NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT:KỸ THUẬT VÀ ỨNG DỤNG.TS.VŨ BÍCH NGỌC

9/16/19 TS Vũ Bích Ngọc-vbngoc@hcmus.edu.vn SINH HỌC CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Đặc điểm sinh học tế bào Các yếu tố ảnh hưởng đến thành công ni cấy tế bào 9/16/19 TS Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Tăng trưởng phân chia chậm Tính chất cần giá đỡ Tính học yếu Thay đổi kiểu gen kiểu hình Cơ chế kìm hãm ngược Có thể bảo quản lâu dài phương pháp lạnh sâu 9/16/19 9/16/19 TS Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn TS Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Phân chia chậm Tăng trưởng, phân chia chậm (20-40 giờ) Hiệu suất sinh chất có hoạt tính sinh học thấp 9/16/19 TS Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Chu kì tế bào Interphase: • Kéo dài từ 12-14 mô động vật có vú • Tế bào tổng hợp RNA,tạo protein phát triển kích thước o Gap (G0): tế bào khỏi chu kì tế bào không phân chia o Gap (G1): tế bào gia tăng kích thước, tổng hợp RNA protein, có G1 Checkpoint o S Phase: nhân đôi DNA xảy o Gap (G2): tế bào tiếp tục phát triển sản xuất protein Có G2 Checkpoint Điểm kiểm sốt G2 • DNA replicated • cell big • environment suitable Mitosis hay M Phase: • Sự phát triển tổng hợp protein • Tế bào chia thành tế bào giống • Mitosis thường xảy từ 1-2 • Có Checkpoint kì Mitosis (Metaphase Checkpoint) để đảm bảo tế bào hoàn thành xong phân chia G2 Gap2 Điểm kiểm sốt Metaphase • NST xếp M Mitosis mặt phẳng thoi vô sắc G1 Gap1 G0 S Synthesis Điểm kiểm sốt G2 • cell big • environment suitable Điểm kiểm sốt G1 • Là điểm quan trọng định phân chia tế • Khi tế bào vượt qua điểm này, vào phase S, trình phân chia khơng thể đảo ngược Điểm kiểm sốt G2 • Đảm bảo tế bào phân chia thuận lợi • Nếu tế bào bị lỗi tổn thương, G2 checkpoint dừng lại để sửa chữa • Nếu tổn thương khơng thể đảo ngược, tế bào vào q trình apoptosis đảm bảo DNA hư hỏng tế bào không truyền cho hệ sauà quan trọng ngăn ngừa ung thư Điểm kiểm sốt thoi vơ sắc Tính chất cần giá đỡ -TB bám vào giá đỡ để sống sót, phân chia - Ngoại trừ: hồng cầu, TB ung thư, số dòng TB liên tục 9/16/19 TS Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Tính học yếu Khơng có vách tế bàoè tế bào dễ tổn thương 9/16/19 è Tế bào dễ biến đổi TS Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Thời gian nhân đôi rBMMSC không thay đổi suốt q trình ni hASC, rASC, hBMMSC thời gian tăng gấp Izadpanah R, Trygg C, Patel B, et al Biologic Properties of Mesenchymal Stem Cells Derived From Bone Marrow and Adipose Tissue Journal of cellular biochemistry 2006;99(5):1285 Yếu tố phiên mã Chịu trách nhiệm điều hồ đặc tính sinh học tế bào Các yếu tố khác (bổ sung từ ngoài): định hướng biệt hoá tế bào POU mã hoá Oct-4 BMP-6, TGF-β3, dexamethasone, ascorbate 2phosphate, proline, pyruvate, insulin, transferrin, selenous acid, 5aza-cystidine Oct-2 , Sox-2 Rex điều hồ chặt chẽ q trình phát triển phơi Duy trì tính đa tiềm tế bào SỰ BÁM DÍNH IN VITRO • Sự bám dính tế bào cần thiết cho tăng sinh biệt hóa • Các phân tử bám dính tế bào: – Tương tác tế bào-tế bào: CAMs, cadherins – Tương tác tế bào-chất nền: integrin, transmembra me proteoglycan • Phức hợp nối chặt (Tight junctional complex) tế bào biểu mô cho tương tác tế bào-tế bào 22 23 Các nhân tố ảnh hưởng đến bám dính • • • Sự phân tách enzyme: tiêu hủy phân tử bám dính chất ngoại bào Hầu hết tế bào từ mô rắn phát triển dạng lớp đơn (monolayer) Bề mặt bao phủ với Matrix kích thích tăng sinh biệt hóa tế bào Experimental Methods 2006 Các yếu tố ảnh hưởng đến thành công nuôi cấy tế bào Tế bào thích hợp Điều kiện thích hợp Phase rắn • Cơ chất hay phase mà tế bào phát triển eg glass, plastic, collagen, agar Phase lỏng • Các đặc tính sinh lí lí hóa thành phần mơi trường ni Phase khí Nhiệt độ Độ vô trùng môi trường Experimental Methods 2006 24 Pha rắn • Tế bào cần bám dính vào giá thể để sinh trưởng di chuyển • Dụng cụ phổ biến nâất polystyrene plastic • Những chất khác glass, filter wells • Bề mặt có têể xử lí với: • Phủ với chất Collagen, poly-l-lysine, matrigel • Lớp feeder: monolayer of supporting cells, perhaps promote cell growth and differentiation by cell contact and substance secreted • Neurons on glial cell feeder layers Phase lỏng • Thành phần mơi trường – Muối vơ • Cân áp suất thẩm thấu • Điều hòa điện màng: sodium, potassium calcium ions • Cần thiết cho bám dính enzyme cofactor – Carbohydrate • Hầu hết chứa 4-20 mM glucose • Nguồn lượng: glycolysis Phase lỏng – Proteins and Peptides • Được sử dụng để thay diện huyết eg transferrin, fibronectin – Amino acids • Quan trọng cho tăng sinh biệt hóa • glutamine vào chu trình Kreb’s cycle – Fatty Acids and Lipid • Quan trọng mơi trường serum free media e.g cholesterol and steroids cần thiết cho tế bào đặc biệt Phase lỏng – Vitamin • vitamins B cần thiết cho phát triển tăng sinh • Tiền chất cho co-factors • Vitamins thường sử dụng thiamine, riboflavin and biotin – Trace Element • zinc, copper, selenium tricarboxylic acid intermediates • Selenium is a detoxifier giúp tách gốc O2 tự Phase lỏng – Hệ đệm • Hầu hết tế bào cần pH tối ưu: 7.2 - 7.4 • Kiểm sốt pH cần thiết cho ni cấy tối ưu: – Hệ thống đệm bicarbonate/CO2 – Hệ đệm hóa chất: HEPES • Mơi trường ni cấy thương mại pH indicator – vàng (acid) hay hồng (alkali) – Áp suất thẩm thấu • Tương tự áp suất thẩm thấu 290 mOsm Phase lỏng – Huyết • Nhân tố khơng xác định: albumins, growth factors growth inhibitors • Gia tăng khả đệm • Tăng khả bám dính trung hịa chất độc • Quan trọng cho tế bào phát triển chậm hay nuôi mật độ thấp • Biến thiến mẻ • Huyết bất họat nhiệt (incubation at 56ºC for 30 minutes) giúp giảm rủi ro nhiễm Phase khí – Carbondioxide • Quan trọng cho hệ đệm – 5-10% CO2 – Sản xuất sản phẩm: pyruvate Pyruvate Dehydrogenase H3C O O C C pyruvate HSCo A O- O H3 C NAD+ NADH C S CoA + CO2 acetyl-CoA – Oxy • Hầu hết tế bào cần thiết phân áp oxy thấp • anaerobic glycolysis • Nồng độ oxy cao gia tăng gốc O2 tự Experimental Methods 2006 31 Hình dạng tế bào ni • Hình dạng tế bào ni cấy dạng chính: – Phát triển huyền phù (như tế bào đơn hay cụm nhỏ tế bào) • Dịng tế bào thu từ máu (leukaemia, lymphoma) – Phát triển dạng monolayer bám dính vào dụng cụ ni • Tế bào thu từ mô rắn (lungs, kidney), endothelial, epithelial, neuronal, fibroblasts Hela-Epithelial BAE1-Endothelial Experimental Methods 2006 MRC5-Fibroblast SHSY5Y-Neuronal 32 Nhiệt độ – Nhiệt độ tối ưu phụ thuộc vào lồi • Nhiệt độ thể mà tế bào thu nhận • Nhiệt độ của vùng mô thu nhận tế bào (skin temperature may be lower than the rest of the body) Experimental Methods 2006 33 10/9/17 TS Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn