NUÔI cấy tế bào ĐỘNG vật IVF

TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO THỰC TẬP CHUYÊN NGÀNH CNSH Y DƯỢC PHẦN MỤC TIÊU NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT MỤC TIÊU VÀ CƠ SỞ LÝ THUYẾT NỘI DUNG THỰC HIỆN • Phân lập dịng tế bào gốc trung mô từ tuỷ xương chuột CƠ SỞ LÝ THUYẾT • Tuỷ xương chuột có chứa nhiều loại tế bào, có loại chính: tế bào gốc trung mô, tế bào gốc tạo máu tế bào máu trưởng thành Trong loại tế bào đó, có tế bào gốc trung mơ có khả bám bề mặt nuôi cấy Dựa đặc điểm đó, phân tách dịng tế bào gốc trung mô khỏi hỗn hợp tế bào tuỷ xương chuột PHẦN NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT NỘI DUNG THỰC HIỆN Nuôi cấy sơ cấp (Mục tiêu: loại bỏ tế bào không mong muốn) Thay môi trường (Mục tiêu: Tạo điều kiện tốt cho tế bào tăng trưởng) Nuôi cấy thứ cấp (Mục tiêu: Tăng sinh lượng lớn tế bào) Đông lạnh (Mục tiêu: Bảo quản tế bào chưa cần sử dụng) Giải đông (Mục tiêu: Hoạt hoá lại tế bào sau bảo quản) PHẦN NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG DUNG DỊCH ĐỆM PBS • Vệ sinh erlen bình chứa, tráng nước cất lần • Chứa 800-900ml mước cất lần erlen, đặt lên khoấy từ • Cân chất theo thứ tự: NaCl : 8,035g, Na2HPO4 : 2,9461g, KCL : 0,2132g, KH2PO4 : 0,2064g • Cho dd pha vào ống đong, cho nước cất đủ 1L • Cho vào bình chứa, hấp khử trùng NI CẤY SƠ CẤP TĨM TẮT Chuột Ni 370c, 5% CO2 Thu đùi Falcon dd 5X Huyền phù Epp giọt Thu tuỷ xương vào becher (kim tiêm + 3ml FBS) Pha loãng + 10 microL Trypan Blue - Trong phòng giết chuột (thao tác vơ trùng) - Trong tủ an tồn sinh học (thao tác vô trùng) Falcon dd 2X - Đĩa petri dd 1X - Loại bỏ mô thịt Thu xương đùi cẳng chân Buồng đếm NUÔI CẤY SƠ CẤP QUÁ TRÌNH THU HỖN HỢP TẾ BÀO TỪ TUỶ XƯƠNG CHUỘT NI CẤY SƠ CẤP KẾT QUẢ ĐẾM TẾ BÀO • Pha lỗng: (đơn vị µl) 10 dd từ epp + 90 PBS Thu 10 30 PBS 10 Trypan Blue Thu 10 Thu 10 vào buồng NUÔI CẤY SƠ CẤP KẾT QUẢ ĐẾM TẾ BÀO Vì nhóm thu tuỷ xương chuột từ đùi, số lượng tế bào dày đặc, cần pha loãng 40 lần để thực đếm tế bào Số lượng Ô 1tế bào Ô đếm Ơ 3như sau: Ơ4 Ơ5 37 31 35 39 24 => Trung bình cho đếm: 33 tế bào Áp dụng cơng thức tính mật độ tế bào ta có: N = A x Hệ số pha loãng x 104 = 33 x 40 x 104 = 13.2 x 106 tế bào/ml (Với N: mật độ tế bào, A trung bình tế bào ô) Tế bào tiểu cầu Tế bào hồng cầu IVF QUÁ TRÌNH SWIM UP VÀ LỰA CHỌN TINH TRÙNG Tinh trùng thu từ ống dẫn tinh cho vào dung dịch swim up Theo nguyên tắc, tinh trùng ln bơi hướng lên, sau swim up thu lượng tinh trùng tốt lớp Tinh trùng sau swim up, ly tâm hoà vào FertiMed, hút 50µl để đếm tinh trùng IVF MẬT ĐỘ TINH TRÙNG •  Tổng số tinh trùng đếm được: 234 Số tinh trùng di động: Số tinh trùng chết: Tỷ lệ sống tinh trùng: 99.98% Đếm 25 ô Mật độ tinh trùng: = 4,8 x 106 (tinh trùng/ml) Với N: mật độ tinh trùng, n: số tinh trùng đếm c ô lớn, c: số ô lớn đếm, d: độ pha lỗng Số tinh trùng di động ít, nguyên nhân sau: - Quá trình hút nhả tinh trùng mạnh, làm cho tinh trùng bị yếu - Q trình swim up nhóm khơng đặt nghiêng 450, ảnh hưởng tới sức sống tinh trùng IVF CHUẨN HỐ MẬT ĐỘ TINH TRÙNG • Mật   độ tinh trùng cần chuẩn hoá để đảm bảo thụ tinh tốt nhất: 2.5 x 106 tinh trùng/ml Mật độ tinh trùng có: 4.6 x 10 tinh trùng/ml Thể tích dịch tinh trùng có: 380 µl  Thể tích cần thêm vào để chuẩn hố mật độ: IVF CHUẨN BỊ PIPETTE PASTEUR Hơ pipette lửa kéo nhanh, xiên góc khoảng 45 độ Tạo ống nhỏ, hẹp đủ kích thước tế bào, dài từ 23cm (quá dài dễ gãy thao tác) Dùng đá mài làm nhẵn vị trí bẻ ngắn ống IVF QUÁ TRÌNH THU TRỨNG HÌNH ẢNH BUỒNG TRỨNG THU ĐƯỢC Giao tử cái: Chọn trứng trịn đều, khơng vỡ, có cumulus bao quanh, trứng cực rõ ràng IVF QUÁ TRÌNH THU TRỨNG HÌNH ẢNH TÁCH TRỨNG TỪ BUỒNG TRỨNG IVF TINH TRÙNG VÀ TRỨNG TRONG VI GIỌT THỤ TINH TRỨN G TINH TRÙNG IVF KẾT THÚC QUÁ TRÌNH THỤ TINH HÌNH ẢNH TRỨNG BỊ PHÂN MẢNH KHI THỤ TINH KHÔNG THÀNH CÔNG IVF NHUỘM TẾ BÀO XÁC ĐỊNH SỐNG/CHẾT HÌNH ẢNH NHUỘM HOECHST Hoechst chất nhuộm vào tế bào theo chế thẩm thấu, có khả nhuộm tất tế bào dù sống hay chết Hoechst cho màu xanh chiếu ánh sáng huỳnh quang IVF NHUỘM TẾ BÀO XÁC ĐỊNH SỐNG/CHẾT PI có khả liên kết với DNA cách chèn vào base Nhìn vào hình bên cạnh, ta thấy tế bào bị nhuộm PI, chứng tỏ thụ tinh không thành công Đồng thời, khơng màu tồn tế bào, cho thấy nhân tế bào bị phân mảnh HÌNH ẢNH NHUỘM PI PI chất nhuộm dùng để nhận diện tế bào chết PI có kích thước phân tử lớn, khoảng 668,4 Da, khơng thể dễ dàng qua màng tế bào Đối với tế bào sống, có chế ngăn chặn chất lạ vào màng tế bào, giúp phân biệt tế bào sống chết IVF CHUỘT SAU KHI PHẪU THUẬT THỰC TẬP CHUYÊN NGÀNH KẾT LUẬN NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT - Thu tế bào tuỷ xương chuột - Thực thao tác: nuôi cấy sơ cấp, thứ cấp, bảo quản giải đông IVF - Thu tinh trùng trứng tốt - Trứng tinh trùng có khả thụ tinh trình thụ tinh khơng thành cơng THỰC TẬP CHUN NGÀNH ĐỀ XUẤT CHUNG Mong thầy cô báo trước cho sinh viên thời gian thực tập chuyên ngành lúc với Văn phịng khoa để sinh viên có chủ động xếp thời gian học môn khác Do lịch VP khoa gửi về, tụi em báo học thực tập chuyên ngành vào thời gian – 12/12/2016, đăng ký mơn học khác kết thúc sớm để tránh trùng thực tập để đảm bảo tiêu chí loại mơn học tốt nghiệp, nhiên lịch trùng tụi em phải nghỉ nhiều buổi học khác Cảm ơn thầy cô Thank You for your attention! 40 ... NI CẤY SƠ CẤP DỰ ĐỐN TẾ BÀO Kích thước tế bào (Đường kính tế bào) Hình dạng tế bào Số lượng tế bào( vi trường) Dự đốn loại tế bào Trung bình khoảng 7,5-7,8 µm Hình cầu, đĩa lõm bề mặt tế bào. .. màng tế bào Đối với tế bào sống, có chế ngăn chặn chất lạ vào màng tế bào, giúp phân biệt tế bào sống chết IVF CHUỘT SAU KHI PHẪU THUẬT THỰC TẬP CHUYÊN NGÀNH KẾT LUẬN NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT... hợp tế bào tuỷ xương chuột PHẦN NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT NỘI DUNG THỰC HIỆN Nuôi cấy sơ cấp (Mục tiêu: loại bỏ tế bào không mong muốn) Thay môi trường (Mục tiêu: Tạo điều kiện tốt cho tế bào