KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

LOGO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********&******** KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT GVHD : TS. Nguyễn Hữu Đức Nhóm III STT MSSV Họ và tên 1 533314 Lê Văn Vẻ 2 533272 Vũ Thị Huế 3 533253 Sa Thu Giang 4 533317 Lê Thị Xuân 5 533278 Vũ Thị Hường 6 533289 Hoàng Văn Phúc 7 533292 Phạm Thị Sang 8 533296 Đoàn Hữu Thanh Hà Nội - 3/2011 1 NỘI DUNG 2 I I MỞ ĐẦU II NỘI DUNG 1. 2. CẤY CHUYỂN TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO 3. ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO 4. GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO 5. XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO 6. CHUẨN BỊ TẾ BÀO CHO VẬN CHUYỂN KẾT LUẬN III CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN I - MỞ ĐẦU  Những năm gần đây, công nghệ tế bào động vật đã đạt được những bước tiến mạnh mẽ. Nuôi cấy tế bào động vật là một lĩnh vực quan trọng trong công nghệ tế bào động vật.  Ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vật: mô hình thử nghiệm và chuẩn đoán bệnh, sản xuất các hợp chất sinh học, làm vật liệu cấy ghép, tạo cơ quan từ tế bào động vật nuôi cấy…  Trong nuôi cấy tế bào động vật in vitro, chìa khóa để thành công là cần phải nắm vững một số các kỹ thuật cơ bản như: cấy chuyển, đông lạnh, giải đông, đếm số lượng tế bào… 3 II - NỘI DUNG 1. CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN 2. CẤY CHUYỂN TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO 3. ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO 4. GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO 5. XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO 6. CHUẨN BỊ TẾ BÀO CHO VẬN CHUYỂN 4 CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN  Cấy chuyển tế bào lớp đơn là kỹ thuật chọn lọc và tách các tế bào dạng lớp đơn từ kết quả nuôi cấy sơ cấp, chuyển sang nuôi cấy các loại tế bào khác nhau.  Trong dụng cụ nuôi cấy có môi trường dinh dưỡng thích hợp 5 CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN Chu kỳ sinh trưởng của tế bào động vật gồm 4 pha:  Pha tiềm sinh (lag phase)  Pha số mũ ( Log phase)  Pha tuyến tính (Stationary phase)  Pha suy thoái (Death phase) 6 CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN  Giai đoạn cấy chuyển vào gần cuối pha log 7 Vật liệu  Các bình nuôi cấy tế bào sơ cấp  HBSS không có Ca 2+ và Mg 2+ , 37 ° C  Dung dịch Trypsin/EDTA, 37° C  Môi trường được bổ sung huyết thanh Vd: DMEM với 10% - 15% (V/ V)  FBS (Đầy đủ DMEM-10 hay-15), 37° C  Pipet, đầu côn vô trùng  Khay ấm 37°C hoặc máy ủ  Bình nuôi cấy 25cm 2 hoặc đĩa petri 8 CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN Các bước thực hiện  Hút bỏ môi trường cũ  Rửa và tách các tế bào  Chọn các tế bào thích hợp chuyển sang môi trường mới 9 CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN  Hút bỏ môi trường cũ - Loại bỏ tất cả các môi trường từ nuôi cấy sơ cấp với một ống pipet vô trùng. - Nếu các tế bào bám chặt có thể đổ bỏ môi trường. - Nếu nhiều tế bào nổi hay bám yếu, nên lắc nhẹ và rửa. 10 [...]... ĐƠN 2 CẤY CHUYỂN TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO 3 ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO 4 GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO 5 XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO 6 CHUẨN BỊ TẾ BÀO CHO VẬN CHUYỂN 15 CẤY CHUYỂN TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO  Nuôi cấy huyền phù tế bào là phương thức nuôi cấy các tế bào trong môi trường lỏng trong bình nuôi có dung tích phù hợp và lắc nhẹ nhàng  Cấy chuyển các dung dịch huyền phù ít phức tap hơn cấy chuyển nuôi cấy. .. ĐÔNG TẾ BÀO 5 XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO 6 CHUẨN BỊ TẾ BÀO CHO VẬN CHUYỂN 24 GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO  Mục đích: Khôi phục lại trạng thái hoạt động, đặc điểm, tính chất của tế bào trong nuôi cấy tế bào động vật  Kỹ thuật giải đông có ảnh hưởng đến chất lượng tế bào: - Nếu quá trình giải đông chậm, các tế bào bị tổn thương hoặc bị chết nhiều, ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy - Nếu giải đông càng nhanh, đúng kỹ thuật, ... Chuyển sang bình nuôi, ủ ở 37oC trong điều kiện nồng độ CO2 5 %  Sau 24h thì kiểm tra kết quả nuôi cấy, bỏ môi trường cũ và bổ sung 5 - 6ml môi trường mới đã làm ấm và tiếp tục nuôi cấy 27 NỘI DUNG 1 CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN 2 CẤY CHUYỂN TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO 3 ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO 4 GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO 5 XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO 6 CHUẨN BỊ TẾ BÀO CHO VẬN CHUYỂN 28 XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO Sử dụng... CHUYỂN TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO 3 ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO 4 GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO 5 XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO 6 CHUẨN BỊ TẾ BÀO CHO VẬN CHUYỂN 20 ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO  Đông lạnh tế bào động vật là sử dụng môi trường đông lạnh, nhiệt độ thấp (-800C, -1960C) để lưu giữ các tế bào động vật phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng  Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đông lạnh gồm: - Tốc độ đông lạnh - Kỹ thuật đông lạnh... 1000 v/p trong 5 phút  Trộn tế bào vào môi trường đông lạnh để tạo dạng huyền phù, mật độ thích hợp khoảng 107 tế bào/ ml 22 ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO  Ghi nhãn, dùng giấy nến, bao gói và các ống đông lạnh có huyền phù vào tủ đông lạnh -800C trong một vài giờ, và chuyển vào giữ trong bình chứa Nitơ lỏng 23 NỘI DUNG 1 CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN 2 CẤY CHUYỂN TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO 3 ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO 4 GIẢI... cấy chuyển 16 CẤY CHUYỂN TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO VẬT LIỆU  Các bình nuôi cấy chứa dung dịch huyền phù tế bào  Bình Shaker mà không có vách ngăn hoặc bình spinner  Môi trường sinh trưởng hoàn chỉnh,được làm ấm tới 370C  Tủ ủ 370C với nồng độ CO2 5%  Máy khuấy từ, giá đựng bình  Hóa chất và trang thiết bị để xác định kết quả và đếm tổng số tế bào 17 CẤY CHUYỂN TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ... lượng tế bào càng tốt 25 GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO Quy trình giải đông tế bào động vật có vú trữ lạnh theo quy trình của Schrieber’s gồm có các bước chủ yếu sau:  Lấy ống tế bào đông lạnh từ trong bình Ni tơ lỏng, đặt ngay vào bình ổn nhiệt có lắc ở 37oC  Chuyển dịch huyền phù tế bào trong ống đông lạnh sang ống ly tâm 15ml vô trùng  Bổ sung huyết thanh bê bào thai FBS 26 GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO  Ly tâm trong. .. các tế bào là tốt  Khi các tế bào nuôi cấy kết tụ (~2.5 × 10 2cell/ml) sẽ cấy chuyển như sau:  Lấy bình từ buồng ủ và lắc bình cho tới khi các tế bào tách rời nhau trong môi trường  Lấy 1/2 thể tích tế bào huyền phù và chuyển sang một bình mới  Cung cấp dinh dưỡng cho mỗi bình 7-10 ml môi trường đã được làm ấm và tiếp tục đưa vào buồng ủ 19 NỘI DUNG 1 CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN 2 CẤY CHUYỂN TRONG NUÔI... phù tế bào Nạp buồng đếm hồng cầu Đếm tế bào Tính tổng số lượng tế bào Nhuộm tế bào để xác định sức sống của tế bào Tính số lượng tế bào sống 34 XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO  Chuẩn bị buồng đếm hồng cầu: - Làm sạch lá kính đậy và buồng đếm hồng cầu bằng cồn 70 % - Làm ướt mép của lá kính đậy (lamen) và ấn thành đường rãnh trên buồng đếm hồng cầu 35 XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO  Chuẩn bị huyền phù tế bào. .. trường để duy trì mật độ 1 × 106 tế bào /ml Nhẹ nhàng lắc bình để làm phân tán các tế bào  Đặt bình vào buồng ủ: Vmt