báo cáo thực tập chuyên ngành cnsh y dược phần, nuôi cấy tế bào động vật phần, thụ tinh trong ống nghiệm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO THỰC TẬP CHUYÊN NGÀNH CNSH Y DƯỢC PHẦN 1: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT PHẦN 2: THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM PHẦN 1: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT ĐẶT VẤN ĐỀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP KẾT QUẢ - GIẢI THÍCH KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ I ĐẶT VẤN ĐỀ Mô hình thử nghiệm chẩn đốn bệnh Tạo quan Nuôi cấy tế bào động vật Sản xuất hợp chất sinh học Nguyên liệu cấy ghép Sản xuất virus diệt côn trùng Thành thạo thao tác tế bào trước thực thí nghiệm chuyên sâu II TỔNG QUAN TÀI LIỆU Ni cấy tế bào • Ni cấy tế bào q trình mà tế bào ni điều kiện có kiểm sốt về:  pH  Nhiệt độ  Áp suất thẩm thấu  Chất khí  Chất dinh dưỡng • Điều kiện ni cấy khác cho loại tế bào  Tạo hai dòng tế bào mong muốn II TỔNG QUAN TÀI LIỆU Nuôi cấy sơ cấp - Sử dụng tế bào sau tách từ mảnh mô trước lần cấy chuyền - Thu nhận mảnh sinh phẩm, mô sống  loại bỏ thành phần không mong muốn thành phần gây hại cho mô  tách để tạo huyền phù tế bào đơn trước nuôi cấy  Nuôi cấy sơ cấp thường sử dụng để khai thác tế bào ban đầu mảnh mô, nhằm tạo dòng tế bào II TỔNG QUAN TÀI LIỆU Cấy chuyền nuôi cấy thứ cấp • Cấy chuyền cung cấp chất dinh dưỡng không gian cho dòng tế bào phát triển liên tục • Tần số (độ thường xuyên cấy chuyền) tỉ lệ pha loãng, hay nồng độ tế bào phụ thuộc vào đặc tính dịng Nếu dịng cấy chuyền thường xuyên hay nồng độ tế bào thấp, chúng bị • Ni cấy thứ cấp tính từ sau lần cấy chuyền từ nuôi cấy sơ cấp II TỔNG QUAN TÀI LIỆU Đông lạnh giải đông tế bào Đông lạnh Giữ tế bào trạng thái ngủ (Lưu trữ tế bào sống thời gian dài) Cần chất bảo quản đông lạnh (DMSO, glycerol, PEG, ) Giải đông Đưa tế bào trạng thái sinh lý bình thường (Hoạt hóa tế bào) Cần mơi trường dinh dưỡng Đơng lạnh chậm: 40C  (-20) 0C  (-80) 0C  (196) 0C Giải đông nhanh (370C) Hạn chế nhiễm Lưu trữ tế bào phục vụ mục đích nghiên cứu Tiết kiệm môi trường nuôi cấy III VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP  Vật liệu: 1.1 Mẫu vật: Chuột nhắt trắng Swiss Albino, 6-8 tuần tuổi, nặng 18-22g, cung cấp Viện Pasteur TP HCM 1.2 Hóa chất:  Cồn 70o  Dung dịch PBS (kháng sinh 5X, 2X 1X)  Trypsin/EDTA 0,25%/1%  Môi trường DMEM/F12 FBS 10% 1.3 Dụng cụ:  Erlen 250ml, 50ml; becher 50ml  Kẹp thẳng, kẹp cong; kéo thẳng, kéo cong  Đĩa petri đường kính 9-10cm  Ống ly tâm loại 15ml  Buồng đếm hồng cầu, lamelle  Đầu tip 1ml, 0.1ml; micropipette  Bình Flask 25cm2  Khay rác  Kim tiêm 1ml III VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP Phương pháp: + Thu nhận xương đùi xương cẳng chân chuột + Thu nhận quần thể tế bào tủy xương + Xác nhận tỷ lệ sống chết tế bào + Thay môi trường cấy chuyền + Đông lạnh – Giải đông SƠ ĐỒ THỰC NGHIỆM Tế bào tủy xương chuột Nuôi cấy sơ cấp Thay môi trường Tế bào MCF7 Cấy chuyền Đông lạnh Giải đơng 10 PHƯƠNG PHÁP KÉO PIPETTE PASTEUR • Dài khoảng – cm • Thao tác: góc kéo khoảng 135 độ, vừa đưa kim vừa kéo ₋ Kim đầu to: kéo chậm hơn, nhẹ hơn, đoạn hơ lửa dài ₋ Kim đầu nhỏ: kéo nhanh hơn, mạnh hơn, đoạn hơ lửa ngắn Pipette Pasteur 23 PHƯƠNG PHÁP CHỌN GIAO TỬ • Chọn tinh trùng: ₋ Khỏe mạnh ₋ Di động tốt ₋ Mật độ tối ưu khoảng – 2,5 x 106 tt/ml • Chọn trứng: ₋ Trưởng thành (nhìn thấy thể cực thứ nhất) ₋ Còn màng tế bào, tế bào chất mịn Trứng người trưởng thành 24 THU TRỨNG Gây mê Cố định chuột Sát trùng Cạo lông chuột Thu phần tử cung, ống dẫn trứng, buồng trứng vào Eppendorf Tìm tử cung Mổ ổ bụng chuột Sát trùng Xác định đoạn bóng Xé màng ống dẫn trứng vị trí đoạn bóng Thu nhận cụm trứng Rửa phận hai lần PBS THU TINH Giết chuột (kéo giãn đốt sống cổ) Thu nhận mào tinh ống dẫn tinh Đặt lên tờ giấy thấm (đã hấp khử trùng) Tách mỡ Swim-up tủ ấm 37oC, 5% CO2, 30 phút, đặt nghiêng 45o Cho vào eppendorf có mơi trường SWM Dùng đầu kim thu giọt tinh dịch Hút 10ul dịch (đếm mật độ) Hút dịch trong, ly tâm 800 rpm, phút Hút bỏ dịch Hòa cặn vào FertiMed Dồn tinh dịch (từ ống dẫn tinh) Dùng kim tiêm đâm vào đầu mào tinh Mật độ tối ưu: 2.5 x 106 tt/ml KẾT QUẢ - GIẢI THÍCH THU TRỨNG Thu trứng, trình thao tác chuyển trứng làm trứng, nên lại trứng Đánh giá chất lượng trứng: Cả trứng bị màng: tế bào chất không mịn, cấu trúc bên co cụm lại với nhau, không phân bố 27 THU TINH • • • • • TỔNG: 68 tinh trùng DI ĐỘNG: 31 tinh trùng % DI ĐỘNG: 45.6% MẬT ĐỘ: 1.36 X 106 (tt/ml) TỔNG SỐ TTTRONG 300l : 4.08 x 105 tt  Để đạt mật độ 2.5 x 106 tt/ml  Cần thêm 163 l FertiMed Đánh giá chất lượng tinh trùng: • Độ di động cao • Tuy nhiên mật độ ban đầu thấp lúc thao tác thu tinh, chưa thu hết tinh dịch 2 2 di động đứng yên di động đứng yên di động đứng yên di động đứng yên di động đứng yên động 10 di động đứng yên đứng yên đứng yên 3 di động di động di động di động 1 đứng yên di động đứng yên di động đứng yên đứng yên đứng yên di động đứng yên di động đứng yên đứng yên KẾT QUẢ ĐẾM MẬT ĐỘ TINH TRÙNG THỤ TINH TRONG VI GIỌT THỤ TINH (MỚI CHUYỂN TINH TRÙNG VÀO) Hình 1: Hình ảnh thụ tinh vi giọt thụ tinh trứng 29 KẾT QUẢ SAU KHI THỤ TINH GIỜ Hình 2: Hình ảnh thụ tinh vi giọt thụ tinh trứng sau trứng sau thụ tinh chết (mất màng, tế bào chất tràn ra) 30 KẾT QUẢ THỤ TINH SAU 1,5 NGÀY ĐÁNH GIÁ SỐNG CHẾT DỰA VÀO HÌNH THÁI: Hình 3: Hình ảnh thụ tinh vi giọt thụ tinh trứng sau 1,5 ngày Sau thụ tinh 1,5 ngày, trứng chết (cấu trúc bên co lại, màng, 31 tế bào chất tràn ra) ĐÁNH GIÁ SỐNG CHẾT BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HUỲNH QUANG Hình 4: Hình ảnh thụ tinh vi giọt thụ tinh trứng sau 1,5 ngày theo thứ tự hình không nhuộm, nhuộm Hoeschst, nhuộm Propidium iodide (PI) Nhuộm Hoechst sáng nhuộm PI khơng sáng  tế bào cịn sống Tuy nhiên, kết hợp với kết đánh giá hình thái khơng thể kết luận tế bào cịn sống, xảy sai sót trình nhuộm  Trứng chết 32 ĐÁNH GIÁ SỐNG CHẾT BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HUỲNH QUANG Hình 5: Hình ảnh thụ tinh vi giọt thụ tinh trứng sau 1,5 ngày theo thứ tự hình không nhuộm, nhuộm Hoeschst, nhuộm Propidium iodide (PI) Nhuộm Hoechst sáng nhuộm PI sáng  tế bào chết Kết hợp với kết đánh giá hình thái  Trứng chết 33 ĐÁNH GIÁ SỐNG CHẾT BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HUỲNH QUANG Hình 6: Hình ảnh thụ tinh vi giọt thụ tinh trứng sau 1,5 ngày theo thứ tự hình khơng nhuộm, nhuộm Hoeschst, nhuộm Propidium iodide (PI) Nhuộm Hoechst sáng nhuộm PI sáng  tế bào chết Kết hợp với đánh giá hình thái  Trứng chết 34 MỘT SỐ LƯU Ý - Trứng dễ chết  thao tác nhanh Thu trứng rụng vào ống dẫn trứng (buồng trứng có bề mặt bị chảy máu lành lại) Trứng cịn túi mầm (màng nhân) trứng chưa chín  không thu Trứng bị vỡ, màng: tế bào chất khơng mịn, tràn ngồi, cấu trúc bên co cụm lại, khơng Có thể đánh giá trứng dựa vào hình thái: trứng co lại  màng  chết Đánh giá trứng dựa vào giai đoạn: sau ngày mà chưa phân chia  chết Kính hiển vi phải có gắn kính ổn nhiệt thao tác với trứng trứng nhạy nhiệt Đoạn bóng: khối nhiều trứng tập trung lại làm cho ống phình to, (do trứng chuột màu trắng) Trước chuyển trứng sang mơi trường phải rửa trứng với mơi trường lần Trứng có lớp tế bào cumulus thường có tỉ lệ thụ tinh cao hơn, giúp tinh trùng dễ chui vào trứng Thu tinh trùng mào tinh ống dẫn tinh 35 Tinh trùng chuột: đuôi dài, đầu móc KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ Kết luận: - Gây siêu nỗn thu thành cơng tế bào trứng tinh trùng - Nắm thao tác kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm (IVF) - Thụ tinh chưa thành công chất lượng trứng thao tác chưa thành thạo Kiến nghị: - Đánh giá chất lượng trứng hình thái trước thụ tinh - IVF kỹ thuật khó cần nhiều thời gian học thêm để thao tác thành thạo 36 THANK YOU 37 ... huyền phù tế bào đơn trước nuôi c? ?y  Nuôi c? ?y sơ cấp thường sử dụng để khai thác tế bào ban đầu mảnh mô, nhằm tạo dòng tế bào II TỔNG QUAN TÀI LIỆU C? ?y chuyền nuôi c? ?y thứ cấp • C? ?y chuyền cung... giá tế bào nuôi c? ?y  Kiến nghị Nuôi c? ?y tế bào động vật kỹ thuật khó cần nhiều thời gian thực tập để thao tác thành thạo 17 PHẦN 2: THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM NGUYÊN TẮC CỦA PHƯƠNG PHÁP - G? ?Y SIÊU... đứng y? ?n đứng y? ?n đứng y? ?n 3 di động di động di động di động 1 đứng y? ?n di động đứng y? ?n di động đứng y? ?n đứng y? ?n đứng y? ?n di động đứng y? ?n di động đứng y? ?n đứng y? ?n KẾT QUẢ ĐẾM MẬT ĐỘ TINH