Nghiên cứu chuyển gen tạo rễ tơ sâm ngọc linh (panax vietnamensis ha et grushv ) làm vật liệu cho nuôi cấy sinh khối

14 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRỊNH THỊ HƯƠNG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN TẠO RỄ TƠ SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) LÀM VẬT LIỆU CHO NUÔI CẤY SINH KHỐI Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Mã số: 62 42 01 12 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2017 24 Công trình hoàn thành Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Dương Tấn Nhựt Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên PGS.TS Chu Hoàng Hà Viện Công nghệ Sinh học Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Nhà nước tại: Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Vào hồi ngày tháng năm 2017 Có thể tìm hiểu luận án tại: • • Thư viện Quốc gia Việt Nam Viện Công nghệ Sinh học 34 • Trang web Bộ GDĐT MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Sâm ngọc linh dược liệu quý đặc hữu cho vùng sinh thái định Thời gian sinh trưởng chậm, cần tới năm bắt đầu thu hoạch - 10 năm thu củ sâm chất lượng tốt Trong đó, việc khai thác bừa bãi phương pháp quản lý hiệu dẫn đến không đủ đáp ứng nhu cầu cung cấp nguyên liệu cho ngành dược liệu, mỹ phẩm, Những năm gần đây, với xu hướng chung giới, nước ta hướng nghiên cứu công nghệ sinh khối tế bào thực vật để sản xuất sản phẩm thứ cấp bắt đầu quan tâm đầu tư phát triển Tuy nhiên, trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật cần phải bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật vào môi trường nuôi cấy Vấn đề trở ngại lớn cho nhà nghiên cứu, tồn dư chất điều hòa sinh trưởng thực vật sinh khối tế bào nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến sản phẩm sức khỏe người sử dụng Vấn đề hoàn toàn khắc phục nuôi cấy sinh khối từ rễ t rễ tơ sinh trưởng tốt môi trường không cần bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật Hơn nữa, rễ tơ có khả sinh trưởng nhanh, phân nhánh cao; nuôi cấy tạo sinh khối liên tục không bị ảnh hưởng dư lượng chất điều hòa sinh trưởng thực vật, điều có ý nghĩa dây chuyền sản xuất hợp chất thứ cấp hay dược phẩm sinh học tái tổ hợp Ngoài ra, rễ tơ sản xuất lượng lớn hợp chất thứ cấp quan biệt hóa nên nuôi cấy rễ tơ có di truyền ổn định nuôi cấy huyền phù tế bào mô sẹo Xuất phát từ ưu điểm rễ tơ hợp chất dược liệu quý sâm ngọc linh chủ yếu thu từ rễ nên tiến hành đề tài: “Nghiên cứu chuyển gen tạo rễ tơ sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) làm vật liệu cho nuôi cấy sinh khối” Mục tiêu đề tài Thu nhận dòng rễ tơ chuyển gen sâm ngọc linh có khả sinh trưởng nhanh, ổn định chứa hàm lượng saponin thiết yếu sâm Ý nghĩa khoa học Kết nghiên cứu đề tài cho thấy có khả chuyển gen mong muốn vào sâm ngọc linh, loài dược liệu quý khó nhân giống Mặt khác, kết đề tài tạo nguồn dược liệu quý, giúp giảm khai thác tự nhiên góp phần bảo tồn nguồn gen quý loài sâm quý giá Ý nghĩa thực tiễn Kết nghiên cứu đề tài mở triển vọng ứng dụng công nghệ nuôi cấy rễ tơ thu nhận hoạt chất saponin, cung cấp nguyên liệu cho sở nghiên cứu ứng dụng, công ty mỹ phẩm dược phẩm, bào chế sản xuất mỹ phẩm, thực phẩm chức năng, thuốc phục vụ sức khỏe cộng đồng Những đóng góp luận án Nghiên cứu tạo nguồn vật liệu cho nuôi cấy sinh khối để thu nhận hợp chất saponin, dòng rễ tơ sâm ngọc linh sinh trưởng nhanh, ổn định làm vật liệu cho nuôi cấy sinh khối rễ để thu nhận hợp chất saponin Nghiên cứu mở triển vọng đầy tiềm nuôi cấy sinh khối rễ tơ quy mô thương mại để thu nhận nguồn nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng, mỹ phẩm dược phẩm Kết cấu luận án Luận án gồm 154 trang (kể tài liệu tham khảo) chia thành phần: Phần mở đầu trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu, 31 trang; Chương 2: Vật liệu, nội dung phương pháp nghiên cứu, 20 trang; Chương 3: Kết quả, 52 trang; Chương 4: Bàn luận kết nghiên cứu, 23 trang; Kết luận đề nghị, trang; Các công trình công bố liên quan đến luận án, trang; Summary, trang; Phần tài liệu tham khảo, 19 trang với 169 tài liệu tham khảo bằng tiếng Việt tiếng Anh Luận án có 31 bảng, 34 hình CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Những thành tựu nghiên cứu sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 1.1.1 Giới thiệu sâm ngọc linh Cây sâm ngọc linh (hay sâm Việt Nam) có tên khoa học Panax vietnamensis Ha et Grushv thuốc giấu đồng bào dân tộc Xê Đăng sống vùng núi cao thuộc hai tỉnh Kon Tum Quảng Nam Loài sâm xuất độ cao 1.500 m trở lên so với mực nước biển Từ 1.700 - 2.000 m, mọc tập trung thành quần thể dọc bờ suối, có độ ẩm 80%, đất nhiều mùn hữu cơ, tán rừng hỗn giao rộng kim Theo nghiên cứu khoa học, sâm ngọc linh có tác dụng chống trầm cảm, kích thích hệ miễn dịch, chống lão hóa, phòng chống ung thư, bảo vệ tế bào gan, tăng thị lực, sức đề kháng, nâng cao huyết áp người bị huyết áp thấp, Phân tích hợp chất hóa học cho thấy sâm ngọc linh có chứa tới 52 saponin (sâm Triều Tiên có khoảng 25 saponin), có 26 saponin có cấu trúc biết 1.1.2 Tình hình của loài sâm ngọc linh Sâm ngọc linh loài sâm đặc hữu, sinh trưởng vùng sinh thái định Thêm vào thời gian nuôi trồng sâm kéo dài, thường cần tới năm thu hoạch - 10 năm thu củ sâm có chất lượng tốt, dẫn tới xảy tình trạng sâm bị khai thác trộm trước thời gian phép thu hoạch Nhiều chương trình di thực sâm ngọc linh tiến hành từ nhiều năm kết hạn chế định Do vậy, chế phẩm từ sâm ngọc linh sản xuất ít, chí ngưng sản xuất thiếu nguồn nguyên liệu Hiện nay, nuôi cấy sinh khối từ rễ tơ có nguồn gốc từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes xem giải pháp tạo nguồn dược phẩm phục vụ sức khoẻ cộng đồng Rễ tơ sinh trưởng, phát triển tốt môi trường không cần bổ sung chất điều hoà sinh trưởng thực vật Hơn nữa, rễ tơ có khả sinh trưởng nhanh, phân nhánh cao, kỹ thuật nuôi cấy, chuyển gen dễ dàng, nuôi cấy tạo sinh khối liên tục có ổn định di truyền so với nuôi cấy huyền phù tế bào mô sẹo Vì vậy, nuôi cấy rễ tơ sâm ngọc linh xem giải pháp để thu nhận nguồn nguyên liệu sâm Do nghiên cứu chuyển gen thu nhận rễ tơ nhân nhanh sinh khối rễ tơ sâm cần thiết 1.2 Agrobacterium rhizogenes ứng dụng nuôi cấy tạo rễ tơ để thu nhận hợp chất thứ cấp thực vật 1.2.1 Agrobacterium rhizogenes chế chuyển gen Agrobacterium rhizogenes thuộc chi Agrobacterium, vi khuẩn đất hình que, gram âm, gây hội chứng rễ tơ, đặc trưng xuất rễ vị trí vết thương bị nhiễm bệnh A rhizogenes mang Ri plasmid (Root-inducing), plasmid xác định tác nhân gây bệnh rễ tơ mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm (Chilton et al., 1982) Khi tế bào thực vật bị thương tiết polyphenol hấp dẫn vi khuẩn, chuyển đoạn T-DNA (transfer DNA) từ Ri-plasmid vào hệ gen tế bào vật chủ Ri-plasmid phân tử DNA mạch vòng, sợi kép có trọng lượng phân tử lớn từ 200 - 800 kp gồm vùng T-DNA vùng vir (virulence) Các chủng A rhizogenes khác khác khả chuyển T-DNA từ vi khuẩn vào gen thực vật rễ tơ chủng khác gây biểu hình thái khác (Giri et al., 2001) Chủng A rhizogenes thuộc dạng agropine chủng có độc tính mạnh, đặc trưng Ri-plasmid: pRiA4, pRi1855 pRiLBA9402 (Veena, Taylor, 2007), chủng sử dụng chủ yếu nghiên cứu tạo rễ tơ thực vật Chúng tích hợp cách độc lập hai vùng T-DNA riêng biệt vào hệ gen thực vật Một vùng mang gen rol chịu trách nhiệm kiểu hình rễ tơ (gọi vùng biên trái, TL-DNA), đó, vùng lại mang gen aux1-2 mã hóa enzyme kiểm soát tổng hợp auxin (gọi vùng biên phải, TR-DNA) TR-DNA đóng vai trò hỗ trợ cho trình cảm ứng khởi tạo rễ mang gen aux1-2, TR-DNA mang gen mã hóa tổng hợp opine Trình tự T L-DNA bao gồm 18 khung đọc mở (ORFs), có loci 10, 11, 12 15 tương ứng mã hóa cho gen rolA, B, C D Các chủng A rhizogenes khác bao gồm dạng mannopine, cucumopine mikimopine tương ứng với Ri-plasmid pRi8196, pRi2659 pRi1724, chứa vùng T-DNA đơn có cấu trúc giống vùng TL-DNA chủng thuộc nhóm agropine khuyết gen rolD, nhiên chúng có khả cảm ứng hình thành rễ tơ gen rol (Britton, Escobar, 2008) 1.2.2 Ứng dụng Agrobacterium rhizogenes nuôi cấy tạo rễ tơ để thu nhận hợp chất thứ cấp thực vật Hiện nay, nuôi cấy rễ tơ có nguồn gốc từ vi khuẩn A rhizogenes nghiên cứu rộng rãi để sản xuất in vitro chất chuyển hóa thực vật, hàm lượng chất chuyển hoá thu tương tự cao hàm lượng chất chuyển hoá có mặt rễ hoang dại trồng (Caspeta et al., 2005) Sự ổn định di truyền rễ tơ đáp ứng cho sản xuất ổn định chất chuyển hóa thứ cấp chúng Tương tự vậy, chất chuyển hóa thứ cấp có loài hoang dại thường bảo tồn rễ tơ Ở nước ta, nghiên cứu chuyển gen để tạo rễ tơ tiến hành thành công số loài có giá trị Tuy nhiên, nghiên cứu rễ tơ nước dừng lại quy mô phòng thí nghiệm, mà chưa ứng dụng rộng rãi để sản xuất sản phẩm thương mại hoá 1.3 Ứng dụng elicitor nghiên cứu sinh tổng hợp hợp chất biến dưỡng thứ cấp thực vật 1.3.1 Khái niệm elicitor Elicitor nhân tố sinh học hay hóa học từ nguồn khác dẫn đến biến đổi hình thái thực vật Theo nghĩa rộng, thực vật, elicitor có liên quan đến hợp chất khởi động phản ứng hình thái sinh lý dẫn đến tích tụ phytoalexin 1.3.2 Ứng dụng elicitor để kích thích tăng tích luỹ hợp chất thứ cấp nuôi cấy tế bào thực vật Elicitor sử dụng công cụ quan trọng để sản xuất sản phẩm thứ có cấp hoạt tính sinh học với suất cao giảm chi phí sản xuất (Hussain et al., 2012) Có nhiều báo cáo cho thấy rằng elicitor giúp tăng sản xuất phytoalexin isoflavonoid, phytoalexin serquiterpenoid, coumarin, podophyllotoxin, azadirachtin, terpenoid, hypericin (hypericin pseudohypericin) hyperforin, capsaicinoid, vascicine (Gao et al., 2011, Coste et al., 2011, Gururaj et al., 2012, Bhambhani et al., 2012) Mặt khác, elicitor sử dụng để làm sáng tỏ đường chuyển hóa phức tạp (Moreno et al., 1996), để mô tả tương tác phản ứng stress sinh học phi sinh học mức độ phân tử (Atkinson, Urwin, 2012) Ngoài có nghiên cứu công bố để đánh giá ảnh hưởng elicitor tới enzyme trao đổi chất thứ cấp (Zenk, 1991), phân tử tín hiệu quan trọng làm trung gian phản ứng kháng thực vật (Bux et al., 2012), nổ oxy hoá (Davis et al., 1993), tín hiệu dẫn truyền phytoalexin (Preisig, 1994) kênh anion (Zimmermann et al., 1998) Bên cạnh đó, elicitor sử dụng để nghiên cứu tính chất hóa học đường truyền tín hiệu chất tự nhiên tiết vi sinh vật, động vật ăn cỏ thực vật thời gian nhiễm bệnh, ăn cỏ, cộng sinh tương tác allelopathic (Maffei et al., 2012) CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Vật liệu thực vật Nguyên liệu thực vật sử dụng nghiên cứu tạo rễ bất định mẫu lá, cuống lá, củ, mô sẹo sâm ngọc linh nuôi cấy in vitro Nguyên liệu thực vật sử dụng nghiên cứu chuyển gen mẫu lá, cuống lá, củ, mô sẹo, phôi, rễ bất định sâm ngọc linh nuôi cấy in vitro Nguyên liệu thực vật sử dụng nghiên cứu nhân nhanh rễ tơ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng elicitor tới khả tăng tích luỹ hoạt chất saponin dòng rễ tơ chuyển gen có khả sinh trưởng nhanh ổn định 2.1.2 Các chủng vi khuẩn Chủng Agrobacterium rhizogenes ATCC15834 mang vector 10 PTN289, mang gen thị gen gus sử dụng để tối ưu hoá quy trình chuyển gen Chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC15834 dạng dại sử dụng để chuyển gen thu nhận dòng rễ tơ sâm ngọc linh Cả hai chủng vi khuẩn phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học cung cấp 2.2 Các phương pháp nghiên cứu kỹ thuật sử dụng 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.2 Phương pháp chuyển gen tạo rễ tơ vào sâm ngọc linh thông qua Agrobacterium rhizogenes 2.2.3 Phương pháp kiểm tra có mặt gen rol dòng rễ tơ 2.2.4 Phương pháp chiết xuất xác định hoạt chất từ khối tế bào sâm 2.2.5 Phương pháp giải phẫu hình thái tế bào thực vật 2.3 Bố trí thí nghiệm 2.3.1 Nuôi cấy thu nhận nguồn vật liệu sâm ngọc linh in vitro 2.3.1.1 Nghiên cứu nuôi cấy thu nhận mô sẹo 2.3.1.2 Nghiên cứu nuôi cấy thu nhận rễ bất định 2.3.2 Nghiên cứu quy trình chuyển gen tạo rễ tơ sâm ngọc linh 2.3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng mật độ vi khuẩn tới hiệu chuyển gen 2.3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian nhiễm khuẩn tới hiệu chuyển gen 2.3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ acetosyringone (AS) tới hiệu chuyển gen 16 4,8 5,1 5,8 6,1 6,8 7,1 48,30cd 62,30bc 79,30ab 87,30a 50,70cd 38,70d 5,50d 6,80c 8,20b 9,40a 5,10e 4,30f 4,67bc 5,33bc 7,33ab 8,67a 4,00bc 4,00bc 1,17c 2,20ab 2,90a 2,80a 1,70bc 1,30c pH thích hợp cho sinh trưởng dòng rễ tơ khoảng từ 5,8 – 6,1 3.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của rễ tơ Bảng 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh trưởng rễ tơ sâm ngọc linh chuyển gen Nhiệt độ 22°C 25°C 28°C Khối lượng tươi (mg) 74,30b* 102,30a 81,00b Khối lượng khô (mg) 8,10c 12,70a 8,70b Số lượng rễ (rễ/mẫu) 6,67b 11,33a 6,00b Chiều dài rễ (cm) 1,87b 3,33a 2,33b Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng rễ tơ sâm ngọc linh 25oC 3.4.4 Ảnh hưởng của hàm lượng đường lên sinh trưởng của rễ tơ Bảng 3.4 Ảnh hưởng hàm lượng đường lên sinh trưởng rễ tơ Sucrose (g) 10 20 30 40 50 60 Khối lượng tươi (mg) 33,33d* 41,70d 66,00c 81,33ab 86,33a 96,33a 70,30bc Khối lượng khô (mg) 4,00g 4,60f 7,10e 8,20c 9,30b 10,50a 7,60d Số lượng rễ (rễ/mẫu) 2,00b 2,67b 7,67a 8,33a 8,00a 9,00a 7,67a Chiều dài rễ (cm) 1,67c 2,20bc 2,47bc 2,67ab 2,67ab 3,30a 2,33bc Nồng độ sucrose thích hợp cho sinh trưởng rễ tơ 50 g/l 3.4.5 Ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy lên sinh trưởng của rễ tơ Bảng 3.5 Ảnh hưởng giá thể nuôi cấy lên sinh trưởng rễ tơ Giá thể Khối lượng Khối lượng Số lượng rễ Chiều dài 17 Agar Gelrite Bông gòn tươi (mg) 80,00a* 73,30a 57,30b khô (mg) 9,10a 8,00b 5,40c (rễ/mẫu) 8,00a 4,67b 3,33b rễ (cm) 2,93a 2,07b 1,80b Agar giá thể thích hợp cho sinh trưởng rễ tơ 3.4.6 Sự sinh trưởng của rễ tơ tổ hợp điều kiện nuôi cấy tối ưu môi trường đặc môi trường lỏng lắc Quan sát mặt hình thái tốc độ sinh trưởng dòng rễ tơ thời gian cấy chuyền môi trường nhân nhanh tối ưu, ghi nhận phát triển mạnh dòng rễ tơ có kiểu hình đặc trưng hình 3.1 Hình 3.1: Hình thái dòng rễ tơ sâm ngọc linh điển hình sau 12 tuần nuôi cấy a: Dòng 1: rễ tơ dạng mảnh, phát triển theo chiều dài, phân nhánh chủ yếu dọc rễ chính; b: Dòng 2: rễ tơ dạng nhỏ, phân nhánh nhiều, phát triển mạnh; c: Dòng 3: rễ tơ dạng hình lược phân nhánh kém, phát triển chậm; d: Dòng 4: rễ tơ dạng sợi ngắn, phân nhánh ít, phát triển chậm Sau đó, rễ tơ tiếp tục nhân nhanh môi trường thạch môi trường lỏng lắc Kết thu cho thấy, rễ tơ nuôi cấy môi trường đặc không bị đứt gãy, nuôi cấy lỏng lắc, rễ tơ bị đứt gãy trình chuyển động Do đó, rễ tơ nuôi cấy môi trường thạch có tính ổn định di truyền so với nuôi cấy lỏng lắc, nên môi trường đặc thích hợp để trì sinh trưởng bảo tồn dòng rễ tơ gốc làm nguyên vật liệu cho nuôi cấy thu nhận sinh khối Ngược lại, rễ tơ cảm ứng tăng sinh nhanh mạnh môi trường lỏng lắc, nên môi trường lỏng lắc thích hợp để nuôi cấy thu nhận sinh khối rễ tơ 3.5 Kết nghiên cứu số elicitor có tác dụng làm tăng tích lũy hoạt chất trình nuôi cấy rễ tơ chuyển gen sâm ngọc linh 18 3.5.1 Ảnh hưởng của methyl jasmonate (MeJA) lên sinh trưởng tích luỹ saponin của rễ tơ Khi bổ sung MeJA vào môi trường nuôi cấy rễ tơ sâm ngọc linh ức chế sinh trưởng rễ Tuy nhiên, bổ sung MeJA vào môi trường nuôi cấy lại gia tăng khả tích luỹ hoạt chất rễ tơ, đạt cao 150 µl/l MeJA Tại nghiệm thức 150 µl/l MeJA tổng hàm lượng saponin thu cao cao gấp lần so với đối chứng (Bảng 3.7), nhiên khối lượng khô rễ thu lại giảm 2,2 lần so với đối chứng (Bảng 3.6), nên xét tổng hàm lượng saponin thu toàn sinh khối chất khô rễ tơ sâm thu việc bổ sung MeJA vào môi trường nuôi cấy không hiệu Bảng 3.6 Ảnh hưởng MeJA lên khả sinh trưởng rễ tơ Nồng độ MeJA (µl/l) 50 100 150 200 250 Khối lượng tươi (mg) 247,33a* 203,33b 165,67c 137,33d 106,00e 82,67f Khối lượng khô (mg) 63,33a 43,00b 33,67c 29,33d 22,00e 19,33f Đặc điểm rễ Trắng Vàng nhạt Vàng nhạt Vàng Vàng đậm Vàng đậm Bảng 3.7 Ảnh hưởng MeJA lên khả tích lũy saponin rễ tơ Nồng độ MeJA (µl/l) 50 100 150 200 250 Rg1 (‰) Rb1 (‰) MR2 (‰) 0,162560 0,291539 0,261945 0,615370 0,410978 0,374705 0,062567 0,061573 0,040760 0,096196 0,072151 0,073269 4,633008 7,511306 7,332454 9,033344 3,771409 3,357971 Tổng saponin (‰) 4,858135 7,864417 7,635159 9,744910 4,254538 3,805945 3.5.2 Ảnh hưởng của salicylic acid (SA) lên sinh trưởng tích luỹ saponin của rễ tơ Tương tự MeJA, bổ sung SA vào môi trường nuôi cấy ức chế sinh trưởng rễ tơ sâm ngọc linh, lại gia tăng khả tích luỹ hoạt chất rễ Tại nghiệm thức 20 µl/l SA, tổng hàm lượng saponin đạt cao cao gấp 4,7 lần so với nghiệm 19 thức đối chứng (Bảng 3.9) Nếu xét tốc độ sinh trưởng rễ tơ nghiệm thức 20 µl/l SA, khối lượng khô rễ thu nghiệm thức giảm 2,3 lần so với đối chứng (Bảng 3.8) Do đó, tính toán hàm lượng saponin thu toàn sinh khối khô rễ việc bổ sung SA vào môi trường nuôi cấy nồng độ 20 µl/l giúp tăng tích luỹ hoạt chất lên gấp lần so với đối chứng Bảng 3.8 Ảnh hưởng SA lên khả sinh trưởng rễ tơ Nồng độ SA (µ/l) 10 20 30 40 50 Khối lượng tươi (mg) 247,33a* 174,00b 145,00c 118,67d 96,67d 71,33e Khối lượng khô (mg) 63,33a 32,00b 27,33c 24,33d 21,00e 20,00e Đặc điểm rễ Trắng Vàng nhạt Vàng nhạt Vàng nhạt Vàng Vàng đậm Bảng 3.9 Ảnh hưởng SA lên khả tích lũy saponin rễ tơ Nồng độ SA (µl/l) 10 20 30 40 50 Rg1 (‰) Rb1 (‰) MR2 (‰) 0,162560 0,282477 0,394336 0,886188 0,288974 0,413222 0,062567 0,137013 0,081438 0,053910 0,048578 4,633008 8,707754 22,202239 20,078275 6,660902 5,513122 Tổng saponin (‰) 4,858135 8,990231 22,733588 21,045901 7,003786 5,974923 3.5.3 Ảnh hưởng của abscisic acis (ABA) lên sinh trưởng tích luỹ saponin của rễ tơ Bổ sung ABA vào môi trường nuôi cấy rễ tơ sâm ngọc linh ức chế sinh trưởng rễ, thúc đẩy mạnh mẽ khả tích luỹ saponin rễ nuôi cấy Bảng 3.10 Ảnh hưởng ABA lên khả sinh trưởng rễ tơ Nồng độ ABA (mg/l) Khối lượng tươi (mg) 247,33a* 217,00b Khối lượng khô (mg) 63,33a 51,67b Đặc điểm rễ Trắng Trắng 20 195,67c 153,00d 113,33e 87,67f 39,33c 34,67d 28,00e 24,33f Vàng nhạt Vàng nhạt Vàng Vàng Bảng 3.11 Ảnh hưởng ABA lên khả tích lũy saponin rễ tơ Nồng độ ABA (mg/l) Rg1 (‰) Rb1 (‰) MR2 (‰) 0,162560 0,062567 0,554781 0,061413 0,682291 0,392558 0,732950 0,265778 0,081027 0,033090 0,070097 0,061413 4,633008 22,27585 8,414319 8,452148 8,518925 3,727937 Tổng saponin (‰) 4,858135 22,892046 9,177637 8,877796 9,321972 4,055129 Tại nghiệm thức môi trường nuôi cấy có bổ sung mg/l ABA, khối lượng khô rễ thu giảm 1,2 lần (Bảng 3.10), hàm lượng saponin thu lại tăng gấp 4,7 lần so với đối chứng (Bảng 3.11) Do đó, tính tổng hàm lượng saponin thu toàn sinh khối khô rễ, bổ sung mg/l ABA vào môi trường nuôi cấy giúp gia tăng tích luỹ hoạt chất lên 3,9 lần 3.6 Kết so sánh hàm lượng saponin cấu trúc hình thái rễ tơ rễ bất định 3.6.1 So sánh cấu trúc hình thái bên hình thái giải phẫu rễ tơ rễ bất định Rễ tơ rễ bất định sâm ngọc linh có nhiều điểm tương đồng hình thái cấu trúc giải phẫu tương tự với rễ thông thường, nhiên chúng có đặc trưng riêng Rễ tơ phân nhánh nhanh, mạnh mật độ phân nhánh dày đặc Ở rễ tơ có tượng phân nhánh đối xứng qua trục tính hướng động bất thường Hệ mạch rễ rễ tơ xốp có nhiều lỗ rỗng Trong đó, rễ bất định đặc điểm 3.6.2 So sánh khả sinh trưởng tích luỹ saponin của rễ tơ rễ bất định Khả tích luỹ saponin rễ tơ bất định tương đương 21 Tuy nhiên, tốc độ sinh trưởng rễ tơ cao rễ bất định 1,34 lần, nên dẫn tới hàm lượng saponin thu từ toàn sinh khối khô rễ tơ cao rễ bất định 1,3 lần Bảng 3.12 So sánh khả sinh trưởng tích luỹ saponin rễ tơ rễ bất định 0,3040 0,0140 0,2010 0,5010 Phần thân rễ rễ củ sâm tự nhiên* 5,29 2,00 1,40 8,69 Rễ tơ/rễ bất định (lần) 0,97 557,40 415,20 - 1,34 2,7067 2,0802 - 1,30 Chỉ tiêu theo dõi Rễ tơ Rễ bất định MR2 (%) Rb1 (%) Rg1 (%) Tổng saponin (%) Khối lượng khô rễ/bình nuôi cấy (mg) Tổng saponin chính/bình nuôi cấy (mg) 0,2906 0,0320 0,1630 0,4856 * Trần công luận (2003) Ngoài ra, nhận thấy, rễ tơ tiếp tục sinh trưởng mạnh sau 12 tuần nuôi cấy, ngược lại rễ bất định bắt đầu có tượng hoá nâu ngừng tăng sinh Mặt khác, trình nuôi cấy rễ bất định cần thiết phải bổ sung auxin ngoại sinh (5 mg/l IBA), rễ tơ có khả sinh trưởng môi trường không cần bổ sung chất điều hoà sinh trưởng nên môi trường nuôi cấy rễ tơ không cần bổ sung auxin Điều dẫn tới giảm lo ngại tồn dư chất điều hoà sinh trưởng thực vật sinh khối rễ tơ sâm ngọc linh thu Do vậy, rễ tơ nguồn vật liệu thích hợp cho nghiên cứu nuôi cấy thu nhận sinh khối rễ bằng hệ thống bioreactor, để tạo nguồn dược phẩm phục vụ sức khoẻ CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1 Một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu chuyển gen tạo rễ tơ sâm ngọc linh 4.1.1 Mật độ vi khuẩn, thời gian biến nạp thời gian đồng nuôi cấy 22 Park Facchini (2000) báo cáo rằng chủng vi khuẩn mật độ vi khuẩn có ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu chuyển gen dược liệu Mật độ tế bào vi khuẩn lớn khả xâm nhiễm mạnh, khả chuyển gen cao Ngược lại mật độ vi khuẩn thấp hiệu chuyển gen thấp Tương tự vậy, thời gian lây nhiễm ngắn nồng độ khuẩn xâm nhập vào mẫu biến nạp thấp dẫn đến tỷ lệ chuyển gen thấp, thời gian lây nhiễm dài vi khuẩn có nhiều thời gian để xâm nhập vào mô tế bào thực vật nên khả chuyển gen vào tế bào lớn Ngoài ra, đồng nuôi cấy giai đoạn để vi khuẩn xâm nhập chuyển đoạn T-DNA vào gen thực vật Nếu thời gian đồng nuôi cấy ngắn trình biến nạp chưa xảy hiệu biến nạp thấp, ngược lại thời gian đồng nuôi cấy dài vi khuẩn xâm nhập vào mô nhiều làm khó diệt khuẩn dẫn tới mẫu dễ bị nhiễm lại chết Mặc dù hiệu biến nạp gia tăng tỷ lệ thuận với nồng độ vi khuẩn, thời gian lây nhiễm thời gian đồng nuôi cấy Tuy nhiên yếu tố gia tăng mức, số lượng khuẩn xâm nhập vào mẫu biến nạp nhiều, điều gây ảnh hưởng trực tiếp đến khả sống sót phát triển mô thực vật Ngoài ra, số lượng khuẩn xâm nhập vào mẫu biến nạp nhiều gây ảnh hưởng đến khả diệt khuẩn sau phát triển mô thực vật 4.1.3 Nồng độ acetosyringone Acetonsyringone (AS) có chất phenolic, có tác dụng dẫn dụ vi khuẩn xâm nhập, có vai trò chất kích hoạt vùng gen vir thuộc Ti-plasmid kích thích cho cắt đoạn T-DNA (tại vùng bờ trái bờ phải) để gắn vào genome thực vật, từ giúp gia tăng khả khả chuyển gen vào tế bào (Stachel et al., 1985) Vì vậy, AS thường bổ sung vào môi trường lây nhiễm để gia tăng hiệu biến nạp 4.1.4 Nguồn mẫu Do đặc tính sinh lý khác loại mẫu nên khả nhận gen khả rễ loại mẫu khác khác Mẫu mô sẹo sâm ngọc linh nuôi cấy in vitro cho hiệu chuyển gen cao Theo nghiên cứu Britton đồng tác giả (2008), gen rolB, rolC gen đóng vai trò quan trọng trình cảm ứng tạo rễ tơ kiểu hình rễ tơ thực vật lại cảm 23 ứng auxin Do vậy, sử dụng vật liệu chuyển gen mô sẹo, hàm lượng auxin tích luỹ mô sẹo từ trình nuôi cấy phát sinh nhân nhanh mô sẹo, nên khả tạo rễ tơ cao so với nguồn vật liệu chuyển gen khác 4.1.6 Nhóm kháng sinh diệt khuẩn Việc sử dụng kháng sinh nhằm loại trừ vi khuẩn Agrobacterium dùng chuyển gen khỏi môi trường mô thực vật nuôi cấy cần thiết Tuy nhiên, bổ sung kháng sinh vào môi trường nuôi cấy lại làm chậm sinh trưởng gây độc mô tế bào thực vật Vì cần phải xác định chất kháng sinh với nồng độ phù hợp, mà mẫu mô thực vật không bị tổn thương nhiều mà kháng sinh có tác dụng vi khuẩn Trong nghiên cứu này, nồng độ kháng sinh thích hợp 500 mg/l cefotaxime 4.2 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng dòng rễ tơ chuyển gen sâm ngọc linh 4.2.1 Hàm lượng khoáng Các yếu tố khoáng đóng vai trò quan trọng việc điều hoà sinh trưởng sinh khối rễ tơ (Sivakumar et al., 2005) Ở sâm ngọc linh, nghiên cứu Dương Tấn Nhựt đồng tác giả (2009, 2010a,b, 2012a,b) rằng, môi trường SH báo cáo thích hợp cho sinh trưởng, phát triển mô sâm ngọc linh Vì vậy, thí nghiệm lựa chọn môi trường SH để khảo sát hàm lượng khoáng Kết thu nhận cho thấy, thành phần khoáng đóng vai trò quan trọng tới phát triển rễ tơ, mà tỷ lệ khoáng môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng tới sinh trưởng rễ 4.2.2 pH Giá trị pH môi trường đo dựa vào nồng độ ion H + môi trường; pH ảnh hưởng đến khả hòa tan ion môi trường khoáng, khả đông tụ agar tăng trưởng tế bào (Skirvin et al., 1986) Giá trị pH môi trường nuôi cấy thay đổi ảnh hưởng đến hấp thu dinh dưỡng tế bào nuôi cấy, ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng tế bào (Nguyễn Quang Thạch et al., 2009) Kết nghiên cứu cho thấy, rễ tơ sinh trưởng môi trường có pH điều chỉnh 24 khoảng từ 4,1 - 4,8 cao 6,1 tiêu theo dõi giảm xuống Điều pH môi trường thấp cao làm giảm khả hấp thụ chất dinh dưỡng tế bào từ môi trường, dẫn đến rễ tăng trưởng chậm Do đó, pH điều chỉnh khoảng từ 5,8 đến 6,1 phù hợp cho trình sinh trưởng phát triển rễ tơ sâm ngọc linh sử dụng cho thí nghiệm 4.2.3 Nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hưởng đến trình chuyển gen tạo rễ tơ vào thực vật tác động đến trình sinh lý, sinh hóa rễ tơ giai đoạn nuôi cấy (Muller et al., 2014) Trong nghiên cứu này, nhiệt độ phù hợp cho sinh trưởng rễ tơ sâm ngọc linh 25oC 4.2.4 Hàm lượng đường Đường nguồn cung cấp carbohydate nuôi cấy mô thực vật Mặt khác, nồng độ đường môi trường ảnh hưởng đến áp suất thẩm thấu khả hút chất dinh dưỡng nước thực vật Các nguồn carbohydrate, đặc biệt sucrose, nguồn cung cấp lượng carbon quan trọng cho hầu hết dòng rễ tơ ảnh hưởng đến sản phẩm trao đổi chất thứ cấp nuôi cấy rễ tơ (Kochan et al., 2014) Kochan đồng tác giả (2014) báo cáo tốc độ tăng trưởng khối lượng tươi khô rễ tơ P quinquefolium đạt cao môi trường bổ sung 50 g/l sucrose Kết tương tự với nghiên cứu Trong số nghiên cứu rễ bất định sâm ngọc linh, nồng độ đường sử dụng nuôi cấy rễ bất định thường 30 g/l sucrose (Nhut et al., 2012a; Nhut, Huy, 2012) Như vậy, rễ tơ dường cần nhiều lượng rễ không chuyển gen (rễ bất định) cân bằng hormon rễ tơ thay đổi biểu Ri-T-DNA tích hợp vào hệ gen thực vật (White et al., 1985) 4.2.5 Giá thể nuôi cấy Giá thể agar có chứa số chất vô Ca, Mg, K, Na,… yếu tố cần thiết cho tăng sinh rễ [Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, 2006] Bên cạnh đó, môi trường thạch sử dụng agar có cấu trúc xốp, thông thoáng khí lại tiết kiệm chi phí Vì agar giá thể thích hợp cho nuôi cấy rễ tơ 25 4.3 Ảnh hưởng số chất kích thích (elicitor) lên khả sinh trưởng tích lũy hoạt chất trình nuôi cấy rễ tơ chuyển gen sâm ngọc linh Elicitor sử dụng công cụ quan trọng để sản xuất sản phẩm thứ cấp có hoạt tính sinh học với suất cao giảm chi phí sản xuất (Hussain et al., 2012) MeJA, SA ABA elicitor thuộc nhóm kích thích tăng tích luỹ hoạt chất ức chế sinh trưởng, dó kết thu nghiên cứu cho thấy, ba loại elicitor không phù hợp với sinh trưởng phát triển rễ tơ sâm ngọc linh chuyển gen; nhiên, loại elicitor giúp gia tăng khả tích lũy hoạt chất thứ cấp Mặt khác, mức độ ức chế sinh trưởng rễ nuôi cấy khả giúp tăng tích luỹ hoạt chất ba elicitor khác So với MeJA, SA ABA có tác động mạnh mẽ lên tích lũy hoạt chất rễ tơ sâm ngọc linh Ở nồng độ 20 µ/l SA mg/l ABA, sinh trưởng mẫu rễ có giảm tượng chết mẫu, khả tích lũy hoạt chất rễ lại đạt cao Tính toán hàm lượng saponin tổng số thu toàn sinh khối khô rễ tơ nuôi cấy, bổ sung 20 µ/l SA mg/l ABA vào môi trường nuôi cấy giúp tăng khả tích luỹ hoạt chất lên tương ứng lần 3,9 lần Tại nghiệm thức 150 µl/l MeJA hàm lượng saponin tổng thu cao cao gấp lần so với đối chứng, nhiên khối lượng khô rễ thu lại giảm 2,2 lần so với đối chứng, nên xét hàm lượng saponin tổng số thu toàn sinh khối chất khô rễ tơ sâm thu việc bổ sung MeJA vào môi trường nuôi cấy không hiệu 4.4 Rễ tơ – nguyên liệu tiềm cho nuôi cấy sinh khối Khả tích luỹ saponin rễ tơ rễ bất định tương tự (tỷ lệ saponin tổng rễ tơ/rễ bất định 0,97 lần), tốc độ sinh trưởng rễ tơ cao rễ bất định (1,34 lần) Mặt khác, môi trường nuôi cấy rễ bất định cần thiết phải bổ sung auxin ngoại sinh (5 mg/l IBA); đó, rễ tơ sinh trưởng, phát triển tốt môi trường không cần bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật, 26 vùng biên phải T-DNA (TR-DNA) Ri-plasmid có mang gen aux1-2 mã hóa enzyme kiểm soát tổng hợp auxin đóng vai trò hỗ trợ cho trình cảm ứng khởi tạo rễ; loại bỏ dư lượng chất sản phẩm tạo Hơn rễ tơ có khả sinh trưởng nhanh, phân nhánh cao, kỹ thuật nuôi cấy chuyển gen dễ dàng nuôi cấy tạo sinh khối liên tục, điều có ý nghĩa dây chuyền sản xuất hợp chất thứ cấp hay dược phẩm sinh học tái tổ hợp (Pham, 2009) Vì vậy, rễ tơ nguồn vật liệu thích hợp cho nuôi cấy thu nhận sinh khối bioreactor Khi so sánh với sâm tự nhiên 10 năm tuổi cho thấy, hàm lượng saponin có rễ tơ nuôi cấy thấp nhiều so với sâm tự nhiên Tuy nhiên, sinh trưởng rễ tơ nhanh nhiều so với sâm tự nhiên nên suất saponin thu từ sinh khối rễ tơ hiệu nuôi trồng sâm tự nhiên Điều lại lần khẳng định rằng, nuôi cấy rễ tơ sâm ngọc linh để thu nhận sinh khối chiết suất hoạt chất saponin phương pháp đầy tiềm KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã thu nhận nguồn vật liệu thực vật nuôi cấy in vitro sâm ngọc linh phục vụ cho trình chuyển gen, bao gồm: lá, cuống lá, củ, phôi sinh dưỡng, mô sẹo rễ bất định nuôi cấy in vitro Đã hoàn thiện quy trình chuyển gen tạo rễ tơ sâm ngọc linh: chủng vi khuẩn A rhizogenes ATCC 15834 với nồng độ OD600 = 0,5 lây nhiễm với mô sẹo (kích thước 10 x mm) môi trường SH½ + 30 g/l scurose + 100 μM AS, pH = 5,8 thời gian 20 phút, thời gian đồng nuôi cấy ngày kháng sinh chọn lọc cefotaxim (500 mg/l) Tất dòng rễ thu nhận kiểm tra có mặt gen rolB rolC bằng phương pháp PCR Kết chuyển gen thu tỷ lệ mẫu tạo rễ tơ trung bình 39,81%, tỷ lệ mẫu dương tính với gen rolB rolC 11,90% 27 Môi trường tối ưu cho sinh trưởng dòng rễ tơ môi trường SH có bổ sung 50 g/l sucrose, g/l agar, pH = 5,8 - 6,1; bình nuôi cấy đặt tối, nhiệt độ 25oC MeJA, SA ABA ức chế sinh trưởng rễ tơ sâm ngọc linh, lại kích thích gia tăng tích luỹ hoạt chất saponin rễ nuôi cấy Trong đó, SA ABA cho hiệu cao so với MeJA Tổng hàm lượng saponin thu toàn sinh khối khô rễ tơ nuôi cấy môi trường có bổ sung 20 µ/l SA mg/l ABA tăng lên tương ứng lần 3,9 lần so với đối chứng Khả tích luỹ saponin rễ tơ rễ bất định sâm ngọc linh tương tự nhau, tốc độ sinh trưởng rễ tơ nhanh rễ bất định Thêm vào đó, rễ tơ sinh trưởng môi trường không bổ sung chất điều hoà sinh trưởng thực vật nên loại bỏ lo ngại tồn dư chất sản phẩm thu Do vậy, rễ tơ sâm ngọc linh nguồn vật liệu thích hợp cho nuôi cấy sinh khối thu nhận hợp chất saponin KIẾN NGHỊ Tiếp tục trì sinh trưởng dòng rễ tơ thu nhận có nghiên cứu đánh giá tính ổn định di truyền khả tích luỹ saponin dòng rễ tơ Từ đó, chọn lọc dòng rễ tơ sinh trưởng mạnh nhất, chứa hàm lượng saponin cao có tính di truyền ổn định để làm dòng chuẩn cho nghiên cứu sau 2424 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI Trịnh Thị Hương, Hồ Thanh Tâm, Hà Thị Mỹ Ngân, Ngô Thanh Tài, Nguyễn Phúc Huy, Hoàng Xuân Chiến, Nguyễn Bá Nam, Vũ Quốc Luận, Vũ Thị Hiền, Nguyễn Thị Thúy Hường, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà, Dương Tấn Nhựt (2012) Ảnh hưởng nguồn mẫu, kích thước mẫu số loại auxin lên khả tái sinh rễ bất định sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nuôi cấy in vitro Tạp chí Công nghệ Sinh học 10(4A): 877-886 Nguyễn Hồng Hoàng, Trịnh Thị Hương, Lê Kim Cương, Vũ Thị Hiền, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Phúc Huy, Vũ Quốc Luận, Hà Thị Mỹ Ngân, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà, Dương Tấn Nhựt (2014) Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng rễ tơ sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) chuyển gen Tạp chí Công nghệ Sinh học 12(3): 467-476 Trịnh Thị Hương, Nguyễn Hồng Hoàng, Vũ Thị Hiền, Hoàng Thanh Tùng, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Phúc Huy, Vũ Quốc Luận, Bùi Thế Vinh, Trần Đình Phương, Lâm Diệp Thảo, Phạm Bích Ngọc, Trần Công Luận, Chu Hoàng Hà, Dương Tấn Nhựt (2015) Ảnh hưởng số elicitor lên sinh trưởng tích lũy hoạt chất rễ tơ sâm ngọc linh chuyển gen Tạp chí Công nghệ Sinh học 13(3): 843-851 Dương Tấn Nhựt, Hoàng Thanh Tùng, Trịnh Thị Hương, Nguyễn Hồng Hoàng, Vũ Thị Hiền, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Phúc Huy, Vũ Quốc Luận, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà, Trần Thị Thùy An, Trần Đình Phương, Nguyễn Thị Thu Hương, Trần Công Luận (2015) Đánh giá tác dụng tăng lực saponin rễ tơ chuyển gen sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Tạp chí Công nghệ Sinh học 13(1): 75-82 Trịnh Thị Hương, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà, Dương Tấn Nhựt (2016) Đánh giá khả sinh trưởng tích luỹ saponin rễ bất định rễ tơ sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Tạp chí công nghệ sinh học 14(3): 1-6 2424 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ½SH: : Môi trường SH có thành phần khoáng đa lượng giảm nửa 2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid ABA : Abscisic acid AS : Acetosyringone HPLC : Sắc ký lỏng hiệu cao IAA : Indole-3-acetic acid IBA : Indole-3-butyric acid JA : Jasmonic acid MeJA : Methyl jasmonic acid MS : Môi trường khoáng Murashige Skoog, 1962 NAA : Naphthaleneacetic acid OD : Độ đục vi khuẩn (Optical density) PCR : Polymerase Chain reaction Ri-plasmid : Root-inducing plasmid SA : Salicylic acid SH : Môi trường SH có thành phần vitamin tăng gấp đôi SH + 2VTM : Môi trường khoáng SH (Schenck Hildebrandt) SH½ : Môi trường SH có thành phần dinh dưỡng giảm nửa TDZ : Thidiazuron YMB : Môi trường YMB (Yeast mannitol broth) ... gen tạo rễ tơ sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv. ) làm vật liệu cho nuôi cấy sinh khối Mục tiêu đề tài Thu nhận dòng rễ tơ chuyển gen sâm ngọc linh có khả sinh trưởng nhanh, ổn định... liệu cho nuôi cấy sinh khối để thu nhận hợp chất saponin, dòng rễ tơ sâm ngọc linh sinh trưởng nhanh, ổn định làm vật liệu cho nuôi cấy sinh khối rễ để thu nhận hợp chất saponin Nghiên cứu mở... trình chuyển gen tạo rễ tơ vào thực vật tác động đến trình sinh lý, sinh hóa rễ tơ giai đoạn nuôi cấy (Muller et al., 201 4) Trong nghiên cứu này, nhiệt độ phù hợp cho sinh trưởng rễ tơ sâm ngọc linh