Công nghệ nuôi cấy tế bào sâm ngọc linh full

Sâm Ngọc Linh có thành phần ginsenosid, dược chất chính trong Nhân sâm, được đánh giá vào loại nhiều nhất so với các loài khác của chi Panax trên thế giới.. Trong các hướng nghiên cứu, h

TỔNG QUAN

Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 0.3 1 Khái niệm

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là kỹ thuật nhân giống vô trùng các bộ phận thực vật như tế bào đơn, mô hoặc cơ quan.

 Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên hai nguyên tắc:

- Dựa vào tính toàn năng của tế bào:

Tế bào của sinh vật đa bào có tiềm năng phát triển thành cá thể hoàn chỉnh trong điều kiện thuận lợi, hoạt động như một hệ thống mở, tự duy trì, tự sản xuất, thực hiện chức năng chuyên biệt và sinh sản nếu cần.

- Dựa vào khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào:

Biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho đến khi thể hiện một chức năng nào đó

Tế bào dùng trong nuôi cấy có khả năng biệt hóa Điều kiện thích hợp giúp tế bào này phản biệt hóa về trạng thái tế bào phôi ban đầu Khả năng nuôi cấy thành công tỷ lệ thuận với độ gần gũi của tế bào với trạng thái tế bào phôi.

- Nhân nhanh giống cây trồng

- Sản xuất các hoạt chất sinh học

 Sơ lược lịch sử phát triển:

- 1665: Robert Hooke quan sát được tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa ra khái niệm tế bào

- 1838: Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào

- 1904: Hannig nuôi cấy phôi đầu tiên ở các loài họ cải

- 1934: Kogl xác định vai trò của IAA

- 1951: Skoog nghiên cứu sử dụng các hoá chất điều hoà sinh trưởng và phát sinh cơ quan

- 1952: Morel và Martin thực hiện vi ghép invitro thành công

- 1962: Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy tế bào thực vật

- 1964: Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà rốt

- 1969: Phân lập tế bào trần từ nuôi cấy tế bào dịch lỏng (huyền phù) của

- 1973: Phát hiện Cytokinin có khả năng phá ngủ ở Gerberas

- 1978: Marton và cộng sự xây dựng quy trình chuyển gen vào tế bào trần

Năm 1983, Mitsui Petrochemicals tiên phong trong sản xuất công nghiệp chất trao đổi thứ cấp bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào dịch lỏng từ Lithospermum spp.

- 1988: Klein và cộng sự tái sinh cây chuyển gen bằng phương pháp bắn gen

- 1994: Thương mại hóa giống cà chua chuyển gen FlavrSavr

2.1.2 Các kỹ thuật nuôi cấy

Phôi phát triển qua hai giai đoạn dị dưỡng và tự dưỡng Ở giai đoạn dị dưỡng cần có các chất điều hòa sinh trưởng để phát triển

Sucrose là đường hiệu quả nhất trong nuôi cấy phôi, song các chất tự nhiên như nước dừa, dịch chiết malt và casein thủy phân cũng rất cần thiết Auxin ở nồng độ thấp và kinetin đóng vai trò quan trọng trong điều hòa sinh trưởng và phát triển phôi.

Nhiệt độ và ánh sáng ảnh hưởng đến sự phát triển phôi, phôi nuôi cấy cần điều kiện nhiệt độ và ánh sáng thấp hơn so với phát triển tự nhiên (25 ± 2°C).

Phôi SVTH Nguyễn Thị Thu phát triển tốt trong điều kiện thích hợp Tuy nhiên, phôi thứ cấp khó sinh trưởng nếu tiếp xúc với ánh sáng 4.000 lux trở lên trong 4 giờ/ngày suốt 4 ngày đầu.

 Kỹ thuật nuôi cấy phôi mang lại nhiều hiệu quả như:

- Nhân giống cây trồng

- Thử sức sống của phôi hạt

- Duy trì phôi yếu và cứu phôi lai xa

- Sản xuất hạt nhân tạo mà bản chất là tế bào phôi

2.1.2.2 Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời

Trong nuôi cấy mô và cơ quan tách rời, khâu chọn mẫu có tầm quan trọng đặc biệt, mẫu phải ở tình trạng sinh lý tốt và đang phát triển

Nuôi cấy các bộ phận cây cần nguồn carbon, đường, nguyên tố đa, vi lượng và chất điều hòa sinh trưởng Cấy chuyền định kỳ lên môi trường mới rất quan trọng Nuôi cấy mô cần bổ sung thêm chất hữu cơ ít nitơ như acid amin, đường và inositol, đặc biệt cần chất điều hòa sinh trưởng do mô tách rời không tự tổng hợp được.

 Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời được ứng dụng trong:

- Nghiên cứu điều kiện sinh trưởng đối với một bộ phận hoặc một mô của cây

- Tạo mô sẹo phục vụ cho các nghiên cứu như chọn dòng tế bào, đột biến soma,…

2.1.2.3 Nuôi cấy mô phân sinh

Mô phân sinh, đặc biệt là mô phân sinh đỉnh chồi và cành, chứa tế bào non, phân chia mạnh và không nhiễm virus, là nguồn duy nhất sạch virus để nuôi cấy cây Việc nuôi cấy thường sử dụng mô phân sinh tách từ mầm non, chồi mới hoặc cành non.

Nuôi cấy mô thực vật đòi hỏi cân bằng chất điều hòa sinh trưởng: cytokinin kích thích tạo chồi, auxin thúc đẩy tạo rễ Sự kết hợp cytokinin và auxin tối ưu là yếu tố then chốt thành công.

 Nuôi cấy mô phân sinh được sử dụng trong:

- Tạo cây đa bội qua xử lý colchicin

- Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan

2.1.2.4 Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn Ưu điểm của nuôi cấy bao phấn là đơn giản về thao tác kỹ thuật và môi trường nuôi cấy, nhưng có thể tạo ra cả cây lưỡng bội từ soma của thành bao phấn, do vậy sẽ khó phân biệt với cây tự lưỡng bội từ cây đơn bội

Nuôi cấy hạt phấn tạo cây đơn bội hoàn chỉnh qua tạo phôi trực tiếp/gián tiếp (mô sẹo, cơ quan) Phương pháp tạo cây đơn bội kép kết hợp lai hữu tính/gây đột biến nhân tạo tăng hiệu quả chọn lọc giống.

Môi trường nuôi cấy bao phấn phụ thuộc kiểu gen, tuổi bao phấn và điều kiện sinh trưởng cây mẹ Phát triển phôi hạt phấn cần bổ sung muối khoáng Chiếu sáng cải thiện tần số và sinh trưởng cây đơn bội, tuy nhiên một số kiểu gen vẫn phát triển tốt trong bóng tối.

 Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn được dùng cho tạo các dòng thuần để:

- Nghiên cứu gen lặn vì chúng không biểu hiện ở cơ thể dị hợp tử

- Chọn các dòng đột biến

2.1.2.5 Nuôi cấy tế bào đơn

Tế bào đơn được phân lập từ mô bằng phương pháp nghiền hoặc xử lý enzyme, sau đó nuôi cấy trong môi trường lỏng, khuấy hoặc lắc đều để tối ưu trao đổi chất và tăng sinh khối Quá trình lọc và nuôi cấy trong môi trường đặc biệt giúp tăng sinh khối tế bào.

Nuôi cấy tế bào và mô thực vật đòi hỏi kỹ thuật chuyên biệt tùy thuộc vào từng loại cây và tế bào Dinh dưỡng cho tế bào đơn phức tạp hơn do mất đi nhiều chất thiết yếu khi tách khỏi quần thể.

 Nuôi cấy tế bào đơn được sử dụng cho các mục đích:

- Nghiên cứu cấu trúc tế bào, phát triển và phân hóa tế bào trong những điều kiện khác nhau

- Thu nhận các chất trao đổi thứ cấp

Giới thiệu cây Sâm Ngọc Linh

 Lịch sử phân loại:

Việt Nam sở hữu nhiều loài cây được gọi là sâm, nhưng chỉ bốn loài thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), với chi *Panax* gần gũi nhất với cây Nhân sâm (*Panax ginseng*).

SVTH: NGUYỄN THỊ THU gingseng C A Meyer là Sâm Ngọc Linh, Sâm Tam Thất, Sâm Nam và Sâm Vũ Diệp, đều là các cây thuốc quý

Năm 1968, GS Vũ Đức Minh phát hiện cây Sâm Ngọc Linh tại vùng núi Ngọc Linh, đặt tên tạm là Sâm Khu 5 Năm 1973, đoàn điều tra của Ban Dân y Khu 5, do DS Đào Kim Long dẫn đầu, phát hiện loài *Panax* (sau này được công nhận tên khoa học là *Panax vietnamensis*) tại đây, đặt tên tạm là Sâm Đốt Trúc.

Grush., họ Nhân Sâm Araliaceae, công bố tại Viện thực vật Kamarov (Liên Xô trước đây) nǎm 1985 do Hà Thị Dung và I V Grushvistky đặt tên (internet 4)

Hình 2.1: Sâm Ngọc Linh ngoài tự nhiên

- Loài: Panax vietnamensis Ha et Grush

- Tên khác: Sâm Việt Nam, Sâm Ngọc Linh, Sâm Khu Năm, Thuốc Dấu (Xê Đăng)

- Tên nước ngoài: Vietnamese ginseng

Hình 2.2: Hình thái Sâm Ngọc Linh

Cây thảo, sống lâu năm nhờ thân rễ, cao khoảng 40 - 80 cm, đôi khi trên 1 m

Thân rễ nạc, mọc bò ngang như củ gừng, có nhiều đốt, không phân nhánh, dài

Sâm Ngọc Linh có thân rễ 30-40cm (có thể hơn), nhiều rễ nhánh và củ, màu nâu nhạt, ruột trắng ngà, thường có củ hình cầu ở cuối Thân rễ sâm hoang dại phát triển mạnh, chứa nhiều chất dự trữ và hoạt chất, hình dạng đa dạng (con quay, hình trụ, màu vàng nhạt) Sâm trồng có 3 dạng rễ củ chính: củ cà rốt, con quay và bó củ (phổ biến nhất), và cây trồng có thể cao tới 1m với nhiều lá chét.

Thân cây khí sinh, màu xanh hoặc hơi tím, mọc thẳng, có 2-4 lá kép chân vịt mọc vòng Mỗi lá kép gồm 5 lá chét hình trứng ngược hoặc hình mác, dài 10- […].

14 cm, rộng 3 - 5 cm, gốc hình nêm, đầu thuôn dài thành mũi nhọn, mép khía răng nhỏ

Hoa tự tán đơn đầu cành, cuống dài 10-20cm, có thể kèm 1-4 tán phụ hoặc hoa đơn Mỗi tán gồm 60-100 hoa màu lục vàng nhạt, cuống hoa ngắn (1-1.5cm), 5 lá đài, 5 cánh hoa, 5 nhị, bầu 1 ô, 1 vòi nhụy.

Lá kép chân vịt, 3-5 nhánh, mỗi nhánh 5 lá chét hình bầu dục, mép khía răng cưa, chóp nhọn, hai mặt có lông.

Trái hạch hình trứng, chín chuyển màu đỏ hoặc vàng nhạt rồi đen, chứa một (hoặc đôi khi hai) hạt hình thận màu trắng, bề mặt gồ ghề, có vân Quả dài 0,8-1cm, rộng 0,5-0,6cm, mọc tập trung ở tán lá, mỗi cây cho khoảng 10-30 quả.

Mùa hoa: tháng 4 – tháng 6, mùa quả: tháng 7 – tháng 9

Hình 2.3: Cây Sâm Ngọc Linh

2.2.3 Sinh thái và phân bố

Sâm Ngọc Linh là loại cây thân thảo ưa ẩm và ưa bóng, sinh trưởng ở độ cao từ

Sâm Ngọc Linh mọc ở độ cao 1.200 – 2.100m so với mực nước biển, rải rác hoặc thành từng đám nhỏ dưới tán rừng ẩm ướt, thường xuyên có mây mù.

Vùng SVTH Nguyễn Thị Thu có khí hậu mát mẻ với nhiệt độ trung bình 15-18°C và lượng mưa cao (3000mm/năm) Đất rừng màu nâu đen, giàu mùn, tơi xốp và giữ nước tốt, hình thành từ lớp lá cây mục lâu năm.

Sâm Ngọc Linh phát triển mạnh vào xuân hè, ra hoa quả từ tháng 5 đến tháng 10 hàng năm Quả chín rụng, tồn tại qua đông 4 tháng rồi nảy mầm vào xuân, cho thấy khả năng tái sinh tự nhiên từ hạt rất tốt.

Sâm có thân trên mặt đất lụi hàng năm, để lại vết sẹo rõ rệt, giúp xác định tuổi sâm dựa trên số lượng vết sẹo trên thân rễ Mỗi năm, chỉ một thân mang lá mọc từ đầu mầm thân rễ.

Việt Nam có 4 loài sâm, trong đó 3 loài mọc tự nhiên và 1 loài được nhập trồng Sâm Ngọc Linh, loài sâm đặc hữu của Việt Nam, được phát hiện năm 1973 và chính thức được công bố năm 1985 Hiện nay, Sâm Ngọc Linh chỉ được tìm thấy duy nhất ở vùng núi Ngọc Linh thuộc Quảng Nam và Kon Tum.

Ngọc Linh là dãy núi cao thứ hai của Việt Nam, có tọa độ địa lý từ 107 o 50’ –

Sâm Ngọc Linh phân bố ở vùng núi Ngọc Linh (108°07' kinh tuyến Đông, 15°00'-15°10' vĩ tuyến Bắc), đỉnh cao 2598m Loài sâm này mọc tự nhiên ở độ cao 1500-2200m (tập trung chủ yếu 1800-2000m), thuộc địa bàn huyện Đăk Tô (Kon Tum) và Trà My (Quảng Nam) Phân bố và giới hạn của sâm Ngọc Linh hiện nay đã thay đổi.

2.2.4 Hiện trạng và tiềm năng của cây sâm Ngọc Linh

Sâm Ngọc Linh có vùng phân bố hẹp, mọc rải rác và đang bị đe dọa tuyệt chủng do khai thác quá mức và buôn bán trái phép Loài sâm quý hiếm này nằm trong danh sách 250 loài cần bảo vệ, hiện đã được ghi vào sách đỏ Việt Nam.

Các dự án bảo vệ và phát triển cây dược liệu quý hiếm đang được triển khai tại Quảng Nam và Kon Tum nhằm duy trì và bảo tồn giống cây SVTH: Nguyễn Thị Thu.

CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO SÂM NGỌC LINH

Nuôi cấy mô sẹo

Các mẫu lá và cuống lá

Sử dụng môi trường nền MS Ngoài ra còn bổ sung: 1.0 mg/l 2,4-D và 0.2 mg/l TDZ

Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH = 5.8 Môi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở nhiệt độ 121 0 C, áp suất 1atm

3.1.3 Thiết bị và dụng cụ:

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vô trùng gồm khử trùng dụng cụ (nồi hấp, tủ lạnh, bếp điện) và bảo quản dung dịch mẹ, sử dụng thiết bị như cân phân tích, ống đong, pipet và máy đo pH.

- Phòng cấy vô trùng gồm tủ cây, đèn UV, các dụng cụ đã hấp vô trùng

- Phòng lạnh để nuôi cấy gồm kệ sắt, đèn chiếu sáng, nhiệt kế, máy điều hòa

- Các dụng cụ gồm đèn cồn, đĩa, dao cắt mẫu, kéo, bông gòn, chai ống nghiệm vô trùng loại 250 ml, 500 ml, giấy vô trùng, giây thun

- Dung dịch xà phòng loãng

- Cắt mẫu lá có kích thước khoảng 1.0*1.0 cm Cuống lá bổ dọc và cắt đoạn khoảng 1.0 cm.

Tái sinh chồi từ mô sẹo

- Rửa nhẹ mẫu bằng bông tẩm nước Javel

- Rửa sạch sơ bộ mẫu bằng nước

- Lắc mẫu trong cồn 70 0 / 30 giây

- Rửa bằng nước cất 4-5 lần

- Lắc mẫu trong dung dịch HgCl2 0.1 % có nhỏ vài giọt Tween-20 trong 5 phút

- Rửa lại bằng nước cất vô trùng 5-6 lần

- Đặt mẫu vào môi trường

- Đậy nắp, bao gói ghi tên môi trường, mẫu cấy, ngày tháng, đem vào phòng nuôi

- Cường độ chiếu sáng: 2.500 – 3.000 lux

- Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ ngày

Hình 3.1: Mô sẹo Sâm Ngọc Linh

3.2 Tái sinh chồi từ mô sẹo (Dương Tấn Nhựt và cs)

Các mô sẹo đã hình thành

Sử dụng môi trường nền MS Ngoài ra còn bổ sung: 1.0 mg/l BA, 1.0 mg/l NAA và 50 g/l sucrose và 5.0 g/l than hoạt tính

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vô trùng gồm các bước: khử trùng môi trường, bảo quản dung dịch mẹ và sử dụng thiết bị như nồi hấp, tủ lạnh, bếp điện, cân phân tích, ống đong, pipet, máy đo pH.

- Cắt nhỏ mô sẹo khoảng 0.5*0.5 cm đặt vào môi trường

Nuôi cấy rễ

Hình 3.2: Chồi Sâm Ngọc Linh

3.3 Nuôi cấy rễ (Dương Tấn Nhựt và cs)

Sử dụng các mô sẹo đã hình thành

Sử dụng môi trường nền MS Ngoài ra còn bổ sung: 3.0 mg/l NNA

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy gồm khử trùng và bảo quản dung dịch mẹ, sử dụng các thiết bị như nồi hấp, tủ lạnh, bếp điện, cân phân tích, ống đong, pipet và máy đo pH.

- Cắt nhỏ mô sẹo khoảng 0.5*0.5 cm đặt vào môi trường

- Cường độ chiếu sáng: 2500- 3000 lux

Hình 3.3: Rễ Sâm Ngọc Linh

Nuôi cấy sinh khối

Các mô sẹo đã hình thành

Sử dụng môi trường nền MS Ngoài ra bổ sung 1.0 mg/l 2.4 D và 0.2 mg/l TDZ

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vô trùng gồm các bước: khử trùng dụng cụ (nồi hấp, tủ lạnh, bếp điện), bảo quản dung dịch mẹ và sử dụng thiết bị đo lường chính xác (cân phân tích, ống đong, pipet, máy đo pH).

- Phòng lắc để nuôi cấy gồm hệ thống bình tam giác 250 – 300 ml, hay các hệ thống nuôi cấy bioreactor, máy lắc, máy lạnh, đèn chiếu sáng

- Phòng thu, tách chiết hoạt chất

- Cắt nhỏ các mô sẹo

- Đậy nắp chai, bao giấy Ghi ngày tháng, tên môi trường, giống

- Đem đi lắc lỏng (3 tháng)

Sau thời gian nuôi cấy, khối lượng tế bào tăng đáng kể, cho phép thu hoạch sinh khối bằng phương pháp lọc tế bào.

- Cường độ chiếu sáng: 2.500- 3.000 lux

- Thời gian lắc lỏng: 3 tháng

Hình 3.4: Nuôi cấy trong Bioreactor

Tái sinh cây qua con đường tạo phôi soma

Các mẫu lá non hay đầu mẫu thân, rễ

Sử dụng môi trường nền MS Ngoài ra bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng phù hợp với từng giai đoạn phát triển

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy gồm khử trùng dụng cụ (nồi hấp, tủ lạnh, bếp điện) và bảo quản dung dịch mẹ, sử dụng thiết bị như cân phân tích, ống đong, pipet và máy đo pH.

- Xử lý mẫu sơ bộ

- Đặt mẫu vào môi trường cảm ứng mô sẹo có bổ sung 1.0 mg/l 2,4-D và 0.2 mg/l TDZ

- Chuyển sang môi trường có mặt 2 ppm 2iP và 1.5 ppm NAA

- Để phôi tiếp tục phát triển, cấy chuyển qua môi trường chứa 0.2-1 ppm gibberellin và BA

- Tạo cây con hoàn chỉnh có rễ trên môi trường có mặt 2 ppm IBA và 0.5 ppm kinetin ở nồng độ thấp

Hình 3.5: Phôi vô tính Sâm Ngọc Linh

Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến nuôi cấy Sâm Ngọc Linh

3.6.1 Khảo sát ảnh hưởng của một số loại chất khử trùng: Đối với Sâm Ngọc Linh bộ phận thí nghiệm là đầu (mầm, thân, rễ)

Chọn chồi mọc thẳng hoặc chồi bên dài 2-3cm, loại bỏ lá, xử lý bằng cồn 70% trong 1 phút trong môi trường vô trùng rồi tráng sạch.

Mẫu được rửa 3 lần bằng nước cất vô trùng, xử lý bằng dung dịch hypoclorid canxi hoặc HgCl2, rồi tráng sạch bằng nước cất vô trùng Sau khử trùng, cắt 0.4cm phần đầu xanh của mẫu và đặt vào môi trường nuôi cấy.

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của các loại nồng độ khử trùng:

Mẫu Số mẫu Ca(OCl) 2

Xử lý Sâm Ngọc Linh bằng HgCl2 0.2% trong 20 phút cho thấy tỷ lệ nhiễm thấp (20%), phần lớn không nhiễm hoặc nhiễm nhẹ (80%).

Ca(OCl)2 với nồng độ 10%, thời gian 5 phút thì tỷ lệ nhiễm thấp (10 %) và tỷ lệ không nhiễm cao (90%) (Bảng 3.1)

3.6.2 Khảo sát ảnh hưởng của các tổ hợp hoocmon lên sự phát sinh hình thái:

Nghiên cứu đánh giá sự phát sinh hình thái của Sâm Ngọc Linh bằng phương pháp nuôi cấy phối hợp các mẫu mầm, thân, rễ trên nhiều môi trường khác nhau.

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của các tổ hợp hoocmon lên sự phát sinh hình thái của Sâm Ngọc Linh cấy mô: Đối tượng

Bộ phận cấy Hoccmon Kết quả phát sinh hình thái

- Với tổ hợp hoocmon IBA 0.5 + 2ip 1 thì Sâm Ngọc Linh phát sinh phôi soma

- Với tổ hợp hoocmon NAA 1 + G 3 thì phát sinh phôi chồi

- Với tổ hợp hoocmon NAA 8 + 2ip 0.5 thì phát sinh rễ

3.6.3 Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên khả năng tạo mô sẹo từ lá và cuống lá:

Ánh sáng ảnh hưởng đến quá trình tạo mô sẹo tùy thuộc loại mẫu cấy Với mẫu lá, tạo mô sẹo trong tối thường hiệu quả hơn.

SVTH: NGUYỄN THỊ THU ngoài sáng Tuy nhiên, một số trường hợp mẫu cấy lại tạo mô sẹo tốt hơn trong điều kiện sáng

Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng (tối hoàn toàn và 16 giờ sáng/ngày) đến quá trình tạo mô sẹo ban đầu từ mẫu lá và cuống lá.

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên khả năng tạo mô sẹo từ lá và cuống lá:

2,4-D (mg/l) Bộ phận Phần trăm tạo mô sẹo (%)

Chiếu sáng (16 giờ/ ngày) Tối hoàn toàn

Bảng 3.3 cho thấy tỷ lệ hình thành mô sẹo trên lá và cuống lá tương tự nhau giữa hai điều kiện sáng và tối Tuy nhiên, điều kiện tối tạo ra ít mô sẹo hơn và chất lượng mô sẹo kém hơn, đặc biệt là ở môi trường 3.0 mg/l 2,4-D do hiện tượng thủy tinh thể.

3.6.4 Ảnh hưởng của kích thước mẫu cấy ban đầu lên sự tăng sinh mô sẹo:

Mô sẹo được cắt theo ba kích thước: KT1, KT2, KT3 Mẫu mô sẹo với kích thước xác định được cấy vào môi trường nhân nhanh

Mô sẹo sau quá trình tăng sinh được sử dụng cho quá trình tái sinh chồi và rễ bất định

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của kích thước mẫu cấy ban đầu lên sự tăng sinh mô sẹo:

Chỉ tiêu quan sát KT1

Trọng lượng tươi ban đầu (mg) 147 6 267 ± 18 576 ± 24

Tỷ lệ tăng sinh khối khô 5.46 3.22 2.65

Kích thước mẫu cấy ảnh hưởng đáng kể đến tăng sinh mô sẹo invitro KT1 cho hiệu quả tốt nhất về tỷ lệ tăng sinh khối và trọng lượng khô, KT2 và KT3 không khác biệt rõ rệt Hiệu quả này có thể do khả năng thu nhận dinh dưỡng và ảnh hưởng của chất thải nội sinh trong quá trình nuôi cấy.

3.6.5 Ảnh hưởng của auxin lên khả năng khởi tạo mô sẹo từ lá và cuống lá:

Những nghiên cứu đã có trên các đối tượng thuộc chi Panax cho thấy giai đoạn khởi tạo mô sẹo thường có sự kết hợp giữa cytokinin và auxin

Thí nghiệm sử dụng mẫu lá và cuống lá vô trùng cấy trên môi trường MS bổ sung 0.2 mg/l TDZ và các auxin 2,4-D, IBA, NAA ở nồng độ 0.5, 1.0, 2.0 và 3.0 mg/l Mẫu được đặt mặt cắt hướng lên trên.

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của auxin lên khả năng khởi tạo mô sẹo từ lá và cuống lá:

Auxin Nồng độ auxin ( mg/l) Tỷ lệ tạo mô sẹo (%)

Bảng 3.5 trình bày kết quả nuôi cấy 8 tuần Chỉ 2,4-D kích thích tạo mô sẹo trên lá và cuống lá Nồng độ 1.0 mg/l 2,4-D cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất (90% lá, 100% cuống lá), với nhiều mô sẹo chắc, màu vàng sáng.

D, mô sẹo bắt đầu có hiện tượng thủy tinh thể Do đó, ở nồng độ 2,4-D từ 3.0 mg/l trở lên không phù hợp cho sự phát sinh mô sẹo

3.6.6 Ảnh hưởng của auxin lên khả năng tăng sinh mô sẹo Sâm Ngọc Linh:

Mô sẹo từ giai đoạn khởi tạo được cấy trên môi trường MS bổ sung 0.2 mg/l TDZ và các auxin (2,4-D, IBA, NAA) ở nồng độ 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 và 5.0 mg/l, chiếu sáng 16 giờ/ngày.

Bảng 3.6: Ảnh hường của auxin lên khả năng tăng sinh mô sẹo Sâm Ngọc Linh:

Trọng lượng tươi ban đầu (mg)

Sinh khối sau 4 tuần nuôi cấy Tỷ lệ tăng sinh khối khô

Mô sẹo nuôi cấy trên môi trường chứa 0.5 mg/l IBA đạt tỷ lệ chất khô cao nhất (9.62%) sau tăng sinh, mặc dù tỷ lệ tăng sinh khối khô chưa được nêu rõ.

SVTH: NGUYỄN THỊ THU nhất là 4.56 lần lại thu được ở mô sẹo trên môi trường có 2,4-D ở nồng độ 1.0 mg/l

Sự kết hợp auxin và cytokinin, đặc biệt là IBA với TDZ, tăng khả năng thu nhận đường và chất dinh dưỡng của mô sẹo, dẫn đến tăng sinh mô sẹo và tỷ lệ chất khô IBA hiệu quả hơn NAA và 2,4-D trong việc kích thích thu nhận dinh dưỡng khi phối hợp với TDZ.

Mô sẹo nuôi cấy trên môi trường chứa IBA có tỷ lệ chất khô cao nhất trong ba auxin Tuy nhiên, 2,4-D cho thấy hiệu quả tăng sinh khối khô cao nhất (gấp 4.56 lần) và tỷ lệ chất khô tương đối cao (8.18%) Mô sẹo trên môi trường 2,4-D có hình thái tốt nhất và khả năng tái sinh cao.

3.6.7 Ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo:

Mô sẹo nhân nhanh được tách và cấy vào môi trường MS bổ sung BA và NAA (nồng độ theo bảng 3.6).

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

Sâm Ngọc Linh nổi bật với hàm lượng saponin cao và phong phú, vượt trội so với các loài Panax khác toàn cầu.

Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật của Nguyễn Thị Thu đã góp phần quan trọng bảo tồn nguồn dược liệu quý hiếm, mang lại nhiều ý nghĩa thực tiễn.

Nồng độ 2,4-D từ 3.0 mg/l trở lên ức chế khả năng tạo mô sẹo từ lá Sâm Ngọc Linh Nghiên cứu cho thấy nồng độ auxin ảnh hưởng đáng kể đến quá trình hình thành mô sẹo.

- Trong giai đoạn tăng trưởng chồi, số chồi tái sinh từ mô sẹo đạt cao nhất trên mụi trường ẵ MS bổ sung 1.0 mg/l BA, 1.0 mg/l NAA, 50 g/l sucrose

Mô sẹo nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 3.0 mg/l NAA cho hiệu quả ra rễ tốt nhất, thể hiện ở tỷ lệ ra rễ cao, số lượng rễ nhiều và trọng lượng rễ tươi cao.

- Mụi trường ẵ MS cú bổ sung 5.0 mg/l NAA kớch thớch sự nhõn rễ tốt nhất, cho tỷ lệ ra rễ cao nhất và rễ phân nhánh nhiều nhất.

Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Sâm Ngọc Linh, dù được thế giới công nhận là loài sâm quý hiếm hàng đầu, vẫn chưa phổ biến rộng rãi như sâm Hàn Quốc hay sâm Triều Tiên.

Nghiên cứu tạo nguồn nguyên liệu sâm bằng nuôi cấy mô tế bào đã được thực hiện nhiều năm trên thế giới và tại Việt Nam Tuy nhiên, cần thêm nghiên cứu về sâm Ngọc Linh để Việt Nam chủ động nguồn dược liệu quý này và đưa thương hiệu sâm Việt Nam ra quốc tế.

Sâm Ngọc Linh, loài sâm đặc hữu quý hiếm với số lượng ít, phân bố hẹp và nhạy cảm với môi trường, đang đối mặt nguy cơ tuyệt chủng do nguồn cung hạn chế và thời gian sinh trưởng dài (5-6 năm) Việc bảo tồn và phát triển nguồn tài nguyên này cần những biện pháp cấp bách.

Tiêu đề	Công Nghệ Nuôi Cấy Tế Bào Sâm Ngọc Linh
Tác giả	Nguyễn Thị Thu
Người hướng dẫn	CN. Bùi Văn Thế Vinh
Trường học	Đại học Kỹ thuật Công nghệ
Chuyên ngành	Công nghệ sinh học
Thể loại	khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2010
Thành phố	TP.HCM

Định dạng
Số trang	59
Dung lượng	537,65 KB