồng độ ion Phản ứng trực tiếp màng bào gồm tính tan của màng protein Khử nước Mất ổn định lớp đôi phospholipid Kết tủa muối Không rõ Hình thành bọt khí Tổn thương học lên màng xương tế bào Thay đổi pH Biến tính protein Tế bào bị chèn xếp khít lại Tổn thương màng Tính nhớt mơi trường tăng Q trình khuếch tán/thẩm thấu bị hạn chế NGUYÊN TẮC Giảm thiểu hình thành tinh thể băng tế bào (1) Đông lạnh “chậm” (2) Sử dụng chất bảo quản đông lạnh (3) rữ tế bào mức nhiệt độ thấp để giảm thiểu tác động nồng độ muối cao lên biến đổi protein trong TB (4) tan băng nhanh chóng để giảm thiểu phát triển tinh thể băng (tái kết tinh) Nhiệt độ CPA Quy trình Tốc độ làm lạnh Yếu tố ảnh hưởng đến TB Tae Hoon Jang, Cryopreservation and its clinical applications, 2017 CHẤT BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH – CRYOPROTECTANTS AGENT CPA Là loại hố chất tan nước, có khả xâm nhập vào bên tế bào, sử dụng với mục đích giúp tế bào ngăn ngừa tổn thương tế bào đông lạnh Nguyên tắc: (1) Thay nước tế bào giảm hình thành tinh thể đá nội bào giảm tổn thương tinh thể đá gây (2) Hạn chế tăng nồng độ chất hoà tan nội bào (3) Kết lên màng bào tương bảo vệ tế bào Hoạt động: “khử nước” q trình đơng lạnh, “bù nước” q trình giải đơng VD: DMSO, glycerol, glycols, vài amino acid (proline), … Permeating Non-permeating Sucrose, dextran Ảnh hưởng CPA lên Tế bào Nồng độ? QUY TRÌNH BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO CHUẨN BỊ TẾ BÀO BỔ SUNG CHẤT BẢO QUẢN LÀM LẠNH LƯU TRỮ GIẢI ĐÔNG - PHỤC HỒI NI TĂNG SINH CHUẨN BỊ Thiết bị Kính hiển vi đảo ngược • Tủ thao tác an tồn sinh h ọc cấp II • Máy ly tâm • Tủ ủ nuôi tế bào (370C, 5% CO2) • Tủ mát 2-80C • Tủ âm 00C đến -200C • Bình chứa nito lỏng Bể ổn nhiệt Dụng cụ – hoá chất Dụng cụ nuôI cấy tế bào phù hợp Trypsin/EDTA 0,25% PBS không Ca2+ và Mg 2+ (PBS-) Môi trường đông lạnh tế bào Ống bảo quản đông lạnh (cryovial) 1,5-2 ml Ống ly tâm 15ml hoặc 50 ml vô trùng Môi trường giải đơng CHUẨN BỊ CHUẨN BỊ TẾ BÀO ü Tình trạng tế bào: pha log ü Số lượng tế bào? ü Nhiễm? ü Xác định tỷ lệ tế bào sống chết ü Dán nhãn cryotube BỔ SUNG CHẤT BẢO QUẢN Thành phần môi trường đông lạnh tế bào: ✓ môi trường cơ bản: RPMI, DMEM/F12, IMDM… ✓ huyết thanh thai bò (FBS): 40-50% ✓ CPA: dimethylsulphoxide (DMSO): 5-10% LÀM LẠNH Đông lạnh chậm Đông lạnh theo chương trình, giảm nhiệt theo set up trên máy Đơng lạnh nhanh bước -20 -80 -196 Đông lạnh cực nhanh Đông lạnh insitu Chuyển TB Đông lạnh trực tiếp tế bào vào -196 giữ trạng thái tăng sinh lúc nuôi cấy LƯU TRỮ Thời gian lưu trữ: Bất kỳ gián đoạn thời gian trữ đông ảnh hưởng đến khả sống Tb sau giải đông Nhiệt độ lưu trữ: Nhiệt độ Thời gian 4 độ Vài -20 độ Vài ngày -80 độ Vài tháng -196 độ Vài kỷ GIẢI ĐÔNG - PHỤC HỒI Thao tác? NUÔI TĂNG SINH MTGĐ: môi trường (RPMI, DMEM/F12, IMDM ) bổ sung 2030% huyết thai bò (FBS), 1% kháng sinh-kháng nấm Kiểm tra sống/chết + MTGĐ Ly tâm 5p Tốc độ thấp Thu cặn TB ... Sucrose, dextran Ảnh hưởng CPA lên Tế bào Nồng độ? QUY TRÌNH BẢO QUẢN ĐƠNG LẠNH TẾ BÀO CHUẨN BỊ TẾ BÀO BỔ SUNG CHẤT BẢO QUẢN LÀM LẠNH LƯU TRỮ GIẢI ĐÔNG - PHỤC HỒI NUÔI TĂNG SINH CHUẨN BỊ Thiết bị... LÀM LẠNH Đơng lạnh chậm Đơng lạnh theo chương trình, giảm nhiệt theo set up trên máy Đông lạnh nhanh bước -20 -80 -196 Đông lạnh cực nhanh Đông lạnh insitu Chuyển TB Đông lạnh trực tiếp tế bào vào... đông lạnh tế bào Ống bảo quản đông lạnh (cryovial) 1,5-2 ml Ống ly tâm 15ml hoặc 50 ml vô trùng Môi trường giải đông CHUẨN BỊ CHUẨN BỊ TẾ BÀO ü Tình trạng tế bào: pha log ü Số lượng tế bào?