NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT: KỸ THUẬT VÀ ỨNG DỤNG.TS.VŨ BÍCH NGỌC

10/1/17 TS Vũ Bích Ngọc-vbngoc@hcmus.edu.vn SINH HỌC CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Đặc điểm sinh học của tế bào Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của nuôi cấy tế bào 10/1/17 TS Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Tính cơ học yếu (dễ vỡ) 10/1/17 Tăng trưởng, phân chia chậm (20-40 giờ) Hiệu suất sinh chất có hoạt cnh sinh học thấp TS Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Chu kì tế bào G2 check point •  DNA replicated •  cell big •  environment suitable G2 Gap2 M Mitosis Metaphase check point •  chromosome align on spindle G1 Gap1 G0 S Synthesis G1 check point •  cell big •  environment suitable Chu kì tế bào •  Interphase: –  Nhìn chung kéo dài từ 12-14 giờ trong mơ động vật có vú –  Tế bào đang tổng hợp RNA,tạo protein và phát triển về kích thước •  Gap 0 (G0): tế bào thốt ra khỏi chu kì tế bào và khơng phân chia •  Gap 1 (G1): tế bào gia tăng kích thước, tổng hợp RNA và protein, có 1 G1 Checkpoint •  S Phase: sự nhân đơi DNA xảy ra •  Gap 2 (G2): tế bào sẽ cếp tục phát triển và sản xuất các protein mới Có 1 G2 Checkpoint •  Mitosis hay M Phase: –  –  –  –  Sự phát triển và tổng hợp protein Tế bào chia thành 2 tế bào giống nhau Mitosis thường xảy ra từ 1-2 giờ Có Checkpoint trong giữa kì của Mitosis (Metaphase Checkpoint) để đảm bảo tế bào hồn thành xong sự phân chia Chu kì tế bào •  Là điểm quan trọng quyết định sự phân chia của tê sbaof •  Khi tế bào vượt qua điểm này, đi vào phase S, q trình phân chia khơng thể đảo ngược Chu kì tế bào •  Đảm bảo tế bào phân chia thuận lợi •  Nếu tế bào bị lỗi hoặc tổn thương, G” checkpoint sẽ dừng lại để sửa chữa •  Nếu tổn thương khơng thể đảo ngược, tế bào đi vào q trình apoptosis à đảm bảo DNA hư hỏng tế bào khơng truyền cho thế hệ sa quan trọng trong ngăn ngừa ung thư Chu kì tế bào SỰ TĂNG SINH IN VITRO •  Sự TĂNG SINH của tế bào trong ni cấy phụ thuộc: –  Trạng thái tự nhiên của tế bào: Vai trị của bộ gen – Giới hạn Hayflick Vai trị của sự biểu hiện gen •  •  –  Mơi trường ni cấy •  •  •  •  •  Cơ chất tế bào bám Thành sinh lí và sinh hố của mơi trường ni Thành phần của phase khí Nhiệt độ ni Tương tác tế bào-tế bào và tế bào-chất nền Thời gian nhân đơi của rBMMSC khơng thay đổi trong suốt q trình ni trong khi ở hASC, rASC, hBMMSC thời gian này tăng gấp 2 Izadpanah R, Trygg C, Patel B, et al Biologic ProperŠes of Mesenchymal Stem Cells Derived From Bone Marrow and Adipose Tissue Journal of cellular biochemistry 2006;99(5):1285 SỰ BÁM DÍNH IN VITRO •  Sự bám dính tế bào là cần thiết cho sự tăng sinh và biệt hóa •  Các phân tử bám dính tế bào: –  Tương tác tế bào-tế bào: CAMs, cadherins –  Tương tác tế bào-chất nền: integrin, transmembrame proteoglycan •  Phức hợp nối chặt (Tight juncŠonal complex) trong tế bào biểu mơ cho sự tương tác tế bào-tế bào 19 Các nhân tố ảnh hưởng đến sự bám dính •  Sự phân tách bằng enzyme Šêu hủy các phân tử bám dính và chất nền ngoại bào •  Hầu hết tế bào từ mơ rắn phát triển dạng monolayer •  Bề mặt bao phủ với Matrix kích thích sự tăng sinh và biệt hóa` Experimental Methods 2006 20 KÌM HÃM TIẾP XÚC - ĐIỀU HỒ SỰ TĂNG SINH •  Kìm hãm Šếp xúc •  Kích thích sự tăng sinh –  Mật độ thấp –  Các cn hiệu từ mơi trường: các nhân tố tăng trưởng •  Ức chế sự tăng sinh –  Giới hạn mật độ: mật độ tế bào cao –  Kìm hãm Šếp xúc: tương tác tế bào –  Các cn hiệu từ mơi trường: p53 gene product 21 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành cơng của ni cấy tế bào •  Tế bào thích hợp •  Điều kiện thích hợp –  Phase rắn •  Cơ chất hay phase mà tế bào phát triển eg glass, plasŠc, collagen, agar –  Phase lỏng •  Các đặc cnh sinh lí và lí hóa của thành phần mơi trường ni –  Phase khí –  Nhiệt độ –  Độ vơ trùng của mơi trường Experimental Methods 2006 22 Pha rắn •  Tế bào cần bám dính vào một giá thể để sinh trưởng và di chuyển •  Dụng cụ phổ biến nâất là polystyrene plasŠc •  Những cơ chất khác như glass, filter wells •  Bề mặt có têể được xử lí với: –  Phủ với cơ chất nền như Collagen, poly-llysine, matrigel –  Lớp feeder: monolayer of supporŠng cells, perhaps promote cell growth and differenŠaŠon by cell contact and substance secreted •  Neurons on glial cell feeder layers Experimental Methods 2006 23 Phase lỏng •  Thành phần của mơi trường –  Muối vơ cơ •  Cân bằng áp suất thẩm thấu •  Điều hịa điện thế màng: sodium, potassium và calcium ions •  Cần thiết cho sự bám dính như enzyme cofactor –  Carbohydrate •  Hầu hết chứa 4-20 mM glucose •  Nguồn năng lượng: glycolysis Experimental Methods 2006 24 Phase lỏng –  Proteins and Pepcdes •  Được sử dụng để thay thế hiện diện trong huyết thanh eg transferrin, fibronecŠn –  Amino acids •  Quan trọng cho sự tăng sinh và biệt hóa •  glutamine có thể đi vào chu trình Kreb’s cycle –  Fa€y Acids and Lipid •  Quan trọng trong mơi trường serum free media e.g cholesterol and steroids cần thiết cho các tế bào đặc biệt Experimental Methods 2006 25 Phase lỏng –  Vitamin •  vitamins B cần thiết cho sự phát triển và sự tăng sinh •  Tiền chất cho các co-factors •  Vitamins thường sử dụng là thiamine, riboflavin and bioŠn –  Trace Element •  zinc, copper, selenium và tricarboxylic acid intermediates •  Selenium is a detoxifier và giúp tách các gốc O2 tự do Experimental Methods 2006 26 Phase lỏng –  Hệ đệm •  Hầu hết các tế bào cần pH tối ưu: 7.2 - 7.4 •  Kiểm sốt pH cần thiết cho ni cấy tối ưu: –  Hệ thống đệm bicarbonate/CO2 –  Hệ đệm hóa chất: HEPES •  Mơi trường ni cấy thương mại như pH indicator –  vàng (acid) hay hồng (alkali) –  Áp suất thẩm thấu •  Tương tự áp suất thẩm thấu 290 mOsm Experimental Methods 2006 27 Phase lỏng –  Huyết thanh •  Nhân tố khơng xác định: albumins, growth factors và growth inhibitors •  Gia tăng khả năng đệm •  Tăng khả năng bám dính và trung hịa chất độc •  Quan trọng cho các tế bào phát triển chậm hay khi ni mật độ thấp •  Biến thiến từng mẻ •  Huyết thanh bất họat nhiệt (incubaŠon at 56ºC for 30 minutes) có thể giúp giảm rủi ro nhiễm Experimental Methods 2006 28 Phase khí –  Carbondioxide •  Quan trọng cho hệ đệm –  5-10% CO2 –  Sản xuất sản phẩm: pyruvate Pyruvate Dehydrogenase H3C O O C C pyruvate HSCo A O− O H3 C NAD+ NADH C S CoA + CO2 acetyl-CoA –  Oxy •  Hầu hết tế bào cần thiết phân áp oxy thấp •  anaerobic glycolysis •  Nồng độ oxy cao có thể gia tăng gốc O2 tự do Experimental Methods 2006 29 Hình dạng tế bào khi ni •  Hình dạng tế bào khi ni cấy ở 2 dạng chính: –  Phát triển huyền phù (như một tế bào đơn hay các cụm nhỏ tế bào) •  Dịng tế bào thu từ máu (leukaemia, lymphoma) –  Phát triển dạng monolayer bám dính vào dụng cụ ni •  Tế bào thu từ các mơ rắn (lungs, kidney), endothelial, epithelial, neuronal, fibroblasts Hela-Epithelial BAE1-Endothelial Experimental Methods 2006 MRC5-Fibroblast SHSY5Y-Neuronal 30 Nhiệt độ –  Nhiệt độ tối ưu phụ thuộc vào loài •  Nhiệt độ cơ thể mà tế bào được thu nhận •  Nhiệt độ của của vùng mô thu nhận tế bào (skin temperature may be lower than the rest of the body) Experimental Methods 2006 31 Kĩ thuật vô trùng •  Vi sinh vật là vấn đề nguy hại chính trong ni cấy tế bào •  Ngăn ngừa sự nhiễm: –  Kháng sinh –  Cải thiện điều kiện PTN –  Kĩ thuật vơ trùng •  Bề mặt sạch và gọn gàng •  Người “sạch” –  Rửa tay –  Nón, khẩu trang, găng tay •  Hóa chất và mơi trường •  Dụng cụ nuôi cấy Experimental Methods 2006 32 HẾT