Bảo quản đông lạnh tế bào.TS.Vũ Bích Ngọc.

12/2/17 TS Vũ Bích Ngọcvbngoc@hcmus.edu.vn Dịch vụ làm đơng lạnh thể người chết để chờ hồi sinh •  Gần 1000 người giới chọn cách bảo quản lạnh thể sau chết để chờ hội tái sinh tương lai Khi "khách hàng" chết mặt pháp y, nhân viên Alcor chuyển họ lên giường lạnh dùng thiết bị hồi sức tim phổi làm cho máu lưu thông khắp thể lần Sau đó, họ sử dụng 16 loại thuốc khác để giúp cho tế bào không bị hư tổn sau chết trước rút hết máu dịch thể bơm chất lỏng bảo vệ nội tạng vào thay Cuối cùng, nhân viên tiến hành làm lạnh thi thể 0,5 độ C đạt tới nhiệt độ nitơ lỏng -160 độ C sau tuần Tiếp đó, họ cho thi thể vào tủ đơng lạnh hình trụ tư đầu lộn xuống Bọ cánh cứng Alaskan •  Sản xuất chất chống đơng sugary carbohydrate có tên xylomannan (polymer đường xylose mannose sugars) •  chịu nhiệt -100 0C 1949 Polge, Parks Smith Sperm 1959 Lovelock and Bishop GLYCEROL 1950 Smith Human red blood cells Dimethyl sulfoxideDMSO TĂNG CƯỜNG TÍNH THẤM •  quy trình sinh học nhằm đảm bảo tính ổn định mặt di truyền cấu trúc nguyên vẹn tế bào sống; đảm bảo thành phần nucleic acid protein tế bào khơng thay đổi •  Quá trình ổn định vật liệu sinh học nhiệt đô cực thấp gọi bảo quản đông lạnh Hoạt động biến dưỡng tế bào ngưng lại điều kiện tiên quy trình bảo quản tế bào Tất nước hệ thống bị chuyển đổi thành đá THÌ hoạt động biến dưỡng ngưng Nguyên tắc bảo quản đông lạnh tế bào làm cho tế bào lượng nước định nhằm hạn chế tình trạng đóng băng q trình làm lạnh Sử dụng chất bảo quản đơng lạnh •  Áp lực chọn lọc khiến dòng tế bào bất ổn đặc tính •  Sự giới hạn khả tăng sinh tế bào •  Sự bất ổn kiểu gen kiểu hình •  Sự nhiễm chéo, nhiễm khuẩn ni cấy •  Sự tương đồng thí nghiệm •  Tiết kiệm thời gian vật liệu Nhiệt độ Chất bảo quản Tốc độ làm lạnh YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỐNGCHẾT CỦA TẾ BÀO Quy trình đơng lạnhrã đông Các bước cho bảo quản đông lạnh mô/tế bào Thu nhận chọn lọc nguồn Chất bảo quản đông lạnh (CPA) chất dùng để bảo Thêm chất bảo quản đông lạnh (CPAs) Đông lạnh mẫu, thường từ -80 -120oC quản mô/tế bào khỏi tổn thương đông lạnh (tổn thương tạo đá ) VD: glycerol, DMSO…… liquid nitrogen (-196oC), bảo quản thời gian dài http://www.agr.kuleuven.ac.be/dtp/tro/cost871/Home.htm http://blog.bioethics.net/cryopreservation.jpg LÀM LẠNH CỰC NHANH LÀM LẠNH CHẬM (3 BƯỚC) LÀM LẠNH THEO CHƯƠNG TRÌNH Chuyển nhanh tế bào vào ni tơ lỏng chuyển tế bào vào tủ mát 4-80C 30 phút Đặt tế bào vào hệ thống làm lạnh theo chương trình chuyển vào tủ đông -200C 120 phút cài đặt hệ thống làm lạnh với thông số nhiệt độ thời gian làm lạnh tương ứng Chuyển sang -800C, để qua đêm chuyển vào bình ni tơ lỏng Chuyển vào bình ni tơ lỏng •  Ở tốc độ làm lạnh cực nhanh độ nhớt cao, tế bào khơng hình thành tinh thể đá nội bào ngoại bào •  việc kiểm soát độ nhớt mong muốn cần phải khảo sát chuẩn hố •  phương pháp thành công cho tế bào tinh trùng, trứng, phôi tế bào gốc phơi •  Nhiệt độ khởi động: 40C RT •  Tốc độ hạ nhiệt: làm lạnh -10C phút hạ nhiệt đến •  nhiệt độ đạt -1000C, đặt trực tiếp vào ni tơ lỏng •  cọng rạ lọ chứa làm lạnh nitrogen Rã đông tế bào Các tế bào cần làm tan nhanh chóng sau pha lỗng từ từ vào mơi trường tăng trưởng Chuyển ống tế bào 1ml vào ống ly tâm 15 ml Thêm từ từ (nhỏ giọt) 10ml môi trương ấm DMSO gây độc cho tế bào " nên thay mơi trường nhanh Có thể thay DMSO glycerol Các bước cần thiết để rã đông mô/tế bào chuẩn bị cho sử dụng lâm sàng Lấy mẫu đông lạnh khỏi bình chứa nito lỏng Làm ấm tế bào đơng lạnh bể ổn nhiệt Loại bỏ CPA khỏi mẫu đơng lạnh Ứng dụng lâm sàng 37oC Water Bath •  làm tan nhanh tinh thể đá cứu nhiều tế bào ngăn chặn tăng trưởng tinh thể đá nhỏ thành tinh thể đá lơn (tái kết tinh) tế bào (-5 đến -15 độ) •  số nghiên cứu cho thấy làm ấm chậm có hiệu tối ưu cho mẫu đơng lạnh lậm •  tế bào nhạy cảm với việc phình so với việc co nên việc loại bỏ chất bảo quản gây hư hại tế bào nhiều so với việc bổ sung (ASTT) •  q trình rã đơng, mơi trường chứa chất bảo quản thường pha loãng trước loại bỏ hồn tồn khỏi tế bào •  tế bào bám dính, việc thao tác rã đông đơn giản với việc loại bỏ môi trường đông lạnh khỏi lớp đơn tế bào bổ sung môi trường nuôi tế bào •  huyền phù tế bào, ly tâm để tách tế bào khỏi mơi trường có chất bảo quản đơng lạnh •  •  •  •  Bể ổn nhiệt Tủ thao tác an toàn sinh học cấp II Máy ly tâm Tủ ủ ni tế bào (370C, 5% CO2) •  Ống chứa tế bào đơng lạnh •  Mơi trường rã đơng: bao gồm môi trường (RPMI, DMEM/F12, IMDM…) bổ sung 20-30% huyết thai bò (FBS), 1% kháng sinh-kháng nấm •  Ống ly tâm 15ml 50 ml vô trùng •  Flask nuôi tế bào •  Tế bào từ bình bảo quản đơng lạnh (ở nhiệt thập cực thấp) nên chuyển sang bể ổn nhiệt (370C) để tránh tối đa tái kết tinh tinh thể đá •  Các thao tác tế bào nên thực nhẹ nhàng để tránh gây tổn thương cho tế bào •  Sau rã đơng ngày, tỷ lệ tế bào chết chiếm số lượng đáng kể, nên thay môi trường để loai bỏ tế bào chết Ủ ấm môi trường nuôi tế bào 370C chuyển vào tủ thao tác vô trùng Lấy ống tế bào từ bình ni tơ lỏng, chuyển vào bể ổ nhiệt 370C, ủ đến dung dịch tan băng 70% (tránh cho nước dính vào nắp cryovial, gây nhiễm khuẩn) Nhẹ nhàng hút chuyển tế bào sang ống ly tâm 15 ml Nhẹ nhàng bổ sung thêm môi trường rã đông với tốc độ 6-10 ml môi trường rã đông phút, trộn nhẹ Ly tâm tốc độ 1.500-3.000 vòng/phút phút để loại bỏ mơi trường có chứa DMSO, thu tế bào Tái huyền phù tế bào môi trường rã đông môi trường chuyên biệt Phần tế bào cịn lại ống ly tâm sử dụng để kiểm tra tỷ lệ sống chết tế bào Chuyển huyền phù tế bào vào Flask nuôi tiến hành nuôi tủ nuôi tế bào điều kiện phù hợp