Nghiên cứu chuyển gen tạo rễ tơ sâm ngọc linh (panax vietnamensis ha et grushv ) làm vật liệu cho nuôi cấy sinh khối

Tuynhiên, trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật cần phải bổsung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật vào môi trường nuôi cấy.Vấn đề này là một trong những trở ngại lớn

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TRỊNH THỊ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN TẠO RỄ TƠ SÂM

NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

LÀM VẬT LIỆU CHO NUÔI CẤY SINH KHỐI

Công trình được hoàn thành tại Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên

và Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

Vào hồi ngày tháng năm 2017

Có thể tìm hiểu luận án tại:

 Thư viện Quốc gia Việt Nam

 Viện Công nghệ Sinh học

 Trang web của Bộ GDĐT

MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài

Sâm ngọc linh là cây dược liệu quý và đặc hữu cho vùng sinh tháinhất định Thời gian sinh trưởng của cây chậm, cần tới 6 năm mới cóthể bắt đầu thu hoạch và 7 - 10 năm mới thu được củ sâm chất lượng tốt.Trong khi đó, việc khai thác bừa bãi và không có phương pháp quản lýhiệu quả đã dẫn đến không đủ đáp ứng nhu cầu cung cấp nguyên liệucho các ngành dược liệu, mỹ phẩm,

Những năm gần đây, cùng với xu hướng chung trên thế giới, ở nước

ta hướng nghiên cứu công nghệ sinh khối tế bào thực vật để sản xuất cácsản phẩm thứ cấp đã bắt đầu được quan tâm đầu tư phát triển Tuynhiên, trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật cần phải bổsung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật vào môi trường nuôi cấy.Vấn đề này là một trong những trở ngại lớn cho các nhà nghiên cứu, dotồn dư của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong sinh khối tế bàonuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến sản phẩm và sức khỏe người sử dụng.Vấn đề này hoàn toàn có thể khắc phục trong nuôi cấy sinh khối từ rễ tơ

vì rễ tơ có thể sinh trưởng tốt trên môi trường không cần bổ sung cácchất điều hòa sinh trưởng thực vật Hơn nữa, các rễ tơ có khả năng sinhtrưởng nhanh, phân nhánh cao; có thể nuôi cấy tạo sinh khối liên tục vàkhông bị ảnh hưởng của dư lượng chất điều hòa sinh trưởng thực vật,điều này có ý nghĩa trong dây chuyền sản xuất các hợp chất thứ cấp haycác dược phẩm sinh học tái tổ hợp Ngoài ra, rễ tơ có thể sản xuất mộtlượng lớn các hợp chất thứ cấp và là cơ quan biệt hóa nên nuôi cấy rễ tơ

có sự di truyền ổn định hơn nuôi cấy huyền phù tế bào và mô sẹo Xuấtphát từ các ưu điểm của rễ tơ và do những hợp chất dược liệu quý củasâm ngọc linh chủ yếu thu được từ rễ nên chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu chuyển gen tạo rễ tơ sâm ngọc linh (Panax vietnamensis

Ha et Grushv.) làm vật liệu cho nuôi cấy sinh khối”

Mục tiêu của đề tài

Thu nhận được các dòng rễ tơ chuyển gen sâm ngọc linh có khả năngsinh trưởng nhanh, ổn định và chứa hàm lượng saponin thiết yếu củasâm

Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài cho thấy có khả năng chuyển genmong muốn vào cây sâm ngọc linh, loài cây dược liệu quý hiếm và rấtkhó nhân giống Mặt khác, kết quả của đề tài cũng tạo ra được nguồndược liệu quý, giúp giảm khai thác trong tự nhiên và góp phần bảo tồnnguồn gen quý hiếm của loài sâm quý giá này

Những đóng góp mới của luận án

Nghiên cứu đã tạo được nguồn vật liệu mới cho nuôi cấy sinh khối

để thu nhận hợp chất saponin, đó là các dòng rễ tơ sâm ngọc linh sinhtrưởng nhanh, ổn định làm vật liệu cho nuôi cấy sinh khối rễ để thunhận hợp chất saponin Nghiên cứu cũng mở ra triển vọng mới đầy tiềmnăng là nuôi cấy sinh khối rễ tơ ở quy mô thương mại để thu nhậnnguồn nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng, mỹ phẩm vàdược phẩm

Kết cấu của luận án

Luận án gồm 154 trang (kể cả tài liệu tham khảo) chia thành cácphần: Phần mở đầu 2 trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu, 31 trang;Chương 2: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu, 20 trang;Chương 3: Kết quả, 52 trang; Chương 4: Bàn luận kết quả nghiên cứu,

23 trang; Kết luận và đề nghị, 2 trang; Các công trình đã công bố liênquan đến luận án, 1 trang; Summary, 4 trang; Phần tài liệu tham khảo,

19 trang với 169 tài liệu tham khảo bằng tiếng Việt và tiếng Anh Luận

án có 31 bảng, 34 hình

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Những thành tựu nghiên cứu về cây sâm ngọc linh (Panax

vietnamensis Ha et Grushv.)

1.1.1 Giới thiệu về cây sâm ngọc linh

Cây sâm ngọc linh (hay sâm Việt Nam) có tên khoa học là Panax

vietnamensis Ha et Grushv là cây thuốc giấu của đồng bào dân tộc Xê

Đăng sống trên vùng núi cao thuộc hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam.Loài sâm này xuất hiện ở độ cao 1.500 m trở lên so với mực nướcbiển Từ 1.700 - 2.000 m, cây mọc tập trung thành quần thể dọc bờ suối,

có độ ẩm trên 80%, đất nhiều mùn hữu cơ, dưới tán rừng hỗn giao giữa

lá rộng và lá kim

Theo các nghiên cứu khoa học, sâm ngọc linh có tác dụng chốngtrầm cảm, kích thích hệ miễn dịch, chống lão hóa, phòng chống ung thư,bảo vệ tế bào gan, tăng thị lực, sức đề kháng, nâng cao huyết áp ở người

bị huyết áp thấp, Phân tích các hợp chất hóa học cho thấy sâm ngọclinh có chứa tới 52 saponin (sâm Triều Tiên có khoảng 25 saponin),trong đó có 26 saponin có cấu trúc đã biết

1.1.2 Tình hình của loài sâm ngọc linh hiện nay

Sâm ngọc linh là loài sâm đặc hữu, chỉ sinh trưởng trong những vùngsinh thái nhất định Thêm vào đó là thời gian nuôi trồng sâm kéo dài,thường cần tới 6 năm mới có thể thu hoạch và 7 - 10 năm mới thu được

củ sâm có chất lượng tốt, đã dẫn tới xảy ra tình trạng sâm bị khai tháctrộm trước thời gian được phép thu hoạch Nhiều chương trình di thựcsâm ngọc linh đã được tiến hành từ nhiều năm nay nhưng kết quả vẫncòn những hạn chế nhất định Do vậy, các chế phẩm từ sâm ngọc linhcũng được sản xuất rất ít, thậm chí ngưng sản xuất vì thiếu nguồnnguyên liệu

Hiện nay, nuôi cấy sinh khối từ rễ tơ có nguồn gốc từ vi khuẩn

Agrobacterium rhizogenes đang được xem là một giải pháp tạo nguồn

dược phẩm sạch phục vụ sức khoẻ cộng đồng Rễ tơ có thể sinh trưởng,phát triển tốt trên môi trường không cần bổ sung chất điều hoà sinhtrưởng thực vật Hơn nữa, các rễ tơ có khả năng sinh trưởng nhanh,phân nhánh cao, kỹ thuật nuôi cấy, chuyển gen dễ dàng, có thể nuôi cấytạo sinh khối liên tục và có sự ổn định di truyền hơn so với nuôi cấy

huyền phù tế bào và mô sẹo Vì vậy, nuôi cấy rễ tơ sâm ngọc linh có thểxem như là một giải pháp để thu nhận nguồn nguyên liệu sâm sạch Do

đó các nghiên cứu về chuyển gen thu nhận rễ tơ và nhân nhanh sinhkhối rễ tơ cây sâm này là rất cần thiết

1.2 Agrobacterium rhizogenes và ứng dụng trong nuôi cấy tạo rễ tơ

để thu nhận các hợp chất thứ cấp ở thực vật

1.2.1 Agrobacterium rhizogenes và cơ chế chuyển gen

Agrobacterium rhizogenes thuộc chi Agrobacterium, là vi khuẩn đất

hình que, gram âm, gây ra hội chứng rễ tơ, được đặc trưng bởi sự xuất

hiện các rễ tại vị trí vết thương của cây bị nhiễm bệnh A rhizogenes

mang Ri plasmid (Root-inducing), và plasmid này đã được xác định làtác nhân gây bệnh rễ tơ ở các mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm (Chilton

et al., 1982) Khi tế bào thực vật bị thương tiết ra các polyphenol hấp

dẫn các vi khuẩn, tại đây nó chuyển một đoạn T-DNA (transfer DNA)

từ Ri-plasmid vào hệ gen của tế bào vật chủ Ri-plasmid là phân tửDNA mạch vòng, sợi kép có trọng lượng phân tử lớn từ 200 - 800 kpgồm 2 vùng chính là T-DNA và vùng vir (virulence)

Các chủng A rhizogenes khác nhau cũng khác nhau về khả năng

chuyển T-DNA từ vi khuẩn vào bộ gen thực vật và các rễ tơ do cácchủng khác nhau đó gây ra cũng biểu hiện các hình thái khác nhau (Giri

et al., 2001) Chủng A rhizogenes thuộc dạng agropine là chủng có độc

tính mạnh, được đặc trưng bởi các Ri-plasmid: pRiA4, pRi1855 hoặcpRiLBA9402 (Veena, Taylor, 2007), và các chủng này được sử dụngchủ yếu trong các nghiên cứu tạo rễ tơ ở thực vật Chúng có thể tích hợpmột cách độc lập hai vùng T-DNA riêng biệt vào hệ gen thực vật Một

vùng mang các gen rol chịu trách nhiệm về các kiểu hình rễ tơ (gọi là

vùng biên trái, TL-DNA), trong khi đó, vùng còn lại mang gen aux1-2

mã hóa các enzyme kiểm soát sự tổng hợp auxin (gọi là vùng biên phải,

TR-DNA) TR-DNA đóng vai trò hỗ trợ cho quá trình cảm ứng khởi tạo

rễ vì nó mang gen aux1-2, ngoài ra TR-DNA cũng mang gen mã hóatổng hợp opine Trình tự của TL-DNA bao gồm 18 khung đọc mở(ORFs), trong đó có 4 loci 10, 11, 12 và 15 tương ứng mã hóa cho các

gen rolA, B, C và D Các chủng A rhizogenes khác bao gồm dạng

mannopine, cucumopine và mikimopine tương ứng với các Ri-plasmid

là pRi8196, pRi2659 và pRi1724, thì chứa vùng T-DNA đơn có cấu trúcgiống như vùng TL-DNA của các chủng thuộc nhóm agropine nhưng

khuyết gen rolD, tuy nhiên chúng cũng có khả năng cảm ứng hình thành các rễ tơ bởi các gen rol (Britton, Escobar, 2008).

1.2.2 Ứng dụng Agrobacterium rhizogenes trong nuôi cấy tạo rễ tơ để thu nhận hợp chất thứ cấp ở thực vật

Hiện nay, nuôi cấy rễ tơ có nguồn gốc từ vi khuẩn A rhizogenes đã được nghiên cứu rộng rãi để sản xuất in vitro các chất chuyển hóa thực

vật, hàm lượng chất chuyển hoá thu được tương tự hoặc cao hơn hàmlượng chất chuyển hoá có mặt trong rễ cây hoang dại hoặc trong cây

trồng (Caspeta et al., 2005) Sự ổn định di truyền của rễ tơ đáp ứng

được cho sản xuất ổn định các chất chuyển hóa thứ cấp của chúng.Tương tự như vậy, các chất chuyển hóa thứ cấp có trong loài hoang dạithường được bảo tồn trong rễ tơ

Ở nước ta, các nghiên cứu chuyển gen để tạo rễ tơ đã được tiếnhành thành công trên một số loài cây có giá trị Tuy nhiên, các nghiêncứu về rễ tơ trong nước cũng chỉ mới dừng lại ở quy mô phòng thínghiệm, mà chưa được ứng dụng rộng rãi để sản xuất các sản phẩmthương mại hoá

1.3 Ứng dụng elicitor trong nghiên cứu sinh tổng hợp các hợp chất biến dưỡng thứ cấp ở thực vật

1.3.1 Khái niệm về elicitor

Elicitor là các nhân tố sinh học hay hóa học từ các nguồn khác nhau

có thể dẫn đến các biến đổi hình thái thực vật Theo nghĩa rộng, đối vớithực vật, elicitor có liên quan đến các hợp chất có thể khởi động cácphản ứng hình thái và sinh lý dẫn đến sự tích tụ của phytoalexin

1.3.2 Ứng dụng elicitor để kích thích tăng tích luỹ các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào thực vật

Elicitor có thể được sử dụng như là một trong những công cụ quantrọng để sản xuất các sản phẩm thứ có cấp hoạt tính sinh học với năng

suất cao hơn và giảm chi phí sản xuất (Hussain et al., 2012) Có nhiều

báo cáo cho thấy rằng elicitor đã giúp tăng sản xuất các phytoalexinisoflavonoid, phytoalexin serquiterpenoid, coumarin, podophyllotoxin,azadirachtin, terpenoid, hypericin (hypericin và pseudohypericin) và

hyperforin, capsaicinoid, vascicine (Gao et al., 2011, Coste et al., 2011, Gururaj et al., 2012, Bhambhani et al., 2012).

Mặt khác, elicitor cũng đã được sử dụng để làm sáng tỏ các con

đường chuyển hóa phức tạp (Moreno et al., 1996), để mô tả sự tương tác

giữa các phản ứng stress sinh học và phi sinh học ở mức độ phân tử(Atkinson, Urwin, 2012) Ngoài ra còn có các nghiên cứu đã được công

bố để đánh giá sự ảnh hưởng của elicitor tới enzyme trao đổi chất thứcấp (Zenk, 1991), các phân tử tín hiệu quan trọng làm trung gian của các

phản ứng kháng ở thực vật (Bux et al., 2012), nổ oxy hoá (Davis et al.,

1993), tín hiệu dẫn truyền phytoalexin (Preisig, 1994) và các kênh anion

(Zimmermann et al., 1998) Bên cạnh đó, elicitor có thể được sử dụng

để nghiên cứu các tính chất hóa học và con đường truyền tín hiệu củacác chất tự nhiên tiết ra bởi vi sinh vật, động vật ăn cỏ và thực vật trongthời gian nhiễm bệnh, ăn cỏ, cộng sinh và tương tác allelopathic (Maffei

et al., 2012)

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

2.1.1 Vật liệu thực vật

Nguyên liệu thực vật được sử dụng trong nghiên cứu tạo rễ bất định

là các mẫu lá, cuống lá, củ, mô sẹo của cây sâm ngọc linh nuôi cấy in

vitro

Nguyên liệu thực vật được sử dụng trong nghiên cứu chuyển gen làcác mẫu lá, cuống lá, củ, mô sẹo, phôi, rễ bất định của cây sâm ngọc

linh nuôi cấy in vitro

Nguyên liệu thực vật được sử dụng trong nghiên cứu nhân nhanh rễ

tơ và các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của elicitor tới khả tăng tíchluỹ hoạt chất saponin là dòng rễ tơ chuyển gen có khả năng sinh trưởngnhanh và ổn định

2.1.2 Các chủng vi khuẩn

Chủng Agrobacterium rhizogenes ATCC15834 mang vector PTN289, mang gen chỉ thị là gen gus được sử dụng để tối ưu hoá quy

trình chuyển gen

Chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC15834 dạng dại

được sử dụng để chuyển gen thu nhận các dòng rễ tơ sâm ngọc linh

Cả hai chủng vi khuẩn đều do phòng Công nghệ tế bào thực vật –Viện Công nghệ sinh học cung cấp.

2.2 Các phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật sử dụng

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.2 Phương pháp chuyển gen tạo rễ tơ vào sâm ngọc linh thông qua

Agrobacterium rhizogenes

2.2.3 Phương pháp kiểm tra sự có mặt của gen rol ở các dòng rễ tơ

2.2.4 Phương pháp chiết xuất và xác định các hoạt chất chính từ khối tếbào sâm

2.2.5 Phương pháp giải phẫu hình thái tế bào thực vật

2.3 Bố trí thí nghiệm

2.3.1 Nuôi cấy thu nhận nguồn vật liệu sâm ngọc linh in vitro

2.3.1.1 Nghiên cứu nuôi cấy thu nhận mô sẹo

2.3.1.2 Nghiên cứu nuôi cấy thu nhận rễ bất định

2.3.2 Nghiên cứu quy trình chuyển gen tạo rễ tơ ở sâm ngọc linh

2.3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới hiệu quả chuyểngen

2.3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn tới hiệu quảchuyển gen

2.3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ acetosyringone (AS) tớihiệu quả chuyển gen

2.3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn mẫu thực vật tới hiệu quảchuyển gen

2.3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quảchuyển gen

2.3.2.6 Ảnh hưởng của các nhóm kháng sinh diệt khuẩn lên sự sinhtrưởng phát triển của mô sâm ngọc linh

2.3.3 Chuyển gen và thu nhận các dòng rễ tơ chuyển gen

2.3.3.1 Chuyển gen và thu nhận các dòng rễ sâm ngọc linh

2.3.3.2 Đánh giá kết quả chuyển gen bằng phương pháp PCR

2.3.4 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng nhân nhanh các dòng rễ tơ chuyển gen sâm ngọc linh

2.3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng khoáng lên khả năng nhânnhanh rễ tơ

2.3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của độ pH của môi trường lên khả năng nhânnhanh rễ tơ

2.3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng nhânnhanh rễ tơ

2.3.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường lên khả năng nhânnhanh rễ tơ

2.3.4.5 Khảo sát ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy lên khả năng nhânnhanh rễ tơ

2.3.4.6 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đặc và lỏng lắc lên

sự sinh trưởng của rễ tơ

2.3.5 Nghiên cứu một số elicitor có tác dụng làm tăng tích lũy hoạt chất trong quá trình nuôi cấy rễ tơ chuyển gen sâm ngọc linh

2.3.5.1 Khảo sát ảnh hưởng của methyl jasmonate (MeJA) lên khả năngsinh trưởng và tích luỹ saponin của rễ tơ

2.3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của salicylic acid (SA) lên khả năng sinhtrưởng và tích luỹ saponin của rễ tơ

2.3.5.3 Khảo sát ảnh hưởng của abscisic acid (ABA) lên khả năng sinhtrưởng và tích luỹ saponin của rễ tơ

2.3.6 So sánh cấu trúc hình thái giải phẫu, khả năng sinh trưởng và tích luỹ saponin giữa rễ tơ và rễ bất định

2.3.6.1 So sánh cấu trúc hình thái bên ngoài và hình thái giải phẫu giữa

rễ tơ và rễ bất định

2.3.6.2 So sánh khả năng sinh trưởng và tích luỹ saponin của rễ tơ và rễbất định

2.4 Điều kiện nuôi cấy

Tất cả các thí nghiệm nuôi cấy được tiến hành ở nhiệt độ phòng: 25

± 2oC; ẩm độ trung bình 55 - 60%, thí nghiệm nuôi cấy cây sâm ngọclinh và mô sẹo được đặt ở điều kiện chiếu sáng khoảng 2.500 lux, thínghiệm nuôi cấy tái sinh rễ bất định và rễ tơ được trong điều kiện tốihoàn toàn

2.5 Địa điểm nghiên cứu

Các nghiên cứu được thực hiện tại: Phòng thí nghiệm Công nghệ tếbào thực vật - Viện Công nghệ sinh học; Phòng Sinh học phân tử vàChọn tạo giống cây trồng - Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên;Trung tâm sâm và dược liệu Tp HCM

2.6 Xử lý thống kê

Mỗi thí nghiệm được thực hiện với 3 - 5 lần lặp lại Các số liệu thunhận được xử lý bằng phần mềm Excel và phần mềm phân tích thống kêSPSS 16.0 theo phương pháp Duncan với α ≤ 0,05 (Duncan, 1995)

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Kết quả nuôi cấy thu nhận nguồn vật liệu sâm ngọc linh in vitro

3.1.1 Nuôi cấy thu nhận mô sẹo

Các nguồn mẫu lá, cuống lá và củ của sâm ngọc linh được nuôi cấytrên môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D; 0,2 mg/l TDZ; 30 g/lsucrose; 8 g/l agar; pH = 5,8 Sau 8 tuần nuôi cấy, kết quả thu được chothấy nguồn mẫu thích hợp nhất cho sự phát sinh mô sẹo là củ của sâmngọc linh (tỷ lệ tăng sinh đạt 9,71 lần)

3.1.2 Nuôi cấy thu nhận rễ bất định sâm ngọc linh

Các nguồn mẫu lá, cuống lá, củ và mô sẹo của sâm ngọc linh đượcnuôi cấy trên môi trường SH có chứa 30 g/l sucrose; 8 g/l agar; pH = 5,8

và bổ sung thêm một trong ba loại auxin riêng lẻ (IAA, IBA, NAA) ởcác nồng độ khác nhau: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 mg/l

Sau 8 tuần nuôi cấy, kết quả thu được cho thấy, nồng độ IAA, IBA,NAA tối ưu nhất bổ sung vào môi trường nuôi cấy cho sự tái sinh rễ bấtđịnh lần lượt là 5 mg/l IAA; 5 mg/l IBA, 3 mg/l NAA Trong 3 loạiauxin sử dụng, thì IBA (5 mg/l) cho hiệu quả tái sinh rễ cao nhất Nguồnmẫu thích hợp nhất cho sự tái sinh rễ bất định là mẫu lá với kích thước1,5 x 1,5 cm

3.2 Kết quả tối ưu quy trình chuyển gen tạo rễ tơ ở sâm ngọc linh

3.2.1 Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới hiệu quả chuyển gen

Các mẫu mô sâm ngọc linh được lây nhiễm trong môi trường huyềnphù vi khuẩn với mật độ OD600 = 0; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9 Thời gian lâynhiễm là 20 phút Sau đó các mảnh cấy được chuyển lên môi trườngđồng nuôi cấy trong 2 ngày Sau khi đồng nuôi cấy, tiến hành đánh giá

sự biểu hiện tạm thời của gen gus được biến nạp vào trong tế bào Kết

quả thu được cho thấy, nồng độ vi khuẩn thích hợp nhất cho chuyển gentạo rễ tơ sâm ngọc linh là OD600 = 0,5

3.2.2 Ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến hiệu quả chuyển gen

Các khoảng thời gian biến nạp khác nhau: 10, 20, 30 phút đượcchúng tôi khảo sát Kết quả thu được cho thấy, 20 phút là khoảng thờigian biến nạp thích hợp nhất cho chuyển gen

3.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ Acetosyringone (AS) đến hiệu quả chuyển gen

AS được bổ sung vào môi trường lây nhiễm ở các nồng độ khácnhau: 0, 50, 100, 150, 200 μM để gia tăng hiệu quả chuyển gen TrongM để gia tăng hiệu quả chuyển gen Trong

đó, nồng độ AS thích hợp nhất là 100 μM để gia tăng hiệu quả chuyển gen TrongM

3.2.4 Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến hiệu quả chuyển gen

Các mẫu lá, cuống lá, mô sẹo, phôi sinh dưỡng, rễ bất định và lát cắt

củ in vitro được sử dụng làm vật liệu nhận gen chuyển Kết quả thu được cho thấy, sự biểu hiện tạm thời gen gus ở các loại mẫu mô là khác

nhau Các mẫu mô sẹo có sự biểu hiện gen gus (86%) cao hơn so với các vật liệu chuyển gen còn lại Tỷ lệ mẫu biểu hiện gen gus ở mô rễ là

thấp nhất (27%)

Khi đánh giá khả năng ra rễ tơ của các nguồn vật liệu chuyển gen,chúng tôi nhận thấy mẫu mô sẹo và mẫu phôi có khả năng tạo rễ caohơn các mẫu còn lại, trong đó mẫu mô sẹo tạo rễ nhiều nhất Mẫu rễ bấtđịnh sau khi khi lây nhiễm với vi khuẩn thì không có sự tạo thành rễmới Ba loại mẫu còn lại là cuống lá, lá và lát cắt củ có sự phát sinh rễ,tuy nhiên các rễ có nguồn gốc từ lá và cuống lá sâm ngọc linh khôngphát triển tiếp sau khi tạo thành Vì vậy, mô sẹo là nguồn vật liệu thíchhợp nhất để chuyển gen tạo rễ tơ ở sâm ngọc linh

3.2.5 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen

Các khoảng thời gian đồng nuôi cấy khác nhau: 1 ngày, 2 ngày và 3ngày được khảo sát Kết quả thu được cho thấy, thời gian đồng nuôi cấythích hợp là 2 ngày

3.2.6 Ảnh hưởng của các nhóm kháng sinh diệt khuẩn lên sự sinh trưởng và phát triển của mô sâm ngọc linh

Sau thời gian đồng nuôi cấy, các mẫu mô sâm được đặt vào các môitrường SH + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar, pH = 5,8 và có bổ sung các loạikháng sinh riêng lẻ hoặc kết hợp với nồng độ khác nhau: vancomycin(100 mg/l), carbenicilin (200, 400 mg/l), cefotaxime (250, 300, 500mg/l) Đối chứng là môi trường không bổ sung kháng sinh Kết quả thuđược cho thấy, cefotaxime với nồng độ 500 mg/l là thích hợp nhất chocác thí nghiệm chuyển gen tạo rễ tơ sâm ngọc linh

3.3 Kết quả chuyển gen và thu nhận các dòng rễ tơ chuyển gen

3.3.1 Kết quả chuyển gen và thu nhận các dòng rễ sâm ngọc linh

Dựa trên kết quả thí nghiệm tối ưu hóa quy trình chuyển gen thông

qua vi khuẩn A.rhizogenes mang vector PTN289 ở nội dung 3.2, chúng

tôi đã tiến hành 8 lô thí nghiệm chuyển gen với chủng ATCC 15834dạng dại, sử dụng vật liệu thực vật là mô sẹo

Kết quả thu được cho thấy, các mô sẹo cảm ứng tạo rễ tơ sau 4 - 6tuần chuyển gen Tỷ lệ tạo rễ tơ trung bình của 8 lô thí nghiệm là

39,81%, trong đó tỷ lệ tạo rễ tơ ở mỗi lô thí nghiệm cao nhất là 45%

và thấp nhất là 33,75%

3.3.2 Kết quả đánh giá các dòng rễ tơ bằng phương pháp PCR

Tỷ lệ mẫu dương tính với gen rolB và rolC ở các lô thí nghiệm đạt

được thấp nhất là 8,61% và cao nhất là 15% Tỷ lệ mẫu mẫu dương

tính với gen rolB và rolC trung bình của cả 8 lô thí nghiệm là

11,90%

3.4 Kết quả nghiên cứu điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng nhân nhanh các dòng rễ tơ chuyển gen sâm ngọc linh

3.4.1 Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng lên sự sinh trưởng của rễ tơ

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng khác nhau lên khả năng sinh

trưởng của rễ tơ

Môi trường

khoáng

Khối lượng tươi (mg)

Khối lượng khô (mg) Số lượng rễ (rễ/mẫu) Chiều dài rễ (cm)

Môi trường khoáng thích hợp nhất là SH

3.4.2 Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của rễ tơ

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của rễ tơ

Độ pH Khối lượng tươi (mg) Khối lượng khô (mg) Số lượng rễ (rễ/mẫu) Chiều dài rễ (cm)