Công nghệ nuôi cấy tế bào sâm ngọc linh

Trong các hướng nghiên cứu, hướng nuôi cấy mô đã thật sự đưa nông nghiệp lên bước phát triển tiên tiến, vì vậy muốn nghiên cứu đưa cây Sâm Ngọc Linh phát triển theo hướng hiện đại, mang

MỤC LỤC

IỆ V U TỐT G IỆP

ỜI CẢ Ơ

D SÁC CÁC BẢ G BIỂU

DANH SÁCH CÁC HÌNH

CHƯƠNG I ĐẶT V N ĐỀ 01

1.1 Đặt vấn đề 01

1.2 ục đích của đề tài 02

CHƯƠNG II TỔNG QUAN 03

2.1 Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 0.3 2.1.1 hái niệm 03

2.1.2 Các kỹ thuật nuôi cấy 04

2.1.3 ôi tr ờn nuôi cấy 08

2.1.4 Các chất điều hòa sinh tr ởn thực vật 09

2.1.5 Các nhân tố đảm bảo thành côn tron nuôi cấy mô tế bào thực vật 11

2.2 Giới thiệu cây Sâm ọc inh 15

2.2.1 Phân loại 15

2.2.2 Đặc điểm hình thái 16

2.2.3 Sinh thái và phân bố 18

2.2.4 iện trạn và tiềm năn của cây sâm ọc inh 19

2.2.5 Thành phần hóa học 20

CHƯƠNG III CÔNG NGHỆ NUÔI C Y TẾ BÀO SÂM NGỌC LINH 27

3.1 uôi cấy mô s o 27

3.1.1 uy n liệu 27

3.1.2 ôi tr ờn 27

3.1.3 Thiết b và dụn cụ 27

3.1.4 óa chất 27

3.1.5 Qui trình thực hiện 28

3.1.6 Điều kiện nuôi cấy 28

3.2 Tái sinh ch i t mô s o 29

3.2.1 uy n liệu 29

3.2.2 ôi tr ờn 29

3.2.3 Thiết b và dụn cụ 29

3.2.4 óa chất 29

3.2.5 Qui trình thực hiện 29

3.2.6 Điều kiện nuôi cấy 29

3.3 uôi cấy rễ 30

3.3.1 uy n liệu 30

3.3.2 ôi tr ờn 30

3.3.3 Thiết b và dụn cụ 30

3.3.4 óa chất 30

3.3.5 Qui trình thực hiện 31

3.3.6 Điều kiện nuôi cấy 31

3.4 uôi cấy sinh khối 31

3.4.1 uy n liệu 31

3.4.2 ôi tr ờn 31

3.4.3 Thiết b và dụn cụ 31

3.4.4 óa chất 32

3.4.5 Qui trình thực hiện 32

3.4.6 Điều kiện nuôi cấy 32

3.5 Tái sinh cây qua con đ ờn tạo phôi soma 33

3.5.1 uy n liệu 33

3.5.2 ôi tr ờn 33

3.5.3 Thiết b và dụn cụ 33

3.5.4 óa chất 33

3.5.5 Qui trình thực hiện 33

3.5.6 Điều kiện nuôi cấy 34

3.6 hảo sát các điều kiện ảnh h ởn đến nuôi cấy Sâm ọc inh 35

3.6.1 hảo sát ảnh h ởn của một số loại chất khử trùn 35

3.6.2 hảo sát ảnh h ởn của các t h p hoocmon l n sự phát sinh hình thái 36

3.6.3 Ảnh h ởn của điều kiện chiếu sán l n khả năn tạo mô s o t lá và cuốn

lá 37

3.6.4 Ảnh h ởn của kích th ớc mẫu cấy ban đầu l n sự tăn sinh mô s o 38

3.6.5 Ảnh h ởn của au in l n khả năn khởi tạo mô s o t lá và cuốn lá 39

3.6.6 Ảnh h ởn của au in l n khả năn tăn sinh mô s o Sâm ọc inh 40

3.6.7 Ảnh h ởn của B và đến khả năn tái sinh ch i t mô s o 41

3.6.8 Ảnh h ởn của B l n quá trình tăn tr ởn ch i Sâm ọc inh invitro 43

3.6.9 Ảnh h ởn của n n độ đ ờn đến khả năn tăn tr ởn ch i 43

3.6.10 Ảnh h ởn của than hoạt tính đến khả năn tăn tr ởn ch i invitro 44

3.6.11 Ảnh h ởn của I IB đến khả năn ra rễ bất đ nh t mô s o 45

3.6.12 Ảnh h ởn của IB và đến khả năn nhân rễ bất đ nh 46

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

4.1 ết luận 48

4.2 iến n h 48

TÀI IỆU T ẢO P C

DANH SÁCH CÁC BẢNG BIỂU

Bản 2.1: Thời ian tối thiểu để hấp khử trùn môi tr ờn nuôi

cấy mô ở 1210C 13

Bản 2.2: n độ và thời ian sử dụn 1 số chất ử lí mô cấy thực vật 14

Bản 2.3: àm l n một số saponin chính trong sâm 20

Bản 2.4: àm l n saponin của Sâm ọc inh so sánh với các loài Panax spp tr n trọt 21

Bản 2.5: Các saponin chính yếu tron thành phần saponin dẫn chất protopana atriol 21

Bản 2.6: cid Oleanolic 22

Bản 2.7: Ocotillol 22

Bản 2.8: Các a id béo đ c tìm thấy 23

Bản 2.9: Thành phần acid amin chủ yếu 24

Bản 2.10: Các n uy n tố vi l n 25

Bản 3.1: Ảnh h ởn của các loại n n độ khử trùn 35

Bản 3.2: Ảnh h ởn của các t h p hoocmon l n sự phát sinh hình thái của Sâm ọc inh cấy mô 36

Bản 3.3: Ảnh h ởn của điều kiện chiếu sán l n khả năn tạo mô s o t lá và cuốn lá 37

Bản 3.4: Ảnh h ởn của kích th ớc mẫu cấy ban đầu l n sự tăn sinh mô s o 38

Bản 3.5: Ảnh h ởn của au in l n khả năn khởi tạo mô s o t lá và cuốn lá 39

Bản 3.6: Ảnh h ờn của au in l n khả năn tăn sinh mô s o Sâm ọc inh 40

Bản 3.7: hả năn tái sinh ch i t mô s o tr n môi tr ờn S có b sun B và 42

Bản 3.8: Ảnh h ởn của B l n quá trình tăn tr ởn ch i Sâm ọc inh invitro 43

Bản 3.9: Ảnh h ởn của n n độ đ ờn đến khả năn

tăn tr ởn ch i 44 Bản 3.10: Ảnh h ởn của than hoạt tính đến khả năn tăn

tr ởn ch i invitro 44

Bản 3.11: Ảnh h ởn của I IB đến khả năng

ra rễ bất đ nh t mô s o 45 Bản 3.12: Ảnh h ởn của IB và đến khả năn nhân rễ

của mẫu có n u n ốc t môi tr ờn b sun 47 Bản 3.13: Ảnh h ởn của IB và đến khả năn nhân rễ

của mẫu có n u n ốc t môi tr ờn b sun IB 47

DANH SÁCH CÁC HÌNH

ình 2.1: Sâm ọc inh n oài tự nhi n 15

Hình 2.2: ình thái Sâm ọc inh 16

ình 2.3: Cây Sâm ọc inh 17

ình 3.1: ô s o Sâm ọc inh 28

ình 3.2: Ch i Sâm ọc inh 30

ình 3.3: Rễ Sâm ọc inh 31

ình 3.4: uôi cấy tron Bioreactor 32

Hình 3.5: Phôi vô tính Sâm ọc inh 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 D ơn Tấn hựt và cộn sự Đề tài “ Hoạt chất saponin từ các nguyên liệu

nuôi cấy invitro của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”,

Trun Tâm Sâm và D c iệu TP C

2 uyễn Đức n Th Thủy Ti n (2006) Công nghệ tế bào b Đ QG

TP HCM

3 uyễn ọc Dun hân iốn Sâm ọc inh bằn con đ ờn sinh học

b ôn hiệp

4 uyễn ọc Duy (1995), Nhân giống Sâm Ngọc Linh bằng con đường sinh

học và kinh nghiệm trồng Nhân Sâm ở Khai Thành Triều Tiên, Nxb Nông

hiệp

5 uyễn Thanh Bình uyễn ọc Duy (1996) Thăm dò khả năng nhân giống

vô tính bằng phương pháp nuôi cấy mô invitro cây Sâm Ngọc Linh và một số cây trong dự án chuyên ngành lâm nghiệp Tr ờn Đại ọc ôn âm Tp

PHỤ LỤC

 Thành phần môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962):

Khoáng đa lượng (mg l -1 )

NH4NO3 1650

KNO3 1900

CaCL2.2H2O 440

Mg2SO4.7H2O 370

KH2PO4.7H2O 170

Khoáng vi lượng (mg l -1 ) KI 0.83 H3BO4 6.2 MnSO4.4H2O 22.3 ZnSO4.7H2O 8.6 Na2MoO4.2H2O 0.25 CuSO4.5H2O 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 Na2.EDTA 27.8 Vitamin và các chất hữu cơ khác (mg l -1 ) Myo-Inositol 100 Nicotinic acid 0.5 Pyridoxine HCl 0.5 Thiamine HCl 0.1 Glycine 2.0

CHƯƠNG I ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 Đặt vấn đề:

Nhân sâm Panax ginseng C Meyer là cây dược liệu được sử dụng từ hàng

ngàn năm nay Những tác dụng y học của Nhân Sâm, được dùng trong y học cổ truyền, hiện đã được chứng minh theo nguyên lý của y học hiện đại Nhân Sâm từ cây thuốc huyền thoại của phương Đông đã xuất hiện rộng rãi ở phương Tây, với những sản phẩm thương mại đa dạng Nhân Sâm ngày nay là cây thuốc mang lại giá trị kinh tế to lớn

Việt Nam tự hào có được một loài Nhân Sâm đặc hữu là Sâm Ngọc Linh (hay

còn gọi là Sâm Khu Năm) Panax vietnamensis Ha & Grutzv., được biết đến trên thế

giới với tên gọi Vietnamese ginseng Sâm Ngọc Linh có thành phần ginsenosid, dược chất chính trong Nhân sâm, được đánh giá vào loại nhiều nhất so với các loài khác

của chi Panax trên thế giới Tuy nhiên, Sâm Ngọc Linh được phát hiện khá muộn

(vào năm 1985) cho nên, tuy có nhiều cố gắng để phát triển cây thuốc quý giá này nhưng tiềm năng của Sâm Ngọc Linh vẫn chưa hoàn toàn được đánh thức Cộng với địa bàn phân bố hẹp (chỉ có ở vùng núi Ngọc Linh), lại bị khai thác bừa bãi, nên Sâm Ngọc Linh sớm đứng trước nguy cơ tuyệt chủng Với nỗ lực của những địa phương

có Sâm Ngọc Linh phân bố, hiện nay loài dược liệu này đã có thể tránh bị tuyệt diệt Nhưng để đưa Sâm Ngọc Linh thành cây thuốc ngang hàng với các loại Nhân sâm có trên thị trường dược liệu cả về số lượng và chất lượng, cần có nhiều nghiên cứu chuyên sâu ứng dụng sản xuất hiệu quả

Trên thế giới, cây Nhân Sâm Panax ginseng C Meyer đã được nhân giống

và sản xuất dược chất ginsenosid thành công bằng nuôi cấy mô Ginsenosid chiết từ

mô sẹo trong nuôi cấy mô cây Nhân sâm có cùng dạng với ginsenosid thu từ rễ Nhân Sâm tự nhiên, tác dụng dược lý của dịch chiết bằng rượu hoặc bằng methanol và bột ginsenosid từ mô sẹo hầu như giống với dịch chiết và bột thu từ rễ Nhân Sâm tự nhiên Do đó đã có các hệ thống nuôi cấy lớn như bioreactor dùng để sản xuất ginsenosid theo quy mô công nghiệp, cung cấp cho thị trường tiêu thụ ngày càng rộng lớn, khắc phục được những hạn chế trong canh tác cây Nhân Sâm như: thời gian trồng kéo dài, bị giới hạn về khí hậu, thổ nhưỡng, nhiều sâu bệnh

Sâm Ngọc Linh được cả thế giới biết đến với tên gọi Vietnamese ginseng nhưng không có nhiều nhà khoa học quốc tế lưu ý nghiên cứu về nó Việt Nam cần

tự nghiên cứu cũng như sản xuất, cố gắng đánh thức giá trị y học và giá trị kinh tế của Sâm Ngọc Linh Trong các hướng nghiên cứu, hướng nuôi cấy mô đã thật sự đưa nông nghiệp lên bước phát triển tiên tiến, vì vậy muốn nghiên cứu đưa cây Sâm Ngọc Linh phát triển theo hướng hiện đại, mang lại hiệu quả kinh tế cao không thể

bỏ qua kỹ thuật này Thực tế, cây Sâm Ngọc Linh đã được nhân giống thành công từ

mô sẹo Nhưng tiến hơn một bước để sản xuất ginsenosid Sâm Ngọc Linh bằng nuôi cấy mô thì chưa có nghiên cứu nào được công bố

Với mong muốn tìm hiểu về loại cây trồng có giá trị kinh tế này cùng với những công nghệ nuôi cấy tế bào đã và đang được thực hiện nhằm mục đích nhân giống và sản xuất các hợp chất có giá trị kinh tế, tôi đã thực hiện khóa luận tốt nghiệp: “Công

nghệ nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) dưới sự

hướng dẫn của thầy Bùi Văn Thế Vinh

1.2 Mục đích của đề tài:

- Tổng quan về Sâm Ngọc Linh

- Tìm hiểu một số công nghệ nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh

CHƯƠNG II TỔNG QUAN

2.1 Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.1.1 Khái niệm

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật ( tế bào đơn, mô, cơ quan ) trong điều kiện vô trùng

 Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên hai nguyên tắc:

- Dựa vào tính toàn năng của tế bào:

Mỗi một tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi Mỗi tế bào là một hệ thống mở, tự duy trì và tự sản xuất để tiến hành các chức năng chuyên biệt và sản sinh thế hệ tế bào mới nếu cần thiết

- Dựa vào khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào:

Biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho đến khi thể hiện một chức năng nào đó

Các tế bào dùng trong môi trường cấy đều có khả năng biệt hóa về cấu trúc và chức năng Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng - tế bào phôi và quá trình đó gọi là quá trình phản biệt hóa Vì vậy những tế bào càng gần với trạng thái của tế bào phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu

 ngh a:

- Nhân nhanh giống cây trồng

- Bảo quản nguồn gen

- Tạo cây sạch bệnh

- Sản xuất các hoạt chất sinh học

- Mang tính công nghiệp

 S c ịch s phát tri n:

- 1665: Robert Hooke quan sát được tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa ra khái niệm tế bào

- 1838: Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào

- 1904: Hannig nuôi cấy phôi đầu tiên ở các loài họ cải

- 1934: Kogl xác định vai trò của I

- 1951: Skoog nghiên cứu sử dụng các hoá chất điều hoà sinh trưởng và phát sinh cơ quan

- 1952: Morel và Martin thực hiện vi ghép invitro thành công

- 1962: Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy tế bào thực vật

- 1964: Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà rốt

- 1969: Phân lập tế bào trần từ nuôi cấy tế bào dịch lỏng (huyền phù) của

Hapopappus gracilis

- 1973: Phát hiện Cytokinin có khả năng phá ngủ ở Gerberas

- 1978: Marton và cộng sự xây dựng quy trình chuyển gen vào tế bào trần

- 1983: Công ty Mitsui Petrochemicals lần đầu tiên đã sản xuất chất trao đổi thứ cấp trên quy mô công nghiệp bằng nuôi cấy tế bào dịch lỏng Lithospermum spp Mitsui 0Petrochemicals

- 1988: Klein và cộng sự tái sinh cây chuyển gen bằng phương pháp bắn gen

- 1994: Thương mại hóa giống cà chua chuyển gen FlavrSavr

2.1.2 Các kỹ thuật nuôi cấy

2.1.2.1 Nuôi cấy phôi

Phôi phát triển qua hai giai đoạn dị dưỡng và tự dưỡng giai đoạn dị dưỡng cần có các chất điều hòa sinh trưởng để phát triển

Trong nuôi cấy phôi, đường đóng vai trò rất quan trọng, đường sucrose cho nhiều kết quả tốt hơn Ngoài ra một số chất tự nhiên như nước dừa, dịch chiết malt, casein thủy phân là những chất rất cần trong nuôi cấy phôi Đối với các chất điều hòa sinh trưởng, auxin thường dùng ở nồng độ thấp, kinetin có vai trò đặc biệt cho sự phát triển của phôi

Nhiệt độ, ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi, thường phôi nuôi cấy cần nhiệt độ, ánh sáng thấp hơn phôi phát triển tự nhiên Nhiệt độ 25 ± 2oC

thích hợp cho sinh trưởng và nảy mầm của phôi Các phôi thứ cấp rất khó sinh trưởng đã hoạt động khi chúng được tách rời và nuôi ở điều kiện chiếu sáng 4.000 lux hoặc hơn trong 4 giờ chiếu sáng suốt 4 ngày nuôi đầu tiên

 Kỹ thuật nuôi cấy phôi mang lại nhiều hiệu quả như:

- Nhân giống cây trồng

- Thử sức sống của phôi hạt

- Duy trì phôi yếu và cứu phôi lai xa

- Sản xuất hạt nhân tạo mà bản chất là tế bào phôi

2.1.2.2 Nuôi cấy mô và c quan tách r i

Trong nuôi cấy mô và cơ quan tách rời, khâu chọn mẫu có tầm quan trọng đặc biệt, mẫu phải ở tình trạng sinh lý tốt và đang phát triển

Nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy các bộ phận khác nhau của cây là khác nhau nhưng có một số yêu cầu chung như nguồn carbon, nguồn đường, nguyên tố đa lượng, vi lượng và các chất điều hòa sinh trưởng Muốn duy trì sinh trưởng và phát triển của cơ quan nuôi cấy cần thường xuyên cấy chuyền qua môi trường mới

Đối với nuôi cấy mô cần bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa ít nitơ dưới dạng acide amine, đường và inositol Trong trường hợp nuôi cấy mô, các chất điều hòa sinh trưởng có vai trò quan trọng hơn vì các mô tách rời không có khả năng tổng hợp các chất này

 Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời được ứng dụng trong:

- Nghiên cứu điều kiện sinh trưởng đối với một bộ phận hoặc một mô của cây

- Nhân cây invitro

- Tạo mô sẹo phục vụ cho các nghiên cứu như chọn dòng tế bào, đột biến soma,

2.1.2.3 Nuôi cấy mô phân sinh

Đặc điểm của mô phân sinh là chứa các tế bào non trẻ, phân chia mạnh, không

bị virus xâm nhập, vì vậy mô phân sinh là mô duy nhất của cây sạch virus Mô phân sinh thường là các mô đỉnh chồi và cành Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ các mầm non, các chồi mới hình thành hoặc các cành non

Trong nuôi cấy sự cân bằng giữa các chất điều hòa sinh trưởng rất quan trọng Muốn tạo chồi cần bổ sung cytokinin hoặc tổ hợp cytokinin với auxin, muốn tạo rễ thì bổ sung auxin

 Nuôi cấy mô phân sinh được sử dụng trong:

- Tạo cây sạch virus

- Nhân giống invitro

- Tạo cây đa bội qua xử lý colchicin

- Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan

2.1.2.4 Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn

Ưu điểm của nuôi cấy bao phấn là đơn giản về thao tác kỹ thuật và môi trường nuôi cấy, nhưng có thể tạo ra cả cây lưỡng bội từ soma của thành bao phấn, do vậy sẽ khó phân biệt với cây tự lưỡng bội từ cây đơn bội

Hạt phấn nuôi cấy có thể phát triển thành cây đơn bội hoàn chỉnh trong điều

kiện nuôi cấy invitro bằng con đường tạo phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua tạo

mô sẹo và tạo cơ quan Phương pháp tạo cây đơn bội kép và phương pháp chọn lọc tạo giống có hiệu quả chọn lọc rất cao, đặc biệt nếu được kết hợp với các phương pháp tạo ra các biến dị di truyền khác nhau như lai hữu tính hoặc gây đột biến nhân tạo

Thành phần môi trường nuôi cấy thay đổi tùy thuộc vào kiểu gen và tuổi của bao phấn cũng như các điều kiện mà ở đó cây cho bao phấn sinh trưởng Quá trình sinh trưởng về sau của phôi hạt phấn đòi hỏi bổ sung các muối khoáng vào môi trường Tần số phát sinh cây đơn bội và sinh trưởng của cây nói chung sẽ tốt hơn nếu chúng được nuôi trong điều kiện chiếu sáng, mặc dù cây hạt phấn của một số kiểu gen sinh trưởng trong cả hai điều kiện có chiếu sáng và trong tối

 Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn được dùng cho tạo các dòng thuần để:

- Nghiên cứu gen lặn vì chúng không biểu hiện ở cơ thể dị hợp tử

- Chọn các dòng đột biến

2.1.2.5 Nuôi cấy tế bào đ n

Tế bào đơn có thể nhận được bằng con đường nghiền mô, hoặc xử lý enzyme Sau đó chúng được nuôi cấy dịch lỏng, có khuấy hoặc lắc tạo điều kiện thuận lợi cho

sự trao đổi khí và tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trong môi trường đặc biệt và tăng sinh khối

Mỗi loại cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy khác nhau Yêu cầu dinh dưỡng cho nuôi cấy tế bào đơn khá phức tạp, do chúng bị mất nhiều chất cần thiết cho sinh trưởng khi tách rời khỏi quần thể tế bào

 Nuôi cấy tế bào đơn được sử dụng cho các mục đích:

- Chọn dòng tế bào

- Nghiên cứu cấu trúc tế bào, phát triển và phân hóa tế bào trong những điều kiện khác nhau

- Thu nhận các chất trao đổi thứ cấp

2.1.2.6 Nuôi cấy protop ast

Tế bào trần là tế bào đã được tách bỏ thành tế bào bằng phương pháp cơ học hay sử dụng enzyme Trong điều kiện nuôi cấy phù hợp protoplast có thể tái sinh thành tế bào mới, phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh Ưu thế của kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào trần là tế bào không có màng cứng, ở trạng thái đơn bào, mật

độ tế bào thu được trên 1 đơn vị thể tích môi trường có thể rất cao (đạt 106

tế bào/1ml môi trường)

 Ứng dụng nuôi cấy protopast:

- Tạo ra cây lai soma

- Chuyển các bào quan và chuyển gen Quá trình dung hợp protoplast có thể được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài

- Quá trình sinh tổng hợp màng tế bào

2.1.3 Môi tr ng nuôi cấy

 Thành phần môi trường nuôi cấy gồm năm thành phần cơ bản sau:

- Muối khoáng đa lượng

- Muối khoáng vi lượng

- Vitamin

- Nguồn carbon

- Chất điều hòa sinh trưởng

- Ngoài ra có thể bổ sung các thành phần không xác định (nước dừa, dịch chiết nấm men, ) và agar

 Môi trường nuôi cấy có thể chia thành ba loại:

- Môi trường ngh o dinh dưỡng: White, Knop

- Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: Gamborg

- Môi trường giàu dinh dưỡng: MS

Cơ sở cho việc xây dựng các môi trường nuôi cấy là xem xét các thành phần cần cho sự sinh trưởng và phát triển của cây

Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài

và bộ phận nuôi cấy Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm thì thành phần môi trường cũng sẽ thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy

Tế bào mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong nuôi cấy Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào Vì vậy cần điều chỉnh độ pH môi trường thích hợp trước khi nuôi cấy Thường sử dụng NaOH hay HCl loãng để điều chỉnh độ pH

2.1.4 Các chất điều hòa sinh tr ởng thực vật

2.1.4.1 Auxin

uxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô thực vật I là auxin tự nhiên có trong mô thực vật, còn N , IB , 2,4-D

là các auxin nhân tạo, thường các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn

Chúng có mặt ở các bộ phận của cây như mô phân sinh đỉnh, các bộ phận non khác của cây

 Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào:

- Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu

- Hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy

- Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy

- Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh

- Đặc tính của auxin

 Vai trò của các chất thuộc nhóm auxin:

- Kích thích phân chia và kéo dài tế bào

- Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ra ức chế sinh trưởng của chồi bên

- Kích thích sự phân hoá của các mô dẫn

- Ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chín của quả, sự ra hoa trong mối quan hệ với điều kiện môi trường

- Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus)

Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong các

hệ thống nuôi cấy Đối với sự phát sinh phôi (embryogenesis), để tạo callus và rễ cần

có tỷ lệ auxin/ cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sinh sản chồi và chồi nách

Cytokinin có mặt trong mô phân sinh đỉnh rễ, quả non

 Chức năng chủ yếu của các cytokinin:

- Kích thích phân chia tế bào

- Tạo và nhân callus

- Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô

- Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh

- Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào

- Có thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài

- Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao)

- Ức chế sự hình thành rễ

- Ức chế sự kéo dài chồi

- Ức chế quá trình già (hoá vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục

2.1.4.3 Gibberellin

Trong số hơn 20 chất thuộc nhóm gibberellin, G 3 là chất được sử dụng nhiều hơn cả trong thực tiễn G 3 kích thích kéo dài chồi và nảy mầm của phôi vô tính G 3 có tính hoà tan trong nước

Gibberellin được tạo ra trong đỉnh rễ, chồi, lá non, hạt

 Gibberellin có các chức năng cơ bản sau:

- Kích thích kéo dài chồi do tăng cường phân bào và kéo dài tế bào

- Phá ngủ hạt giống hoặc củ giống

- Kiểm soát sự ra hoa của các cây 2 năm tuổi

- Ức chế sự hình thành rễ bất định

- Kích thích sinh tổng hợp của α-amylase ở hạt cây ngũ cốc nảy mầm

- Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo củ (thân củ, thân hành và củ)

- Kích thích sự nảy mầm của phấn hoa và sinh trưởng của ống phấn

- Có thể gây tạo quả không hạt hoặc làm tăng kích thước quả nho không hạt

- Có thể làm chậm sự hoá già ở lá và quả cây có múi

2.1.4.4 Abscisic acid (ABA)

bscisic acid là một chất điều hòa sinh trưởng thực vật tự nhiên được tạo ra trực tiếp từ acid mevalonic hoặc do sự phân giải carotenoid

Chúng được tạo ra trong lá, quả, mũ rễ, hạt

 Các tác dụng cơ bản của B là:

- Kích thích sự rụng lá, hoa, quả ở hầu hết các cây trồng và gây ra sự nứt quả

- B thường được sản sinh khi có các yếu tố ức chế cây trồng như mất nước

 Các chức năng cơ bản của ethylene:

- Gây già hoá lá, kích thích sự rụng lá và quả

- Làm chín quả

- Sinh tổng hợp ethylene được tăng cường khi quả đang chín, cây đang bị úng, lão hoá, tổn thương cơ giới và bị nhiễm bệnh

- Điều khiển sự chín của một số loại quả

- Ethylene kìm hãm sự ra hoa của đa số cây Tuy vậy, sự ra hoa của xoài, dứa, một số cây cảnh lại được kích thích bởi ethylene

- Kích thích nở hoa, kích thích sự lão hoá của hoa và lá

2.1.5 Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.1.5.1 Đảm bảo điều kiện vô trùng

Môi trường nuôi cấy có chứa đường, muối khoáng, rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển và với tốc độ phát triển nhanh hơn rất nhiều lần so với tế bào thực vật

- Dụng cụ thuỷ tinh: Rửa sạch, hấp trong nồi áp suất ở 121 oC/15 phút

- Nút đậy: Sử dụng nút cao su Nút được nhét bông gòn không thấm nước để bụi và không khí không được đi qua Sau đó đem đi hấp trong nồi hấp 121 o

C/15 phút

- Mẫu nuôi cấy: Các mẫu lấy ngoài tự nhiên như cây, lá, hoa, cành cần rửa sạch bằng xà bông dưới vòi nước nhiều lần để hạn chế sự tạp nhiễm

- Sử dụng các chất có hoạt tính diệt khuẩn như cồn chlorua, nước javen,

- Vô trùng nơi thao tác và tủ cấy

- Môi trường: Môi trường thuờng được hấp khử trùng ở 121 oC, 1atm trong 30 phút

Có một số chất trong môi trường nuôi cấy không bền nhiệt (vitamin, kháng sinh, ), những chất này được lọc vô trùng sau đó được thêm vào môi trường sau khi

đã được hấp, làm nguội đến khi cầm trên tay được

2.1.5.2 Chọn đúng môi tr ng và chuẩn bị môi tr ng đúng cách

Tuỳ vào mục đích nuôi cấy, thu nhận sản phẩm Tuỳ thuộc vào từng loại nuôi cấy sẽ có một môi trường tối ưu Thông thường ta phải trải qua quá trình thực nghiệm, từ đó mới tìm một loại môi trường thích hợp cho từng mục đích

Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, muối khoáng, vitamin rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn nhiều so với các tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy bị nhiễm bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày sẽ phủ đầy vi khuẩn hoặc nấm, khi đó mô nuôi cấy sẽ chết dần thí nghiệm phải bỏ đi

Mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi rất nghiêm ngặt, đặc biệt quan trọng trong nuôi cấy tế bào đơn trong các bioreactor Nhiều loại protein, vitamin, amino axit, hormone, không bền nhiệt vì vậy nên dùng phin lọc micropore để khử trùng

 Có 3 nguồn nhiễm tạp chính:

- Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy không được vô trùng tuyệt đối

- Trên bề mặt hoặc bên trong mô nuôi cấy

- Trong quá trình thao tác

Bảng 2.1: Th i gian tối thi u đ hấp kh trùng môi tr ng nuôi cấy mô ở

Nguồn lấy mẫu, vị trí lấy mẫu cấy từ cây mẹ là những yếu tố quan trọng trong việc thiết lập quá trình nuôi cấy sạch Lấy mẫu vào mùa xuân khi cây đâm lộc, các chồi mới nhú sạch hơn so với các chồi ngủ Cây trồng ngoài ruộng dễ bị nhiễm hơn cây trồng trong nhà kính hoặc chậu trong phòng Các phần như rễ, củ hoặc gần như nằm trên mặt đất như thân bò, dạng củ, protocom của lan thì khó làm sạch hơn các nguyên liệu thực vật khác

Có rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, trong các rảnh nhỏ hoặc giữa các lớp vảy chồi, mầm Để loại bỏ sự tạp nhiễm bề mặt, có thể rửa sơ bộ mô cấy với nước xà phòng để loại bỏ bụi, đất và làm tăng sự tiếp xúc với các chất khử trùng Để làm tăng

sự khử trùng có thể dùng chất hỗ trợ làm tăng sự tiếp xúc như Tween - 20, xà phòng Thường dùng 1 - 3 giọt Tween cho 100 ml dung dịch nước khử trùng là tốt nhất

Ngoài ra để tăng sự tiếp xúc bằng cách lắc hoặc khuấy đều mẫu cấy trong lúc đang khử trùng

 Qui trình khử trùng bề mặt:

- Rửa mẫu bằng chất tẩy nhẹ trước khi thao tác với dung dịnh khử trùng

- Rửa mẫu dưới vòi nước chảy từ 10-30 phút

- Nhúng ngập mẫu vào dung dịch khử trùng trong điều kiện vô trùng Đậy nắp

lọ rồi lắc nhẹ trong thời gian khử trùng

- Bỏ dung dịch khử trùng đi rồi rửa vài lần bằng nước cất vô trùng

Bảng 2.2: Nồng độ và th i gian s dụng 1 số chất x í mô cấy thực vật:

2.2 Giới thiệu cây Sâm Ngọc Linh

2.2.1 Phân oại

 Lịch s phân oại:

Việt Nam có nhiều cây thuốc được gọi là Sâm Nhưng chỉ có bốn loài Sâm

thuộc họ Nhân Sâm (Araliaceae) Chi Panax gần gũi với cây Nhân Sâm Panax

gingseng C A Meyer là Sâm Ngọc Linh, Sâm Tam Thất, Sâm Nam và Sâm Vũ

Diệp, đều là các cây thuốc quý

Năm 1968, KS Vũ Đức Minh đã tìm thấy cây Sâm Ngọc Linh tại vùng núi Ngọc Linh và tạm đặt tên nó là Sâm Khu 5 Năm 1973, đoàn điều tra cây thuốc của

Ban dân y Khu 5 do DS Đào Kim Long dẫn đầu đã phát hiện một loài Panax mọc

hoang thành quần thể ở độ cao 1.800 m trên vùng núi Ngọc Linh và tạm đặt tên là

Sâm Đốt Trúc với tên khoa học Panax articulatus, họ Nhân Sâm (Araliaceae) (Nguyễn Minh Đức, 2003) Tên khoa học của cây được công nhận là Panax

vietnamensis Ha et Grush., họ Nhân Sâm raliaceae, công bố tại Viện thực vật

Kamarov (Liên Xô trước đây) nǎm 1985 do Hà Thị Dung và I V Grushvistky đặt tên (internet 4)

Hình 2.1: Sâm Ngọc Linh ngoài tự nhiên

- Loài: Panax vietnamensis Ha et Grush

- Tên khác: Sâm Việt Nam, Sâm Ngọc Linh, Sâm Khu Năm, Thuốc Dấu (Xê Đăng)

- Tên nước ngoài: Vietnamese ginseng

nhiều rễ con với những vàm ngang Đối với sâm trồng, rễ củ rất phát triển, tăng trưởng hàng năm rất r rệt, chúng có ba dạng chính: dạng củ cà rốt, dạng con quay và dạng bó củ, đây là dạng rất phổ biến Sâm Ngọc Linh trồng thường cao đến 1 m mang nhiều lá kép có khi đến 7 lá chét to hơn bình thường

Thân khí sinh mảnh, th ng màu xanh hay hơi tím, mọc th ng, mang 2 - 4 lá kép chân vịt mọc vòng, mỗi lá kép có 5 lá chét hình trứng ngược hoặc hình mác, dài

10 - 14 cm, rộng 3 - 5 cm, gốc hình nêm, đầu thuôn dài thành mũi nhọn, mép khía răng nhỏ

Hoa tự, cụm hoa mọc thành tán đơn ở ngọn thân, có cuống dài 10 - 20 cm có thể k m 1 - 4 tán phụ hay một hoa riêng lẻ ở phía dưới tán chính Hoa nhiều màu lục vàng, hoa hình tán đơn mọc dưới các lá th ng với thân Mỗi tán 60 - 100 hoa, cuống hoa ngắn 1 - 1.5 cm, lá đài 5, cánh hoa 5, vàng nhạt, nhị 5, bầu 1 ô với 1 vòi nhụy Đài có 5 răng dài, nhị 5, chỉ nhị hình sợi, bầu 1 ô với một vòi nhụy

Lá kép, chân vịt mọc vòng với 3-5 nhánh lá, cuống lá kép, mang 5 lá chét, lá chét phiến bầu dục, mép khía răng cưa, chóp nhọn, có lông ở cả hai mặt

Quả hạch, hình trứng, khi chín có màu đỏ hay vàng nhạt, sau đen, hạt hình thận màu trắng, bề mặt hạt có nhiều chỗ lồi l m, có vân, quả mọc tập trung ở trung tâm của tán lá, dài độ 0,8 - 1cm và rộng khoảng 0,5 - 0,6 cm, mỗi quả chứa một hạt, một số quả chứa 2 hạt và số quả trên cây bình quân khoảng 10 đến 30 quả

Mùa hoa: tháng 4 – tháng 6, mùa quả: tháng 7 – tháng 9

Hình 2.3: Cây Sâm Ngọc Linh

2.2.3 Sinh thái và phân bố

 Đặc đi m sinh thái:

Sâm Ngọc Linh là loại cây thân thảo ưa ẩm và ưa bóng, sinh trưởng ở độ cao

từ 1.200 – 2.100m so với mặt biển, mọc rải rác hay tập trung thành từng đám nhỏ dưới tán rừng Môi trường rừng nơi có Sâm mọc luôn ẩm ướt, thường xuyên có mây

mù, nhiệt độ khoảng 15-18 0C, lượng mưa khoảng 3000 mm/ năm Đất rừng ở đây được tạo thành do lá cây mục lâu ngày, có màu nâu đen, tơi xốp, hàm lượng mùn cao

và chứa nhiều nước

Sâm Ngọc Linh sinh trưởng mạnh trong mùa xuân h Mùa hoa quả từ tháng 5- tháng 10, cây ra hoa quả tương đối đều hàng năm Sau khi quả chín rụng xuống đất, tồn tại qua mùa đông khoảng 4 tháng và sẽ nảy mầm vào đầu mùa xuân năm sau, Sâm có khả năng tái sinh tự nhiên từ hạt khá tốt

Sâm có phần thân trên mặt đất lụi hàng năm, để lại các vết sẹo r Mỗi năm từ đầu mầm thân rễ (kể cả phần thân rễ phân nhánh) chỉ mọc lên một thân mang lá Căn

cứ vào vết sẹo trên thân rễ để tính tuổi của Sâm

 Đặc đi m phân bố:

Trong số hơn mười loài và dưới loài đã biết của chi Nhân Sâm (Panax), ở

Việt Nam có ba loài mọc tự nhiên và một loài là cây nhập trồng Sâm Ngọc Linh được phát hiện sau cùng vào 1973 Đến 1985 nó mới được công bố là hoàn toàn mới đối với khoa học Đến nay Sâm Ngọc Linh chỉ mới được phát hiện duy nhất ở vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum

Ngọc Linh là dãy núi cao thứ hai của Việt Nam, có tọa độ địa lý từ 107o50’ –

108o7’ kinh tuyến Đông và từ 15o0’ – 15o10’ vĩ tuyến Bắc, đỉnh cao nhất là Ngọc Linh cao 2598 m Những điểm vốn trước đây có sâm Ngọc Linh mọc tự nhiên từ độ cao khoảng 1500 m đến 2200 m, chủ yếu tập trung ở 1800 – 2000 m, thuộc địa bàn của hai huyện Đăk Tô (tỉnh Kon Tum) và Trà My (tỉnh Quảng Nam) Về giới hạn cũng như phân bố của loài sâm này ở núi Ngọc Linh hiện nay đã có nhiều thay đổi

2.2.4 Hiện trạng và tiềm năng của cây sâm Ngọc Linh

Cây có vùng phân bố rất hẹp và mọc rất rải rác Do là loài Sâm quí hiếm nên

số lượng cá thể giảm sút nhanh chóng, hiện đang nằm trong 250 loài quí hiếm đang

có nguy cơ tuyệt chủng do bị khai thác quá mức và buôn bán bất hợp pháp, hiện Sâm Ngọc Linh đã được đưa vào sách đỏ Việt Nam cần được bảo vệ

Để bảo vệ và phát triển cây dược liệu quí hiếm, hiện đã có những dự án để duy trì và bảo tồn giống tại hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum:

- Năm 1979: Uỷ Ban Nhân Dân Tỉnh Quảng Nam đã cho thành lập Trại dược liệu Trà Linh Bằng cách nhân giống hữu tính và vô tính, Trại dược liệu đã có 223.000 cây con Trại đã xây dựng quy trình trồng cây Sâm Ngọc Linh và phổ biến cho nhân dân trong vùng thực hiện

- Năm 1995: Sở Khoa học, Công nghệ và Môi trường tỉnh Quảng Nam đã đầu

tư nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật nhằm bảo vệ và phát triển cây Sâm Ngọc Linh.Nhằm hình thành vùng nguyên liệu Sâm Ngọc Linh và đưa cây Sâm trở thành loại cây trồng mang lại nguồn thu nhập ổn định cho người dân trong vùng dự án, Sở đã chủ trì thực hiện dự án “Ứng dụng kỹ thuật tiến bộ xây dựng mô hình phát triển vùng nguyên liệu sâm khu Năm tại xã Trà Linh”

- Năm 2003: Viện Dược liệu Hà Nội phối hợp với Sở Khoa Học Công Nghệ và Môi Trường Kon Tum thực hiện dự án vùng trồng cây Sâm Ngọc Linh Cây Sâm đã được nhân giống trong năm 2003 và trồng tập trung ở xã Ngọc Lay, huyện Đắk Tô Năng suất hàng năm ước tính khoảng 50.000 cây Mục đích của dự án là quy hoạch vùng có điều kiện thích hợp cho cây sâm Ngọc Linh phát triển và tìm ra phương pháp canh tác thích hợp nhất nhằm bảo tồn loài cây đặc hữu của vùng và giúp xóa đói giảm ngh o ở Kon Tum

Sâm Ngọc Linh là một dược liệu quý và có giá trị kinh tế cao, cần thiết ứng dụng những kỹ thuật mới trong sản xuất để nâng cao giá trị thương mại, xây dựng thương hiệu sâm Ngọc Linh trên thị trường thế giới Trong đó bước đầu tiên là hiện đại hóa việc canh tác Trong nhiều biện pháp, nuôi cấy mô là một kỹ thuật tiên tiến

có thể ứng dụng tốt cho sản xuất sản phẩm Sâm Ngọc Linh

2.2.5 Thành phần hóa học

2.2.5.1 H p chất saponin:

Tên gọi saponin hay saponosid là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực vật Hợp chất saponin được xem là thành phần hoạt chất chủ yếu của cây Sâm

Việt Nam cũng như của các loài Sâm khác trên thế giới Các saponin dammaran

được xem là hoạt chất quyết định cho các tác dụng sinh học

Phần dưới mặt đất (thân rễ và rễ củ) chứa 49 hợp chất saponin, gồm 25 saponin đã biết và 24 saponin có cấu trúc mới được đặt tên là vina-ginsenosid-R1-R24

Phần trên mặt đất có 19 saponin damaran đã được phân lập, gồm 11 saponin

đã biết và 8 saponin có cấu trúc mới đặt tên là vinaginsenosid-L1-L8

Bảng 2.3: Hàm ng một số saponin chính trong sâm ( Đ trừ độ ẩm):

Bảng 2.4: Hàm ng saponin của Sâm Ngọc Linh so sánh với các oài Panax

spp trồng trọt:

Loại ag ycon Panax

ginseng

Panax notoginseng

Panax quinquefolius

Panax vietnamensis

( Ghi chú: 20(S)-ppd: 20(S)-protopanaxadiol; 20(S)-ppt: 20(S)-protopanaxatriol)

Bảng 2.5: Các saponin chính yếu trong thành phần saponin dẫn chất

protopanaxatriol: