báo cáo thực tập chuyên ngành công nghệ sinh học y dược

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐHQG TPHCMKHOA SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC TẬP CHUYÊN NGÀNH CNSH Y DƯỢC

GVHD: Các giáo viên của PTN NC&ƯD Tế Bào Gốc

Phần 1

NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Tế bào là đơn vị cấu tạo cơ bản của sự sống Là nơi diễn ra hầu hết các hoạt động cần thiết của sự sống.

Nuôi cấy tế bào là kỹ thuật cơ bản hỗ trợ đắc lực nhất cho những nghiên cứu về tế bào.

Nuôi cấy tế bào động vật bao gồm các nội dung chính sau:

1.Nuôi cấy sơ cấp tế bào từ tủy xương chuột

2 Cấy chuyền và nuôi thứ cấp tế bào tủy xương chuột

3 Đông lạnh và bảo quản tế bào động vật (hUCB – MSC)4 Giải đông và hoạt hóa tế bào động vật

II TỔNG QUAN

1 Nuôi cấy sơ cấp

Nuôi cấy sơ cấp sẽ thu nhận một hỗn hợp các dòng tế bào khác nhau trong đó có những tế bào quan tâm.

II TỔNG QUAN

2 Cấy truyền và nuôi cấy thứ cấp

• Cấy chuyền nhằm cung cấp không gian mới, chất dinh dưỡng mới.• Cấy chuyền được thực hiện khi tế bào chiếm khoảng 80 -90% bề mặt

- Tách các tế bào bám khỏi bề mặt nuôi (bằng trypsin/ que cào).- Pha loãng các tế bào bằng môi trường mới

 Làm ngừng quá trình phân chia và hoạt động trao đổi chất

II TỔNG QUAN

4 Giải đông tế bào

• Khôi phục lại trạng thái hoạt động, đặc điểm, tính chất của tế bào.• Sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

III VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

- Môi trường DMEM/F12 FBS 10%

1.3 Dụng cụ

- Erlen 250ml, erlen 50ml- Becher 50ml

- Kẹp cong, kẹp thẳng- Kéo thẳng, kéo cong

- Đĩa petri đường kính 9- 10cm

- Buồng đếm hồng cầu, Lamelle- Đầu tip 1ml, đầu tip 0,1ml

- Micropipette

- Bình Flask 25cm2

- Khay rác

III VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

2 Phương pháp

2.1 Nuôi cấy thứ cấp

Xương đùi sau của chuột

- Cắt bỏ hai đầu xương

- Bơm môi trường (DMEM/F12 FBS 10%) để dội rửa tuỷ xương

Mẫu mô đã xử lý

Dịch tuỷ xương

- Phẫu tích

- PBS + kháng sinh 5x, 1x- Rửa sạch mô bằng PBS

- Loại bỏ mẫu cơ, mỡ,… khỏi xươngMẫu mô

Tủ an toàn sinh học

Tủ nuôi (37◦C, 5% CO2)

Rửa bề mặt giá nuôi

112.3 Đông lạnh tế bào

TB máu cuống rốn đã nuôi cấy

31ml Trypsin1

370C,5%CO2, 1 min

5 DMEM/F12 FBS

DMEM/F12 FBS(1) Loại mt cũ

(2) Rửa bề mặt giá nuôi(3) Tách tb

(4) Ủ

(5) Loại bỏ trypsin(6) Ly tâm

(7) Bỏ dịch nổi, bổ sung mt đông lạnh(8) Đông lạnh 3 bước

840C, 30m

-200C,1h-80C

2.4 Giải đông tế bào

Ủ 370C

1mlDd giải đông

500rpm5 min

(1)Đặt vào bình ổn nhiệt(2)Bổ sung dd giải đông(3)Ly tâm

(4)Bỏ dịch nổi, bổ sung mt mới(5)Chụp hình và đếm mật độ tb

1.Nuôi cấy sơ cấp

Các tế bào trong tủy xương sau khi thu được là một tập hợp gồm nhiều loại tế bào.

IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Loại tế bào

Mật độ so với quần

thể tế bào Hình dạng Kích thước Dự đoán loại tế bào

lõm trung tâm

10- 15μm Nhóm bạch cầu,tế bào gốc tạo máu, nhóm tiền thân bạch cầu, tế bào gốc trung mô

đều, nhìn thấy nhân bên trong

tiểu cầu

●Phân tích mật độ tế bào sau khi thu

Tổngsốtếbào :

Z= (1)+(2)+(3)+(4)+(5)= 154 tếbào

Số tế bào trung bình:

a== 30 tế bàoMật độ tế bào:

A=ax104xđộ phaloãng=30x104x20=6x106(tế bào/ml)

2 Cấy chuyền và nuôi cấy thứ cấp

- Màu sắc môi trường: màu cam => Tế bào phát triển bình thường.- Không bị nhiễm.

- Tế bào phần lớn đông nhất về hình dạng.- Mật độ tế bào khoảng 70 – 80%

Hình a: Bình cũHình b: Bình mới

Sau khi đã cấy chuyền

TB tròn đều  TB sốngTB không tròn

đều, bị móp méo  TB chết

2.3 Giải đông tế bào động vật

Hình ảnh đánh giá trực quan dưới kính hiển vi

Kết quả đếm tế bào bằng buồng đếm sau khi giải đông

Hiệu suất giải đông

𝑍 =1+2+3+4+5

ZdeathH

Phần 2

THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

• Lọc dầu khoáng

Một số thao tác cơ bản cần lưu ý

• Kéo pipette Pasteur

• Tạo các vi giọt trong dầu khoáng• Gây mê chuột

Lọc dầu khoáng

Kéo pipette Pasteur

Tạo các vi giọt

Loại đĩaThể tích

Đĩa tập4 giọt 50 µl PBSLoại cumulus3 giọt 50 µl Fertimed 1 giọt 10 µl Fertimed

Thụ tinh2 giọt 10+ 40 µl Fertimed2 giọt 10 µl FertimedNuôi phôi4 giọt 10 +40 µl Embryo

Gây mê chuột

Chuột cái được tiêm thuốc mê vào cơ bắp chân

Chuột đực được làm chết bằng kéo giãn đốt sống cổ.

Thu nhận tinh trùng (tt)

Swim up

Nhuộm và đánh giá tinh trùng

Kết quả

• Tổng số tinh trùng (đếm trên 25 ô)

• Tỉ lệ sống/chết : không tìm thấy tinh trùng chết

trong khu vực đếmN =

= )

• Độ di động :13

88 × 100 %=14,77 %

Thu nhận trứng

Chuột

ống dẫn trứngGây siêu bào noãn

Tiêm hormone

Thu nhận trứng

Buồng trứngPhức hợp OOCs

Đoạn bóngOOCs - oocyte - cumullus

Thụ tinh - Nuôi Phôi

10+40 µl Embryo

Trứng sau khi tiến hành thụ tinh

Kết quả thụ tinh sau 42h

Phôi sau khi nhuộm và rửa

Kết quả nhuộm Hoechst

Kết quả nhuộm PI

Kết luận

do sinh lý sinh sản chuột đực hoặc quá trình swim up và đánh giá tinh trùng chưa chính xác.

có cumulus bao quanh

đực yếu)

hyaluronidase, thao tác chậm, dẫn đến enzyme tác dụng quá lâu nên lúc thụ tinh trứng đã hoàn toàn bị mất lớp cumulus, ngăn cản ở phản ứng cực đầu của tinh trùng và trứng.

Những điểm cần lưu ý

không trứng sẽ bị phân cắt bởi enzyme này và phải rửa lại bằng Fertimed ngay nếu không lượng enzyme tồn dư sẽ gây độc cho trứng.

hoặc co cụm lại dẫn đến đếm sai.

nếu không sẽ bị nhiễm và tránh lấy phải mỡ, vì rất khó loại bỏ.

phải chừa 1- 2cm để chuột không cắn đứt chỉ.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Giáo trình thực tập chuyên ngành CNSH Y Dược (phần Động vật)_ 2016, PTN NC & UD Tế bào gốc.

2 VBN nuôi cấy tế bào động vật, Ths Nguyễn Bích Ngọc.3 Máu và bạch huyết, Dr Vo Van Toan, Quy Nhơn University.

Wish you all of best things in your life today and always !