nuôi cấy tế bào động vật thụ tinh trong ống nghiệm ( in vitro fertilization IVF)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN – ĐHQG TP.HCM KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO THỰC TẬP CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC PHẦN NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT I TỔNG QUAN  Cơ sở lí thuyết: Máu tủy xương có ba loại tế bào chính: tế bào gốc tạo máu(MSC),tế bào máu trưởng thành MSC Trong nuôi cấy, MSC bám dính vào bề mặt (giá thể) ni cấy, tế bào cịn lại khơng có khả  Đặc điểm MSC: Tăng trưởng chậm, ni cấy cần giá thể bám, có tính học yếu chế kiềm hãm ngược MSC bảo quản lâu phương pháp lạnh sâu Tế bào gốc trung mơ: biệt hóa thành té bào xương, hủy cốt bào, tế bào sụn, tế bào cơ, nguyên bào sợi, tế bào mỡ, tế bào nội mô, đại thực bào… Chiếm từ 0.001-0.01% tế bào tủy xương Đặc điểm mơi trường DMEM/F12 có bổ xung 10% FBS 1% kháng sinh Nồng độ amino axit, vitamin cao thuật lợi cho nuôi tế bào mật độ cao Huyết thanh: trì khả tăng sinh biệt hóa tế bào ngồi cịn tăng tính bám dính tế bào  Ứng dụng: • Mơ hình thử nghiệm chuẩn đốn bệnh • Sản xuất hợp chất sinh học • Làm vật liệu cấy ghép • Tạo mơ quan  Mẫu thu nhận từ tủy xương, nơi chứa nguồn tế bào gốc trung mô dồi  Cấy chuyền tăng sinh • Khi mật độ tế bào MSC bình ni cấy đạt từ khoảng 70-80% diện tích bình ni, • Nhằm cung cấp không gian chất dinh dưỡng cho MSC, đồng thời tránh tượng ức chế ngược gây chết tế bào  Bảo quản đơng lạnh • Giảm thay đổi hay đặc tính tế bào giảm chi phí ni cấy • Với phương pháp bảo quản lạnh -80⁰C tế bào bảo quản khoảng tuần • Giải đơng Nhằm đưa tế bào trạng thái hoạt động bình thường Cần môi trường dinh dưỡng cao phải giải đông nhanh Nội dung thực tập Thu nhận quần thể tế bào tủy xương Xác định mật độ nuôi sơ cấp Thay môi trường cấy truyền Đông lạnh Giải đông II Vật liệu phương pháp Vật liệu Mẫu vật: chuột nhắt trắng, tuổi từ 6-8 tuần Hóa chất: • Cồn 70% • Dung dịch PBS( kháng sinh 5X, 2X 1X) • Trypsin/EDTA 0,25%/1% • Mơi trường DMEM/F12 FBS 10% Phương pháp A: Thu nhận quần thể tế bào tủy xương, nuôi cấy sơ cấp  Quy trình:  Xác định mật độ tế bào B Thay môi trường Mục tiêu: loại chất thải cung cấp dinh dưỡng cho tế bào phát triển Quy trình: C Cấy truyền đơng lạnh  Mục tiêu: Cấy truyền:tạo không gian cung cấp thêm dinh dưỡng cho tế bào phát triển Đông lạnh: bảo quản tế bào tiết kiệm môi trường nuôi cấy  Phương pháp: Mẫu mượn nhóm 8, ca mật độ tế bào nhóm thấp khơng đủ để cấy truyền Dùng phương pháp học MSC có độ bám dính mạnh B Kết thay mơi trường - Dự đốn thu nhận tế bào gốc trung mơ • Tế bào mọc bám dính • Hình dạng giống ngun bào sợi -Khơng bị nhiễm Hình 3: kết sau thay môi trường Kết cấy truyền Hình 4: mẫu trước cấy chuyền Hình 5: kết sau cấy cấy (nhóm 8, ca 2) truyền  Mật độ tế bào cấy chuyền thấp phân bố không do: lự cào craper yếu huyền phù mẫu không D Kết sau giải đông  Kết đếm tế bào: 13 c 6s 15c 8s 9c 5s 12c 11s C: tế bào chết S: tế bào sống 13c 5s • Tổng số tế bào sống:30 • Tổng số tế bào chết: 53 • Tỉ lệ tế bào sống: 30/83=36.14% Hình 6: kết sau giải đông  hiệu suất đông lạnh 36.14%  Tỉ lệ tế bào chết cao hình thành tinh thể đá, phá hủy cấu trúc tế bào lúc đông lạnh Tài liệu tham khảo: • Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc(2010) Chương 3: Nuôi cấy tế bào động vật Công nghệ sinh học Người Động vật, Nhà xuất Giáo dục Việt Nam trang 127-207 • Strecker S, Liu Y, Wang L, Rowe D, Maye P(2012) Mouse bone marrow derived mesenchymal stem cells Stem cells and Cancer stem cells Vol 6:231-245 • Nadri S, Soleimani M, Hosseni RH, Massumi M, Atashi A, Izadpanah R (2007) An efficient method for isolation ò murine bone mesenchymal stem cells The international journal of development biology, 51(8): 723-9 • I Muller, S Kordowich, C Holzwarth, C Spano, G Isensee, A Staiber, S Viebahn, F Gieseke, H Langer, MP Gawaz, EM Horwitz, P Conte, R Handgretinger and M Dominici(2006) Animal serum-free culture conditions for isolation and expansion of multipotent mesenchymal stromal cells from human BM • Phần mềm Axio version PHẦN 2: THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM ( In vitro fertilization-IVF) Nội dung: Thu nhận giao tử đực Thụ tinh ống nghiệm Đánh giá phát triển phôi Mẫu vật: Chuột nhắt trắng từ 6-8 tuần tuổi do: • Chuột nhắt trưởng thành từ 35-42 ngày • Con động dục khoảng 4-6 tuần, đực từ tuần 5-7 LỌC DẦU KHỐNG Mục đích: loại bỏ vi sinh vật gây nhiễm Dầu khống dung để: • Cố định cấu trúc vi giọt • Ngăn bay nước vi giọt • Chống nhiễm vi khuẩn Nguyên tc ã Kớch thc vi khun: ng kớnh (0.2ữ2.0m) x chiều dài (2.0÷8.0μm) nên lọc màng lọc 0.2 um syringe loại bỏ hết vi sinh vật gây nhiễm • Lọc mơi trường vơ trùng • Hút dầu lên chậm tránh bị văng dầu lúc nhả xuống dùng lực ép mạnh để lọc • Không chạm vào đầu màng lọc Tạo vi giọt Mục đích: • Tạo mơi trường thụ tinh ni phơi Ngun tắc: • Thực điều kiện vơ trùng • Tạo giọt thể tích • Khơng tạo bọt vi giọt Kéo pipette pasteur Mục đích: hút chuyển trứng, phơi Ngun tắc: Tùy mục đích có loại : đầu lớn đầu nhỏ Kéo kim đèn cồn Khi kéo đầu pipette tạo với thân góc > 90⁰ Phải kéo nhanh dứt khốt Chích chuột Mục tiêu: Gây mê chuột: giảm đau đớn cho chuột dễ thao tác Nguyên tắc:  Vô trùng  Bơm tiêm dụng cụ khác phải đảm bảo vơ khuẩn  Khi chích cho chuột dùng cồn sát trùng vùng đùi, vuốt ngược lên để lộ phần bắp  Khi hút thuốc xong chưa tiêm phải đậy đầu kim lại  Tiêm liều thời điểm  Khi chích nghiêng mũi kim 45 độ chích khoảng 1/3 mũi kim tránh tổn thương quan bên chuột NGUYÊN TẮC LỰA CHON GIAO TỬ Chọn trứng: trứng chín: • Cụm cumulus xung quanh Trứng trưởng thành lớp cumulus mờ tách thành nhiều tế bào riêng lẽ Các tế bào cumulus mở rộng,số lượng lớn metaphage I • Thể cực thứ Có thể cực xuất hiện, trứng trưởng thành metaphage II • Túi mầm: Cịn túi mầm: trứng chứa trưởng thành Mất túi mầm: vỡ trứng trưởng thành • Trứng khơng phân mảnh: tăng khả thụ tinh Hình 1: trứng trưởng thành Nguyên tắc chọn tinh trùng phương pháp swim-up nhuộm • Mật độ tinh trùng: phải đạt từ 1-2.5x10^6 tt/ml • Tinh trùng có độ di động cao • Hình thái: >30% tinh trùng có hình dạng bình thường Phương pháp swim-up: • Tinh trùng di động tốt tự bơi lên trên, khỏi lớp tinh dịch Ngun tắc đánh giá phơi • Thụ tinh thành cơng có tiền nhân thể cực • Màng ZP dày • Nguyên sinh chất thường có hạt Kết Thu nhận tinh trùng • Thu ống dẫn tinh tinh dịch • Sau swim-up, đếm tế bào khơng có tinh trùng Giải thích: • Lương tinh dịch thu q ít, sau swim-up hút phần thể tích khơng chứa tinh trùng để đếm • Do nhóm 15 làm chuột thu tinh trùng nên loại khả chuột khơng có tinh trùng Thu nhận trứng: • Thu buồng trứng ống dẫn trứng • Khơng thu trứng Giải thích: Khi thu làm đứt ống dẫn trứng nên trứng Cả nhóm 15, 16 khơng thu trứng trứng chưa chín rụng Kết từ nhóm 14: Trứng: Phân tích: • Chưa hình thành thể cực thứ nhât • Cịn túi mầm khoảng khơng xung quanh nỗn hồn lớn  trứng chưa trưởng thành Hình 1: trứng thu từ chuột Tinh trùng: Đạt nồng độ cao, pha loãng thành 2.5x10^6 tt/ml Kết thụ tinh: Đánh giá qua kính hiển vi: • Trứng khơng quan sát xuất tiền nhân • Khơng cực • Màng mờ, mỏng thụ tinh khơng thành cơng Giải thích: trứng thụ đem thụ tinh chưa trưởng thành nên khơng thụ tinh Hình 2: Trứng tinh trúng trước thụ tinh Hình 3: trứng sau 18 thụ tinh Đánh giá phôi sống chết • Phôi bắt màu xanh với thuốc nhuộm Hoechst màu đỏ với thuộc nhuộm PI cho thấy phôi chết màng tế bào khơng hoạt động Giải thích • Thuốc nhuộm Hoechst liên kết với rãnh nhỏ DNA vùng giàu adenine thymine Kết cho màu xanh chứng tỏ có DNA hay tế bào • Thuốc nhuộm IP liên kết DNA qua gắn base xuyên màng thường bị loại tế bào sống Kết cho màu đỏ cho thấy màng khơng hoạt động hay phơi chết Hình 4: phơi nhm với Hoechst Hình 5: phơi nhm với PI ...PHẦN NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT I TỔNG QUAN  Cơ sở lí thuyết: Máu tủy xương có ba loại tế bào chính: tế bào gốc tạo máu(MSC) ,tế bào máu trưởng thành MSC Trong nuôi cấy, MSC bám dính vào bề mặt (giá... thành cơng Giải thích: trứng thụ đem thụ tinh chưa trưởng thành nên khơng thụ tinh Hình 2: Trứng tinh trúng trước thụ tinh Hình 3: trứng sau 18 thụ tinh Đánh giá phôi sống chết • Phơi bắt màu xanh... Kết Thu nhận tinh trùng • Thu ống dẫn tinh tinh dịch • Sau swim-up, đếm tế bào khơng có tinh trùng Giải thích: • Lương tinh dịch thu q ít, sau swim-up hút phần thể tích khơng chứa tinh trùng để