Công nghệ nuôi cấy tế bào sâm ngọc linh

TỐT G IỆP U GV D: BÙI VĂ T Ế VI MỤC LỤC IỆ V ỜI CẢ D U TỐT G IỆP Ơ SÁC CÁC BẢ G BIỂU DANH SÁCH CÁC HÌNH CHƢƠNG I ĐẶT V N ĐỀ 01 1.1 Đặt vấn đề 01 1.2 ục đích đề tài 02 CHƢƠNG II TỔNG QUAN 03 2.1 Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 0.3 2.1.1 hái niệm 03 2.1.2 Các kỹ thuật nuôi cấy 04 2.1.3 ôi tr ờn nuôi cấy 08 2.1.4 Các chất điều hòa sinh tr ởn thực vật 09 2.1.5 Các nhân tố đảm bảo thành côn tron nuôi cấy mô tế bào thực vật 11 2.2 Giới thiệu Sâm ọc inh 15 2.2.1 Phân loại 15 2.2.2 Đặc điểm hình thái 16 2.2.3 Sinh thái phân bố 18 2.2.4 iện trạn tiềm năn sâm ọc inh 19 2.2.5 Thành phần hóa học 20 CHƢƠNG III CÔNG NGHỆ NUÔI C Y TẾ BÀO SÂM NGỌC LINH 27 3.1 uôi cấy mô s o 27 3.1.1 uy n liệu 27 3.1.2 ôi tr ờn 27 3.1.3 Thiết b dụn cụ 27 3.1.4 óa chất 27 3.1.5 Qui trình thực 28 3.1.6 Điều kiện nuôi cấy 28 SVT : GUYỄ T Ị T U U TỐT G IỆP GV D: BÙI VĂ T Ế VI 3.2 Tái sinh ch i t mô s o 29 3.2.1 uy n liệu 29 3.2.2 ôi tr ờn 29 3.2.3 Thiết b dụn cụ 29 3.2.4 óa chất 29 3.2.5 Qui trình thực 29 3.2.6 Điều kiện nuôi cấy 29 3.3 uôi cấy rễ 30 3.3.1 uy n liệu 30 3.3.2 ôi tr ờn 30 3.3.3 Thiết b dụn cụ 30 3.3.4 óa chất 30 3.3.5 Qui trình thực 31 3.3.6 Điều kiện nuôi cấy 31 3.4 uôi cấy sinh khối 31 3.4.1 uy n liệu 31 3.4.2 ôi tr ờn 31 3.4.3 Thiết b dụn cụ 31 3.4.4 óa chất 32 3.4.5 Qui trình thực 32 3.4.6 Điều kiện nuôi cấy 32 3.5 Tái sinh qua đ ờn tạo phôi soma 33 3.5.1 uy n liệu 33 3.5.2 ôi tr ờn 33 3.5.3 Thiết b dụn cụ 33 3.5.4 óa chất 33 3.5.5 Qui trình thực 33 3.5.6 Điều kiện nuôi cấy 34 3.6 hảo sát điều kiện ảnh h ởn đến nuôi cấy Sâm ọc inh 35 3.6.1 hảo sát ảnh h ởn số loại chất khử trùn 35 3.6.2 hảo sát ảnh h ởn t h p hoocmon l n phát sinh hình thái 36 SVT : GUYỄ T Ị T U U TỐT G IỆP GV D: BÙI VĂ T Ế VI 3.6.3 Ảnh h ởn điều kiện chiếu sán l n khả năn tạo mô s o t 37 3.6.4 Ảnh h ởn kích th ớc mẫu cấy ban đầu l n tăn sinh mô s o 38 3.6.5 Ảnh h ởn au in l n khả năn khởi tạo mô s o t 39 3.6.6 Ảnh h ởn au in l n khả năn tăn sinh mô s o Sâm 3.6.7 Ảnh h ởn B ọc inh 40 đến khả năn tái sinh ch i t mô s o 41 3.6.8 Ảnh h ởn B l n trình tăn tr ởn ch i Sâm ọc inh invitro 43 3.6.9 Ảnh h ởn n n độ đ ờn đến khả năn tăn tr ởn ch i 43 3.6.10 Ảnh h ởn than hoạt tính đến khả năn tăn tr ởn ch i invitro 44 3.6.11 Ảnh h ởn I IB 3.6.12 Ảnh h ởn IB đến khả năn rễ bất đ nh t mô s o 45 đến khả năn nhân rễ bất đ nh 46 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 4.1 ết luận 48 4.2 iến n h 48 TÀI IỆU T P ẢO C SVT : GUYỄ T Ị T U U TỐT G IỆP GV D: BÙI VĂ T Ế VI DANH SÁCH CÁC BẢNG BIỂU Bản 2.1: Thời ian tối thiểu để hấp khử trùn môi tr ờn nuôi cấy mô 1210C 13 Bản 2.2: n độ thời ian sử dụn số chất lí mô cấy thực vật 14 Bản 2.3: àm l n số saponin sâm 20 Bản 2.4: àm l n saponin Sâm ọc inh so sánh với loài Panax spp tr n trọt 21 Bản 2.5: Các saponin yếu tron thành phần saponin dẫn chất protopana atriol 21 Bản 2.6: cid Oleanolic 22 Bản 2.7: Ocotillol 22 Bản 2.8: Các a id béo đ c tìm thấy 23 Bản 2.9: Thành phần acid amin chủ yếu 24 Bản 2.10: Các n uy n tố vi l n 25 Bản 3.1: Ảnh h ởn loại n n độ khử trùn 35 Bản 3.2: Ảnh h ởn t h p hoocmon l n phát sinh hình thái Sâm ọc inh cấy mô 36 Bản 3.3: Ảnh h ởn điều kiện chiếu sán l n khả năn tạo mô s o t 37 Bản 3.4: Ảnh h ởn kích th ớc mẫu cấy ban đầu l n tăn sinh mô s o 38 Bản 3.5: Ảnh h ởn au in l n khả năn khởi tạo mô s o t 39 Bản 3.6: Ảnh h ờn au in l n khả năn tăn sinh mô s o Sâm ọc inh 40 Bản 3.7: năn tái sinh ch i t mô s o tr n môi tr ờn b sun B S có 42 Bản 3.8: Ảnh h ởn B l n trình tăn tr ởn ch i Sâm ọc inh invitro 43 Bản 3.9: Ảnh h ởn n n độ đ ờn đến khả năn SVT : GUYỄ T Ị T U U TỐT G IỆP GV D: BÙI VĂ T Ế VI tăn tr ởn ch i 44 Bản 3.10: Ảnh h ởn than hoạt tính đến khả năn tăn tr ởn ch i invitro 44 Bản 3.11: Ảnh h ởn I IB đến khả rễ bất đ nh t mô s o 45 Bản 3.12: Ảnh h ởn IB đến khả năn nhân rễ mẫu có n u n ốc t môi tr ờn b sun Bản 3.13: Ảnh h ởn IB 47 đến khả năn nhân rễ mẫu có n u n ốc t môi tr ờn b sun IB 47 SVT : GUYỄ T Ị T U U TỐT G IỆP GV D: BÙI VĂ T Ế VI DANH SÁCH CÁC HÌNH ình 2.1: Sâm ọc inh n oài tự nhi n 15 Hình 2.2: ình thái Sâm ình 2.3: Cây Sâm ình 3.1: ọc inh 17 ô s o Sâm ình 3.2: Ch i Sâm ình 3.3: Rễ Sâm ọc inh 16 ọc inh 28 ọc inh 30 ọc inh 31 ình 3.4: uôi cấy tron Bioreactor 32 Hình 3.5: Phôi vô tính Sâm SVT : GUYỄ T Ị T U ọc inh 34 U TỐT G IỆP GV D: BÙI VĂ T Ế VI TÀI LIỆU THAM KHẢO D ơn Tấn hựt cộn Đề tài “ Hoạt chất saponin từ nguyên liệu nuôi cấy invitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”, Trun Tâm Sâm D uyễn Đức c iệu TP C n Th Thủy Ti n (2006) Công nghệ tế bào b Đ QG TP HCM uyễn ọc Dun b ôn hân iốn Sâm ọc inh bằn đ ờn sinh học hiệp uyễn ọc Duy (1995), Nhân giống Sâm Ngọc Linh đường sinh học kinh nghiệm trồng Nhân Sâm Khai Thành Triều Tiên, Nxb Nông hiệp uyễn Thanh Bình uyễn ọc Duy (1996) Thăm dò khả nhân giống vô tính phương pháp nuôi cấy mô invitro Sâm Ngọc Linh số dự án chuyên ngành lâm nghiệp Tr ờn Đại ọc ôn âm Tp HCM PGS TS Văn oàn Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Đại học Đà ẵn PGS TS Trần Văn inh (1994) Nuôi cấy mô tế bào thực vật Tr ờn Đại ọc Nông Lâm TP HCM Viện D c iệu, Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam (Tập II), Nxb KH & KT Vũ Văn Vụ Vũ Thanh Tâm oàn inh Tấn Sinh lý học thực vật, Nxb GD 10 http://www.nhasinhoctre.com/forum/viewtopic.php?f=47&t=4450 SVT : GUYỄ T Ị T U U TỐT G IỆP GV D: BÙI VĂ T Ế VI PHỤ LỤC  Thành phần môi trƣờng MS (Murashige Skoog, 1962): Khoáng đa lƣợng (mg l-1) NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCL2.2H2O 440 Mg2SO4.7H2O 370 KH2PO4.7H2O 170 Khoáng vi lƣợng KI H3BO4 (mg l-1) 0.83 6.2 MnSO4.4H2O 22.3 ZnSO4.7H2O 8.6 Na2MoO4.2H2O 0.25 CuSO4.5H2O 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 Na2.EDTA 27.8 Vitamin chất hữu khác (mg l-1) Myo-Inositol 100 Nicotinic acid 0.5 Pyridoxine HCl 0.5 Thiamine HCl 0.1 Glycine 2.0 SVT : GUYỄ T Ị T U KH LU N TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH CHƯƠNG I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Đặt vấn đề: Nhân sâm Panax ginseng C Meyer dược liệu sử dụng từ hàng ngàn năm Những tác dụng y học Nhân Sâm, dùng y học cổ truyền, chứng minh theo nguyên lý y học đại Nhân Sâm từ thuốc huyền thoại phương Đông xuất rộng rãi phương Tây, với sản phẩm thương mại đa dạng Nhân Sâm ngày thuốc mang lại giá trị kinh tế to lớn Việt Nam tự hào có loài Nhân Sâm đặc hữu Sâm Ngọc Linh (hay gọi Sâm Khu Năm) Panax vietnamensis Ha & Grutzv., biết đến giới với tên gọi Vietnamese ginseng Sâm Ngọc Linh có thành phần ginsenosid, dược chất Nhân sâm, đánh giá vào loại nhiều so với loài khác chi Panax giới Tuy nhiên, Sâm Ngọc Linh phát muộn (vào năm 1985) cho nên, có nhiều cố gắng để phát triển thuốc quý giá tiềm Sâm Ngọc Linh chưa hoàn toàn đánh thức Cộng với địa bàn phân bố hẹp (chỉ có vùng núi Ngọc Linh), lại bị khai thác bừa bãi, nên Sâm Ngọc Linh sớm đứng trước nguy tuyệt chủng Với nỗ lực địa phương có Sâm Ngọc Linh phân bố, loài dược liệu tránh bị tuyệt diệt Nhưng để đưa Sâm Ngọc Linh thành thuốc ngang hàng với loại Nhân sâm có thị trường dược liệu số lượng chất lượng, cần có nhiều nghiên cứu chuyên sâu ứng dụng sản xuất hiệu Trên giới, Nhân Sâm Panax ginseng C Meyer nhân giống sản xuất dược chất ginsenosid thành công nuôi cấy mô Ginsenosid chiết từ mô sẹo nuôi cấy mô Nhân sâm có dạng với ginsenosid thu từ rễ Nhân Sâm tự nhiên, tác dụng dược lý dịch chiết rượu methanol bột ginsenosid từ mô sẹo giống với dịch chiết bột thu từ rễ Nhân Sâm tự nhiên Do có hệ thống nuôi cấy lớn bioreactor dùng để sản xuất ginsenosid theo quy mô công nghiệp, cung cấp cho thị trường tiêu thụ ngày rộng lớn, khắc phục hạn chế canh tác Nhân Sâm như: thời gian trồng kéo dài, bị giới hạn khí hậu, thổ nhưỡng, nhiều sâu bệnh SVTH: NGUYỄN THỊ THU LU N TỐT NGHIỆP KH GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Sâm Ngọc Linh giới biết đến với tên gọi Vietnamese ginseng nhiều nhà khoa học quốc tế lưu ý nghiên cứu Việt Nam cần tự nghiên cứu sản xuất, cố gắng đánh thức giá trị y học giá trị kinh tế Sâm Ngọc Linh Trong hướng nghiên cứu, hướng nuôi cấy mô thật đưa nông nghiệp lên bước phát triển tiên tiến, muốn nghiên cứu đưa Sâm Ngọc Linh phát triển theo hướng đại, mang lại hiệu kinh tế cao bỏ qua kỹ thuật Thực tế, Sâm Ngọc Linh nhân giống thành công từ mô sẹo Nhưng tiến bước để sản xuất ginsenosid Sâm Ngọc Linh nuôi cấy mô chưa có nghiên cứu công bố Với mong muốn tìm hiểu loại trồng có giá trị kinh tế với công nghệ nuôi cấy tế bào thực nhằm mục đích nhân giống sản xuất hợp chất có giá trị kinh tế, thực khóa luận tốt nghiệp: “Công nghệ nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) hướng dẫn thầy Bùi Văn Thế Vinh 1.2 Mục đích đề tài: - Tổng quan Sâm Ngọc Linh - Tìm hiểu số công nghệ nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh SVTH: NGUYỄN THỊ THU LU N TỐT NGHIỆP KH GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH  Kết quả: Sâm Ngọc Linh xử lý HgCl2 với nồng độ 0.2 % thời gian 20 phút tỷ lệ nhiễm thấp (20%) tỷ lệ nhiễm không cao (80%) Còn xử lý Ca(OCl)2 với nồng độ 10%, thời gian phút tỷ lệ nhiễm thấp (10 %) tỷ lệ không nhiễm cao (90%) (Bảng 3.1) 3.6.2 Khảo sát ảnh h ởng tổ h p hoocmon ên phát sinh hình thái: Sử dụng mẫu mầm, thân, rễ Sâm Ngọc Linh Nuôi cấy phối hợp tổ hợp môi trường khác để đánh giá phát sinh hình thái Bảng 3.2: nh h ởng tổ h p hoocmon ên phát sinh hình thái Sâm Ngọc Linh cấy mô: Bộ Đối t phận ng Hoccmon cấy sinh hình thái IBA Sâm Ngọc Linh Kết phát IAA NAA K 2ip G 0.2 0.2 Chết 0.5 0.5 Chết 0.5 Callus Mầm, 0.2 0.5 Callus thân, rễ 0.5 0.25 Rễ 0.5 1 Phôi soma 0.5 0.5 Phôi chồi Rễ 0.5 Chồi  Kết quả: - Với tổ hợp hoocmon IB 0.5 + 2ip Sâm Ngọc Linh phát sinh phôi soma - Với tổ hợp hoocmon N + G phát sinh phôi chồi - Với tổ hợp hoocmon N + 2ip 0.5 phát sinh rễ SVTH: NGUYỄN THỊ THU 36 KH 3.6.3 LU N TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH nh h ởng điều kiện chiếu sáng ên khả tạo mô s o từ cuống á: Tùy theo loại mẫu cấy, ánh sáng cần không cần suốt thời gian tạo mô sẹo Đối với mẫu lá, đa số trường hợp tạo mô sẹo tối thường tốt sáng Tuy nhiên, số trường hợp mẫu cấy lại tạo mô sẹo tốt điều kiện sáng Môi trường tốt cho tạo mô sẹo ban đầu từ mẫu cuống dùng để khảo sát điều kiện chiếu sáng Mẫu đặt hai điều kiện tối hoàn toàn chiếu sáng (16 giờ/ ngày) Bảng 3.3: nh h ởng điều kiện chiếu sáng ên khả tạo mô s o từ cuống á: 2,4-D (mg/l) Bộ phận Phần trăm tạo mô s o (%) Chiếu sáng (16 gi / ngày) Tối hoàn toàn 20 30 90 80 90 90 3.0 80 80 0.5 100 100 100 100 100 100 100 100 0.5 1.0 2.0 1.0 2.0 Lá Cuống 3.0  Kết quả: Kết bảng 3.3 cho thấy tỷ lệ phát sinh mô sẹo mẫu cuống gần tương đương hai điều kiện chiếu sáng tối, lượng mô sẹo điều kiện tối chất lượng mô sẹo có tượng thủy tinh thể, môi trường có 3.0 mg/l 2,4-D SVTH: NGUYỄN THỊ THU 37 KH LU N TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 3.6.4 nh h ởng kích th ớc mẫu cấy ban đầu ên tăng sinh mô s o: Mô sẹo cắt theo ba kích thước: KT1, KT2, KT3 Mẫu mô sẹo với kích thước xác định cấy vào môi trường nhân nhanh Mô sẹo sau trình tăng sinh sử dụng cho trình tái sinh chồi rễ bất định Bảng 3.4: nh h ởng kích th ớc mẫu cấy ban đầu ên tăng sinh mô s o: Chỉ tiêu quan sát Trọng lượng tươi ban đầu (mg) Kích thước (cm) Sinh khối sau tuần nuôi cấy Trọng lượng tươi (mg) Trọng lượng khô (mg) Tỷ lệ chất khô ( %) Tỷ lệ tăng sinh khối khô KT1 KT2 KT3 (0.5*0.5) (0.7*0.7) (1.0*1.0) 147 267 ± 18 576 ± 24 1.1*0.9 1.4*1.0 1.6*1.2 667 ± 45 804 ± 35 1505 ± 66 53.9 ± 36 57.8 ± 2.5 102.8 ± 4.5 8.08 7.19 6.83 5.46 3.22 2.65  Kết quả: Kích thước mẫu cấy yếu tố quan trọng nhân giống invitro Khi khảo sát ảnh hưởng kích thước mẫu cấy ban đầu lên tăng sinh mô sẹo, ta nhận thấy kích thước nhỏ (KT1) cho hiệu tốt tỷ lệ tăng sinh khối lẫn trọng lượng khô, khác biệt nhiều khả tăng sinh KT2 KT3 (Bảng 3.4) Sự tương quan bắt nguồn từ tương quan kích thước mẫu cấy - khả thu nhận dinh dưỡng từ môi trường ảnh hưởng chất thải nội sinh mô sẹo trình nuôi cấy SVTH: NGUYỄN THỊ THU 38 KH LU N TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 3.6.5 nh h ởng auxin ên khả khởi tạo mô s o từ cuống á: Những nghiên cứu có đối tượng thuộc chi Panax cho thấy giai đoạn khởi tạo mô sẹo thường có kết hợp cytokinin auxin Mẫu cuống sau khử trùng cấy vào môi trường MS bổ sung 0.2 mg/l TDZ loại auxin 2,4-D, IBA, N , với nồng độ thay đổi từ 0.5; 1.0; 2.0 3.0 mg/l Mẫu đặt ngửa mặt môi trường cuống đặt ngửa (Vết cắt hướng lên trên) Bảng 3.5: nh h ởng auxin ên khả khởi tạo mô s o từ cuống á: Auxin Nồng độ auxin ( mg/ ) 2,4-D IBA NAA Tỷ ệ tạo mô s o (%) Cuống Lá 0.5 100 20 1.0 100 90 2.0 100 90 3.0 100 80 0.5 0 1.0 0 2.0 0 3.0 0 0.5 0 1.0 0 2.0 0 3.0 0  Kết quả: Kết thu sau tuần nuôi cấy ghi nhận bảng 3.5 Trong ba loại auxin bổ sung vào môi trường có 2,4-D có khả kích thích cuống tạo mô sẹo Trên môi trường bổ sung 1.0 mg/l 2,4-D, mẫu cấy có tỷ lệ hình thành mô sẹo cao (Đạt 90 % 100 % cuống lá), có lượng sẹo hình thành nhiều nhất, cấu trúc có màu vàng sáng SVTH: NGUYỄN THỊ THU 39 nồng độ 3.0 KH LU N TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH mg/l 2,4-D, mô sẹo bắt đầu có tượng thủy tinh thể Do đó, nồng độ 2,4-D từ 3.0 mg/l trở lên không phù hợp cho phát sinh mô sẹo 3.6.6 nh h ởng auxin ên khả tăng sinh mô s o Sâm Ngọc Linh: Các mẩu mô sẹo tạo từ giai đoạn khởi tạo cấy vào môi trường MS bổ sung 0.2 mg/l TDZ loại auxin 2,4-D, IB N với nồng độ thay đổi từ 0.5; 1.0; 2.0; 3.0 5.0 mg/l điều kiện chiếu sang 16 giờ/ ngày Bảng 3.6: nh h ng auxin ên khả tăng sinh mô s o Sâm Ngọc Linh: Sinh khối sau tuần nuôi cấy Trọng Auxin Nồng độ (mg/l) ng t ban đầu (mg) 2,4-D IBA NAA Tỷ ệ tăng i Trọng t ng i (mg) Trọng Tỷ ệ sinh chất khô khối (mg/l) (%) khô ng khô 0.5 203 ± 16 584 ± 34 43.3 ± 2.5 7.42 3.18 1.0 212 ± 14 809± 37 66.2 ± 3.0 8.18 4.56 2.0 204 ± 17 711 ± 32 52.4 ± 2.4 7.37 3.73 3.0 205 ± 508 ± 24 36.6 ± 2.2 7.21 2.65 5.0 201 ± 13 493 ± 38 34.6 ± 1.7 7.01 2.50 0.5 197 ± 18 474 ± 23 45.6 ± 2.2 9.62 3.45 1.0 203 ± 19 532 ± 29 48.6 ± 2.7 9.14 3.56 2.0 207 ± 13 631 ± 32 49.5 ± 2.5 7.84 3.63 3.0 203 ± 15 552± 26 41.1 ± 1.9 7.45 3.10 5.0 209 ± 12 531 ± 23 35.3 ± 1.5 6.66 2.53 0.5 218 ± 485 ± 13 41.2 ± 1.1 8.49 2.81 1.0 212 ± 14 548 ± 21 45.0 ± 1.8 8.22 3.33 2.0 206 ± 15 588 ± 18 46.6 ± 1.4 7.92 3.37 3.0 199 ± 602 ± 32 45.7 ± 2.4 7.60 3.38 5.0 205 ± 14 720 ± 48 51.6 ± 3.4 7.20 3.77 SVTH: NGUYỄN THỊ THU 40 KH LU N TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH  Kết quả: Bảng 3.6 cho thấy sau trình tăng sinh, mô sẹo nuôi cấy môi trường có 0.5 mg/l IB có tỷ lệ chất khô cao 9.62 % tỷ lệ tăng sinh khối khô cao 4.56 lần lại thu mô sẹo môi trường có 2,4-D nồng độ 1.0 mg/l Có thể kết hợp auxin cytokinin làm tăng khả thu nhận đường chất dinh dưỡng khác từ môi trường mô sẹo kéo theo tăng sinh mô sẹo, đặc biệt tăng tỷ lệ chất khô IB auxin kích thích thu nhận dinh dưỡng từ môi trường kết hợp với TDZ tốt so với N 2,4-D Kết tỷ lệ chất khô mô sẹo nuôi cấy môi trường có IB ba loại auxin sử dụng Tuy IB cao cho tỷ lệ mô sẹo có tỷ lệ chất khô cao 2,4-D có tỷ lệ tăng sinh khối khô cao (Gấp 4.56 lần) có tỷ lệ chất khô tương đối cao (8.18 %) Mặt khác, mô sẹo môi trường 2,4-D có hình thái tốt nhất, dạng mô sẹo có khả tái sinh cao 3.6.7 nh h ởng BA NAA đến khả tái sinh chồi từ mô s o: Các mô sẹo thu thí nghiệm nhân nhanh mô sẹo tách chuyển vào môi trường ½ MS có bổ sung B N với nồng độ bảng 3.6  Kết quả: Tỷ lệ auxin cytokinin đóng vai trò cần thiết cho tái sinh chồi, cytokinin thường thúc đẩy hình thành chồi trình thường kích thích bổ sung auxin với nồng độ thấp Trong thử nghiệm, sử dụng B hợp với N 1.0 mg/l B kết nhận thấy tổ hợp N 1.0 mg/l N khác nhau, kết hợp cho số chồi đạt cao 6.3 chồi/ mẫu trọng lượng trung bình 0.185 g (Bảng 3.7) SVTH: NGUYỄN THỊ THU B kết 41 KH LU N TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Bảng 3.7: Khả tái sinh chồi từ mô s o môi tr ng MS có bổ sung BA NAA: BA (mg/l) 0.5 1.0 2.0 4.0 NAA (mg/l) Số ng chồi/ mẫu Trọng ng chồi (g) 0.5 5.0 0.106 1.0 6.1 0.141 1.5 4.6 0.193 2.0 3.3 0.197 2.5 3.0 0.094 0.5 5.5 0.163 1.0 6.3 0.185 1.5 5.9 0.158 2.0 3.9 0.148 2.5 3.7 0.157 0.5 4.2 0.152 1.0 5.5 0.141 1.5 2.9 0.144 2.0 2.8 0.112 2.5 2.7 0.108 0.5 3.3 0.154 1.0 3.0 0.122 1.5 2.6 0.122 2.0 0.8 0.108 2.5 0 SVTH: NGUYỄN THỊ THU 42 LU N TỐT NGHIỆP KH GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 3.6.8 nh h ởng BA ên trình tăng tr ởng chồi Sâm Ngọc Linh invitro: Những chồi tốt sau thu nhận tách chuyển vào môi trường ½ MS có bổ sung 1.0 g/l than hoạt tính, 30 g/l sucrose, 0.5 mg/l N BA ( 0.5; 1.0; 2.0; 4.0 mg/l) Bảng 3.8: nh h ởng BA ên trình tăng tr ởng chồi Sâm Ngọc Linh invitro: BA (mg/l) Trọng ng t i (g) Chiều cao chồi (cm) Số ng á/ chồi 0.5 0.61 5.66 3.0 1.0 0.87 6.16 3.3 2.0 0.72 4.11 4.0 4.0 0.71 4.33 3.9  Kết quả: Trong nồng độ B mg/l N đươc sử dụng, nồng độ 1.0 mg/l B kết hợp với 0.5 cho kết tăng trưởng chồi chốt với trọng lượng tươi chồi 0.87 g chiều cao chồi 6.16 cm (Bảng 3.8) Vậy môi trường nuôi cấy có bổ sung 1.0 mg/l B 0.5 mg/l tốt cho trình tăng trưởng chồi 3.6.9 nh h ởng nồng độ đ ng đến khả tăng tr ởng chồi: Những chồi tốt thí nghiệm tách cấy chuyền sang môi trường ½ MS có bổ sung 0.5 mg/l N , 1.0 mg/l B , pH 5.7 đường với nồng độ đường 10; 20; 30; 40; 50; 60 g/l  Kết quả: Qua kết thử nghiệm cho thấy sucrose carbohydrate hào tan chiếm ưu nồng độ thường dùng nằm khoảng 30 - 120 g/l sucrose Nghiên cứu ảnh hưởng sucrose lên tăng trưởng chồi Sâm Ngọc Linh sau 90 ngày nuôi cấy cho thấy việc bổ sung sucrose vào môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng tích cực lên sinh trưởng chồi Sự gia tăng nồng độ sucrose môi trường kích thích sinh trưởng chồi Sâm Ngọc Linh mà có tác dụng mạnh đến biến đổi SVTH: NGUYỄN THỊ THU 43 LU N TỐT NGHIỆP KH GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH khối lượng chúng Nồng độ 50 g/l sucrose cho kết tốt trọng lượng, chiều cao số lượng (Bảng 3.9) Bảng 3.9: nh h ởng nồng độ đ Sucrose (g/l) Trọng ng chồi (g) ng đến khả tăng tr ởng chồi: Chiều cao chồi (cm) Số ng á/ chồi 10 0.49 4.4 2.2 20 0.55 5.4 2.5 30 0.68 5.7 2.6 40 1.06 5.8 3.2 50 1.46 6.1 3.5 60 1.28 6.1 3.2 3.6.10 nh h ởng than hoạt tính đến khả tăng tr ởng chồi invitro: Những chồi tốt thí nghiệm tách cấy chuyền sang môi trường ½ MS có bổ sung 0.5 mg/l N , 1.0 mg/l B , pH 5.7 với nồng độ than hoạt tính 1.0; 2.0; 3.0 4.0 g /l Bảng 3.10: nh h ởng than hoạt tính đến khả tăng tr ởng chồi invitro: Than hoạt tính (g/l) Trọng ng chồi (g) Chiều cao chồi (cm) Số ng á/ chồi 0.53 3.3 3.6 1.0 0.61 4.6 3.7 2.0 1.01 5.3 3.3 3.0 0.97 6.8 2.7 4.0 0.94 8.5 3.1  Kết quả: Than hoạt tính chất điều hòa sinh trưởng thưc vật, có khả thay đổi thành phần môi trường Than hoạt tính điều chỉnh pH môi SVTH: NGUYỄN THỊ THU 44 LU N TỐT NGHIỆP KH GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH trường, hấp thụ chất làm cản trở phát triển mô Kết thu cho thấy nồng độ than hoạt tính tăng có thay đổi r rệt trọng lượng chiều cao chồi, số lượng thay đổi đáng kể Trọng lượng chồi đạt cao môi trường chứa 2.0 g/l than hoạt tính khoảng 1.01 g/chồi, tăng 1.9 lần so vời đối chứng (Bảng 3.10) Vậy nồng độ 2.0 g/l than hoạt tính phù hợp cho qúa trình tăng sinh chồi Sâm Ngọc Linh 3.6.11 nh h ởng IAA IBA NAA đến khả r bất định từ mô s o: Mô sẹo cấy vào môi trường rễ có chứa auxin (N , IB , I )ở nồng độ 1.0; 3.0; 5.0; 7.0 mg/l Bảng 3.11: nh h ởng IAA IBA NAA đến khả r bất định từ mô s o: Auxin NAA IAA IBA Tỷ ệ r ( mg/l) (%) r / mẫu 1.0 30 3.0 ± 0.3 5.98 18 3.0 100 8.7 ± 0.1 21.88 13 5.0 70 2.6 ± 0.1 6.23 7.0 50 2.1 ± 0.1 12.21 1.0 3.0 5.0 10 7.0 1.0 70 1.6 ± 0.1 7.83 16 3.0 80 4.0 ± 0.3 5.21 21 5.0 100 4.8 ± 0.3 15.81 18 7.0 60 3.5 ± 0.1 8.06 1.7 SVTH: NGUYỄN THỊ THU Số ng Tỷ ệ khối Nồng độ ng r / mẫu (%) Chiều dài tối đa r (mm) 0.2 ± 0.2 45 KH LU N TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH  Kết quả: Quá trình khảo sát ảnh hưởng ba loại auxin trên, ta nhận thấy IAA không thích hợp cho trình rễ Sâm Ngọc Linh từ mô sẹo auxin không kích thích mô sẹo rễ bất định N IB ngược lại Nồng độ 3.0 mg/l N cho kết tố với tỷ lệ rễ lên đến 100 %, số lượng rễ/ mẫu lớn (8.7 rễ/ mẫu), tỷ lệ khối lượng rễ / mẫu lớn (21.88 %), chiều dài tối đa rễ 13 mm (Bảng 3.11) IB nồng độ 5.0 mg/l cho tỷ lệ rễ đạt 100 %, Số lượng rễ trung bình/ mẫu 4.8 mẫu, tỷ lệ khối lượng 15.81 % chiều dài tối đa rễ 18 mm Kết giải thích auxin tổng hợp có hoạt tính cao dạng tự nhiên Vậy hai môi trường kích thích rễ tốt môi trường Ms ½ bổ sung 3.0 mg/l N môi trường MS ½ bổ sung mg/l IB 3.6.12 nh h ởng IBA NAA đến khả nhân r bất định: RỄ bất định sau tạo thí nghiệm tách cấy chuyền sang môi trường nhân rễ có bổ sung auxin N , IB nồng độ 1.0; 3.0; 5.0 mg/l  Kết quả: Từ kết bảng 3.12 bảng 3.13 cho thấy nguồn gốc mẫu rễ có ảnh hưởng lớn đến hiệu nhân rễ Mẫu rễ bảng 3.12 có khả nhân rễ tốt hơn, nghiệm thức rễ, tỷ lệ rễ cao 60 %, số rễ thứ cấp cao rễ/ mẫu Mẫu rễ bảng 3.13 có tỷ lệ rễ cao 40 %, số rễ thứ cấp cao rễ/ mẫu, có nghiệm thức rễ mẫu lại cấy môi trường chứa N Khi xét đến ảnh hưởng loại auxin, ta thấy N trình nhân rễ bất định Sâm Ngọc Linh phù hợp với nồng độ 5.0 mg/l N A kích thích nhân rễ tốt (60 %), có số rễ thứ cấp nhiều (9 rễ/ mẫu) mẫu tăng trọng cao (Trọng lượng tươi trung bình 390 ± 20 mg/l, tăng 3.5 lần so với ban đầu) Hơn nữa, có tới 5/6 nghiệm thức bổ sung N nghiệm thức Vậy IB khơi tạo rễ từ mô sẹo N N cho kết rễ so với IB ,N nồng độ 3.0 mg/l phù hợp cho việc nồng độ 5.0 mg/l phù hợp cho trình nhân rễ bất định Sâm Ngọc Linh SVTH: NGUYỄN THỊ THU có 4/6 46 LU N TỐT NGHIỆP KH GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Bảng 3.12: nh h ởng IBA NAA đến khả nhân r mẫu có nguồn gốc từ môi tr ng bổ sung NAA: Trọng ng t NAA IBA Tỷ ệ r Số r thứ (mg/l) (mg/l) (%) cấp - 20 140 ± 10 - 30 290 ± 10 - 60 390 ± 20 - 10 450 ± 50 - 20 330 ± 20 - 30 280 ± 30 i trung bình (mg/l) Bảng 3.13: nh h ởng IBA NAA đến khả nhân r mẫu có nguồn gốc từ môi tr ng bổ sung IBA: Trọng ng t NAA IBA Tỷ ệ r Số r thứ (mg/l) (mg/l) (%) cấp - 40 350 ± 10 - 20 180 ± 30 - 0 - 10 - 0 - 0 SVTH: NGUYỄN THỊ THU 47 bình (mg/l) 270 ± 10 i trung LU N TỐT NGHIỆP KH GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết uận - Sâm Ngọc Linh công nhận Sâm có hàm lượng saponin cao với số lượng nhiều nhất, so với loài Panax khác giới Do việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật mang lại nhiều ý nghĩa thực tiễn việc bảo tồn nguồn dược liệu quý giá - Quá trình khảo sát ảnh hưởng loại nồng độ auxin lên khả tạo mô sẹo ban đầu cuống cho thấy nồng độ 3.0 mg/l 2.4-D trở lên không phù hợp cho phát sinh mô sẹo từ Sâm Ngọc Linh - Trong giai đoạn tăng trưởng chồi, số chồi tái sinh từ mô sẹo đạt cao môi trường ½ MS bổ sung 1.0 mg/l B , 1.0 mg/l N - , 50 g/l sucrose Đối với trình rễ từ mô sẹo, mẫu mô sẹo nuôi cấy môi trường ½ MS có bổ sung 3.0 mg/l N cho tỷ lệt rễ cao nhất, số lượng rễ nhiều tỷ lệ trọng lượng tươi rễ/ mẫu cao - Môi trường ½ MS có bổ sung 5.0 mg/l N kích thích nhân rễ tốt nhất, cho tỷ lệ rễ cao rễ phân nhánh nhiều 4.2 Kiến nghị: - Được giới ghi nhận loài Sâm quý bậc nhất, đến Sâm Ngọc Linh chưa biết đến nhiều loài Sâm Hàn Quốc hay Sâm Triều Tiên - Việc nghiên cứu tạo nguồn nguyên liệu loài Sâm giới nhiều tác giả tiến hành nhiều năm, Việt Nam kh ng định tính thực khả tạo nguồn Sâm đường nuôi cấy mô tế bào Nhưng cần nhiều nghiên cứu loài Sâm Ngọc Linh Việt Nam để Việt Nam chủ động nguồn nguyên dược liệu quý, đồng thời đưa thương hiệu Sâm Việt Nam mang tầm quốc tế - Là loài Sâm đặc hữu tìm thấy với số lượng phạm vi phân bố hẹp, nhạy cảm với môi trường sống, nguồn cung cấp hạn chế, thời gian từ SVTH: NGUYỄN THỊ THU 48 KH LU N TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH lúc trồng từ hạt thu củ lên đến 5-6 năm Do đó, nguồn Sâm Ngọc Linh cạn kiệt dần nguy tuyệt chủng cao, nên cần có nhiều biện pháp cấp bách để bảo tồn phát triển nguồn tài nguyên thiên nhiên quốc gia SVTH: NGUYỄN THỊ THU 49 KH LU N TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THU GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 50 [...]... dưỡng Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trong môi trường đặc biệt và tăng sinh khối Mỗi loại cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy khác nhau Yêu cầu dinh dưỡng cho nuôi cấy tế bào đơn khá phức tạp, do chúng bị mất nhiều chất cần thiết cho sinh trưởng khi tách rời khỏi quần thể tế bào  Nuôi cấy tế bào đơn được sử dụng cho các mục đích: - Chọn dòng tế bào - Nghiên cứu cấu trúc tế bào, ... II TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.1 Khái niệm Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật ( tế bào đơn, mô, cơ quan ) trong điều kiện vô trùng  Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên hai nguyên tắc: - Dựa vào tính toàn năng của tế bào: Mỗi một tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát... triển và phân hóa tế bào trong những điều kiện khác nhau - Thu nhận các chất trao đổi thứ cấp 2.1.2.6 Nuôi cấy protop ast Tế bào trần là tế bào đã được tách bỏ thành tế bào bằng phương pháp cơ học hay sử dụng enzyme Trong điều kiện nuôi cấy phù hợp protoplast có thể tái sinh thành tế bào mới, phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh Ưu thế của kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào trần là tế bào không có màng... cây Sâm Ngọc Linh 2.2.1 Phân oại  Lịch s phân oại: Việt Nam có nhiều cây thuốc được gọi là Sâm Nhưng chỉ có bốn loài Sâm thuộc họ Nhân Sâm (Araliaceae) Chi Panax gần gũi với cây Nhân Sâm Panax gingseng C A Meyer là Sâm Ngọc Linh, Sâm Tam Thất, Sâm Nam và Sâm Vũ Diệp, đều là các cây thuốc quý Năm 1968, KS Vũ Đức Minh đã tìm thấy cây Sâm Ngọc Linh tại vùng núi Ngọc Linh và tạm đặt tên nó là Sâm Khu 5 Năm... minh môi trường nuôi cấy tế bào thực vật - 1964: Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà rốt - 1969: Phân lập tế bào trần từ nuôi cấy tế bào dịch lỏng (huyền phù) của Hapopappus gracilis - 1973: Phát hiện Cytokinin có khả năng phá ngủ ở Gerberas - 1978: Marton và cộng sự xây dựng quy trình chuyển gen vào tế bào trần - 1983: Công ty Mitsui... bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn nhiều so với các tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy bị nhiễm bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày sẽ phủ đầy vi khuẩn hoặc nấm, khi đó mô nuôi cấy sẽ chết dần thí nghiệm phải bỏ đi Mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi rất nghiêm ngặt, đặc biệt quan trọng trong nuôi cấy tế bào đơn trong các bioreactor Nhiều loại protein,... làm cho những tế bào này trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng - tế bào phôi và quá trình đó gọi là quá trình phản biệt hóa Vì vậy những tế bào càng gần với trạng thái của tế bào phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu  ngh a: - Nhân nhanh giống cây trồng - Bảo quản nguồn gen - Tạo cây sạch bệnh - Sản xuất các hoạt chất sinh học - Mang tính công nghiệp S... trường nuôi cấy là xem xét các thành phần cần cho sự sinh trưởng và phát triển của cây Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm thì thành phần môi trường cũng sẽ thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy Tế bào mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong nuôi cấy. .. chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi Mỗi tế bào là một hệ thống mở, tự duy trì và tự sản xuất để tiến hành các chức năng chuyên biệt và sản sinh thế hệ tế bào mới nếu cần thiết - Dựa vào khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào: Biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho đến khi thể hiện một chức năng nào đó Các tế bào dùng trong môi trường cấy đều có khả năng biệt hóa về cấu... tuổi của Sâm  Đặc đi m phân bố: Trong số hơn mười loài và dưới loài đã biết của chi Nhân Sâm (Panax), ở Việt Nam có ba loài mọc tự nhiên và một loài là cây nhập trồng Sâm Ngọc Linh được phát hiện sau cùng vào 1973 Đến 1985 nó mới được công bố là hoàn toàn mới đối với khoa học Đến nay Sâm Ngọc Linh chỉ mới được phát hiện duy nhất ở vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum Ngọc Linh là ... giá trị kinh tế với công nghệ nuôi cấy tế bào thực nhằm mục đích nhân giống sản xuất hợp chất có giá trị kinh tế, thực khóa luận tốt nghiệp: Công nghệ nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis... Sâm Ngọc Linh - Tìm hiểu số công nghệ nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh SVTH: NGUYỄN THỊ THU LU N TỐT NGHIỆP KH GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH CHƯƠNG II TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào. .. thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật mô tả phương pháp nuôi cấy phận thực vật ( tế bào đơn, mô, quan ) điều kiện vô trùng  Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa hai nguyên tắc: - Dựa vào tính toàn tế bào: