BÀI NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Giải đông tế bào Tiến hành quan sát tế bào bình ni cấy trước mang ủ ta thấy: tế bào chưa bám dính vào đáy bình ni cấy mà cịn lơ lửng dịch ni cấy Thay đổi mơi trường Hình 2.1 Mơi trường ni cấy tế bào khi: cấy sau 24h nuôi cấy tế bào Hình 2.2 Quan sát tế bào KHV 10X 20X Kết - Môi trường đổi màu chất thải đẩy môi trường có hàm lượng acid cao ban đầu - Các tế bào bám dính, sinh sơi nhanh với mật độ dày đặc, nhiều tế bào xuất tua ( tua có tác dụng bám dính với bề mặt đáy bình ni cấy liên kết tế bào với thành mảng) Cấy chuyền đếm tế bào Kết sau 24 ni cấy tế bào trước cấy chuyền Hình 3.1 Tế bào sau 24h ni cấy, quan sát kính hiển vi vật kính 10X Các tế bào phát triển nhiều, đạt 80-90% có kết nối với Đếm tế bào: Hình 3.2 Buồng đếm tế bào quan sát kính hiển vi vật kính 4X Tế bào phân bố ô cần đếm không (do huyền phù không đều) - Mật độ tế bào bình ni cấy (M): M = (N/5).A.104 = 13.105 tế bào/mL ( Với: N = 322 (tổng số tế bào ô), A = (độ pha loãng)) - Để đạt dịch tế bào với mật độ 2.105(tb/mL), cần 1mL stock - 5.5mL môi trường nuôi cấy Ta cần flask với thể tích flask 3mL + flask mật độ 2.105 (tb/mL), cần mL dịch tế bào mL môi trường + flask mật độ 4.105(tb/mL), mL dịch tế bào mL môi trường 4 Đông lạnh tế bào Kết quan sát tế bào trước làm bong tế bào: Tế bào có mật độ cao, phân bố khơng nhìn chung ổn, khơng q thưa sát Tuy nhiên, có nhiều tế bào chết lên Hình 4.1 4.2 Quan sát tế bào vật kính 4X 10X - Nhận xét giải thích Tế bào phân bố khơng nguyên nhân do: Huyền phù chưa nên tế - bào cịn dính nhiều, chưa trãi tế bào bề mặt bình ni cấy Tế bào chết nhiều do: Mật độ tế bào cao làm ảnh hướng chất lượng sống tế bào, q trình thay mơi trường chưa cẩn thận, làm tế - bào tổn thương Đếm tế bào Xác định mật độ tế bào (M) bình ni cấy: M = (N/5).A.104 = 1.106 (tế bào/mL) (N = 258 (tổng số tế bào ô), A = (độ pha loãng)) - Ống falcon chứa mL dịch tế bào nên có tổng số tế bào 9.106 tế bào Để đạt dịch tế bào với mật độ 5.106(tế bào/mL), Ta hút mL dịch ly tâm Sau loại bỏ phần dịch thu phần sinh khối đáy thêm mL mơi trường đơng lạnh tế bào Hình Quan sát buồng đếm vật kính 4X Tế bào phân bố tương đối ô cần đếm - Vai trị số loại hóa chất: Dung dịch đệm PBS: dung dịch đẳng trương, dùng để rửa tế bào không làm - ảnh hưởng đến tế bào phát triển CO2 5% nuôi cấy tế bào động vật: Trong môi trường nuôi cấy có bổ sung chất thị màu phenol red Chất có tác dụng nhận biết lượng CO2 nội sinh bình ni cấy làm thay đổi màu mơi trường từ hồng sang vàng Do đó, CO2 nội sinh tăng cao ngồi thông qua nắp flask, đồng thời CO2 môi trường ngồi vào làm thay đổi pH mơi - trường ni cấy (có tính acid) => Dấu hiệu nhận biết nên thay môi trường Ủ 370C: nhiệt độ người Trypsin/EDTA enzyme cắt (tách) tế bào bám lên bề mặt đáy Trypsin enzyme protease, đóng vai trị enzyme cắt làm co tua tế bào dùng enzyme làm tăng hiệu tách so với - cách tách khác điều quan trọng khơng gây tổn thương cho tế bào DMSO giúp bảo quản tế bào, tránh tạo tinh thể đá làm ảnh hưởng đến màng tế bào, đóng băng bảo vệ dòng tế bào khỏi thay đổi trôi gene di truyền giảm thiểu nguy nhiễm bẩn ... ni cấy tế bào trước cấy chuyền Hình 3 .1 Tế bào sau 24h nuôi cấy, quan sát kính hiển vi vật kính 10 X Các tế bào phát triển nhiều, đạt 80-90% có kết nối với Đếm tế bào: Hình 3.2 Buồng đếm tế bào. .. tế bào cao làm ảnh hướng chất lượng sống tế bào, q trình thay mơi trường chưa cẩn thận, làm tế - bào tổn thương Đếm tế bào Xác định mật độ tế bào (M) bình ni cấy: M = (N/5).A .10 4 = 1. 106 (tế. .. (N/5).A .10 4 = 1. 106 (tế bào/ mL) (N = 258 (tổng số tế bào ô), A = (độ pha loãng)) - Ống falcon chứa mL dịch tế bào nên có tổng số tế bào 9 .10 6 tế bào Để đạt dịch tế bào với mật độ 5 .10 6 (tế bào/ mL), Ta hút