nghiên cứu khảo sát điều kiện chuyển gen tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn agrobacterium rhizogenes ở sâm ngọc linh (panax vietnamensis ha et grushv)

Trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật nhằm làm giảm hoặc mất tính biệt hóa ở các mô tế bào nuôi cấy người ta cần thiết phải bổ sung các chất ñiều hòa sinh trưởng vào tro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-
-

ðINH THỊ LAN

NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT ðIỀU KIỆN CHUYỂN GEN TẠO RỄ TƠ THÔNG QUA VI KHUẨN

AGROBACTERIUM RHIZOGENES Ở SÂM NGỌC LINH

(PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV)

LỜI CAM ðOAN

- Tôi xin cam ñoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa ñược công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào

- Tôi xin cam ñoan mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

ðinh Thị Lan

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS TS Chu Hoàng

Hà, GS TS Nguyễn Quang Thạch, TS Phạm Bắch Ngọc ựã tận tình hướng dẫn,

giúp ựỡ và tạo ựiều kiện cho tôi hoàn thành chương trình học tập, thực hiện ựề tài và hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp

Tôi cũng xin ựược trân trọng cảm ơn KS Nguyễn Khắc Hưng, KS Nguyễn

đình Trọng và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Công nghệ

Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam ựã nhiệt tình giúp ựỡ tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu ựề tài

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn thầy cô trong Khoa Công nghệ Sinh học Học viện Nông nghiệp Việt Nam ựã hướng dẫn, truyền ựạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Tôi cũng chân thành cảm ơn những người thân trong gia ựình và bạn bè ựã tạo ựiều kiện giúp ựỡ, ựộng viên tôi thực hiện ựề tài và hoàn thành bản luận văn tốt nghiệp

Hà nội, tháng 07 năm 2014

Tác giả luận văn

đinh Thị Lan

1.4.1 Nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật 23

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.5.1 Tiến hành với chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC15834

2.5.2 Tiến hành chuyển gen vào sâm Ngọc Linh với chủng Agrobacterium

rhizogenes ATCC15834 ñể kiểm tra lại quy trình và cảm ứng ra rễ 33

3.1 Khảo sát khả năng chuyển gen vào sâm Ngọc Linh nhờ vi khuẩn

Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 có chứa gen gusA 44

3.1.1 Ảnh hưởng của nguồn mẫu ñến hiệu quả chuyển gen nhờ vi khuẩn

3.1.3 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm ñến hiệu quả chuyển gen nhờ vi

3.1.4 Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến hiệu quả chuyển gen nhờ

3.1.5 Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ñến hiệu

3.1.6 Kết quả chuyển gen ở sâm Ngọc Linh thông qua vi khuẩn A.Rhizogenes 53

3.2 Chuyển gen tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn A rhizogenes ATCC 15834 54

3.2.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ chất cảm ứng acetonsyringone (AS) ñến khả

3.2.5 Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn A rhizogenes ñến khả năng tạo rễ tơ 63

Rol : Root locus

SH : Schenk và Hildebrandt, 1972

Vir : Virulence genes

WPM : Woody Plant Medium

YMB : Yeast Malnitol Broth

DANH MỤC BẢNG

1.1 Hàm lượng saponin của sâm Việt Nam và các loài Panax trồng trọt 8 3.1 Ảnh hưởng của nguồn mẫu ñến hiệu quả chuyển gen nhờ vi khuẩn

3.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ chất cảm ứng acetonsyringone ñến hiệu quả

chuyển gen nhờ vi khuẩn A rhizogenes qua biểu hiện của gen gus 47 3.3 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm vi khuẩn A rhizogenes ñến hiệu

quả chuyển gen qua biểu hiện của gen gus 49 3.4 Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến hiệu quả chuyển gen nhờ

vi khuẩn A rhizogenes qua biểu hiện của gen gus 51 3.5 Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn A.rhizogenes ñến hiệu quả chuyển

gen qua biểu hiện của gen gus 52 3.6 Ảnh hưởng của tổ hợp các ñiều kiện tối ưu ñến hiệu quả chuyển gen

nhờ vi khuẩn A rhizogenes qua biểu hiện của gen gus 54 3.7 Ảnh hưởng của nguồn mẫu ñến khả năng tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn

3.8 Ảnh hưởng của nồng ñộ chất cảm ứng acetonsyringone (As) ñến khả

3.9 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm vi khuẩn A rhizogenes ñến khả

3.10 Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến khả năng tạo rễ tơ 62 3.11 Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn A rhizogenes ñến khả năng tạo rễ tơ 63 3.12 Ảnh hưởng của tổ hợp các ñiều kiện tới ñến khả năng tạo rễ tơ 65 3.13 Ảnh hưởng của nước dừa và casamino acid tới sinh trưởng của rễ tơ 69

DANH MỤC HÌNH

1.2 Một số ñặc ñiểm hình thái cây sâm Ngọc Linh 6 1.3 Vi khuẩn Agrobacterium sp, rễ tơ 16

1.5 Cơ chế chuyển T-DNA của Ti-plasmid sang genome thực vật 21

3.1 Kết quả thử vật liệu chuyển gen 46 3.2 Kết quả kiểm tra nồng ñộ AS 48 3.3 Kết quả kiểm tra thời gian lây nhiễm 50 3.4 Kết quả kiểm tra ảnh hưởng thời gian ñồng nuôi cấy 52 3.5 Kết quả kiểm tra OD600 53 3.6 Khả năng ra rễ trên các loại mô khác nhau 56 3.7 Mẫu rễ tơ ở nồng ñộ AS 100 µM 59 3.8 Kết quả kiểm tra thời gian lây nhiễm 61 3.9 Kết quả kiểm tra thời gian ñồng nuôi cấy 63 3.10 Kết quả kiểm tra nồng ñộ vi khuẩn 64 3.11 Các dạng hình thái rễ tơ 66 3.12 Kết quả phản ứng PCR kiểm tra các gen rolA và rolB 67 3.13 Kết quả phản ứng PCR kiểm tra các gen rolC 67 3.14 Ảnh hưởng của nước dừa 70 3.15 Ảnh hưởng của casamino acid 71

MỞ đẦU

1.1.Tắnh cấp thiết

Sâm Ngọc Linh có tên khoa học là Panax vietnamensis Ha et Grushv, thuộc

họ Nhân sâm (Araliaceae) Panax xuất phát từ chữ Panacea trong tiếng Hy Lạp,

có nghĩa là thuốc trị bách bệnh, thần dược

Tác dụng dược lý của sâm Ngọc Linh ựã ựược nhiều nhà khoa học ở Việt Nam cũng như trên thế giới nghiên cứu và chứng minh là cây thuốc quý dùng ựể chữa nhiều bệnh và tăng cường sức khỏe như tăng lực, tăng trắ nhớ, bảo vệ cơ thể chống stress, tác ựộng lên hệ miễn dịch, tăng sức ựề kháng cho cơ thể, giúp

chống viêm, ngăn cản sự lão hóa, v.v (Duc N.M et al., 1996)

Theo các nhà khoa học sâm Ngọc Linh có tác dụng kắch thắch hệ miễn dịch, chống ôxi hóa, lão hóa, phòng chống ung thư, bảo vệ tế bào gan, tăng thị lực, hoạt ựộng trắ tuệ và cải thiện thể lực, nâng cao huyết áp ở người bị huyết áp thấp, có tắnh kháng khuẩn, chống trầm cảm, giảm lo âu

Chắnh vì vậy mà sâm ựược xem là vị thuốc quý, ựứng ựầu các vị thuốc bổ theo thứ tự Sâm, Nhung, Quế, Phụ trong y học cổ truyền, ựã ựược sử dụng từ rất lâu ựời ở các nước trên thế giới cũng như ở Việt Nam (đỗ Tất Lợi, 2006) Những kết quả nghiên cứu mới nhất thân rễ và rễ củ sâm Ngọc Linh (2007) ựã thu nhận ựược tới 50 saponin trong ựó 26 sanopin thường thấy ở sâm Triều Tiên, sâm Mỹ, sâm Nhật và 24 saponin damaran có cấu trúc mới Trong lá và cọng ựã phân lập ựược 19 saponin, trong ựó có 8 saponin có cấu trúc mới đã xác ựịnh ựược trong sâm Ngọc Linh 17 axắt amin trong ựó có 8 axắt amin không thay thế, 17 axắt béo, 20 nguyên tố ựa lượng, vi lượng và hàm lượng tinh dầu là 0,1% Sâm Ngọc Linh chứa chủ yếu các saponin triterpen, là loại sâm có hàm lượng saponin và số

lượng saponin nhiều nhất so với các loài khác của chi Panax

Sâm Ngọc Linh chứa các hợp chất ựa dạng ựược xem là thần dược với sức khỏe con người khiến giá sâm Ngọc Linh trên thị trường rất cao, có những thời ựiểm 1 kg sâm Ngọc Linh tươi ở Quảng Nam có giá 25 - 30 triệu ựồng, lúc khan

hiếm có thể lên tới 80 - 90 triệu ñồng Vì lợi ích lớn nên việc khai thác, mua bán và

sử dụng tràn lan chưa có quy ñịnh quản lý, bảo vệ cùng các chính sách, giải pháp ñầu tư, quy hoạch phát triển khiến vùng sâm mọc tự nhiên giữa Quảng Nam và Kon Tum dần cạn kiệt Năm 2007 sâm Ngọc Linh ñược xếp nhóm nguy cấp (EN) trong sách ñỏ Việt Nam có nguy cơ tuyệt chủng, loài phân bố hẹp, ñang bị khai thác mạnh (Phạm Quốc Hùng và cs., 2010)

Do giá trị kinh tế và giá trị y dược cao, ngày nay nhiều nhà khoa học ñã và ñang tiến hành các công trình nghiên cứu về sâm Ngọc Linh Các nghiên cứu về thành phần hóa học của các hợp chất có giá trị làm thuốc, bảo tồn phát triển sâm Ngọc Linh Tuy nhiên thời gian nuôi trồng sâm Ngọc Linh kéo dài ñã xảy ra tình trạng sâm bị khai thác trộm trước thời gian thu hoạch

Nhiều chương trình di thực Sâm Ngọc Linh ñược tiến hành từ nhiều năm nay nhưng vẫn còn những hạn chế nhất ñịnh Do vậy, các chế phẩm từ sâm Ngọc Linh cũng ñược sản xuất rất ít, thậm chí ngưng sản xuất vì thiếu nguồn nguyên liệu Vấn ñề ñặt ra là cần triển khai, phát triển sinh khối tế bào thực vật, tạo nguồn nguyên liệu ổn ñịnh, ñáp ứng nhu cầu làm thuốc Nhân sinh khối tế bào thực vật ñã ñược ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: dược phẩm, sản phẩm chức năng, chất phụ gia thực phẩm, nông nghiệp, lâm nghiệp… vừa tạo ra nguyên liệu, vừa bảo tồn nguồn gen quý hiếm Nhiều hoạt chất nguồn gốc từ thực vật có giá trị kinh tế cao là sản phẩm từ sinh khối tế bào thực vật như caffein thu ñược từ nuôi cấy tế bào

Coffea arabica, betalain từ mô sẹo củ cải ñường, berberin từ cây Coptis japonica

Hiện nay trên thế giới ñã có một số nghiên cứu về nuôi cấy sinh khối các loài sâm ứng dụng trong các lĩnh vực y dược Một số nước tiêu thụ và xuất khẩu sâm lớn như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc ñã ứng dụng nuôi cấy sinh khối tế bào từ nhân sâm trong sản xuất các sản phẩm chức năng làm thuốc bổ, thuốc phòng chống bệnh tim mạch, chống gốc tự do, tăng cường chức năng hệ thần kinh trung ương, các loại mỹ phẩm

So với nuôi trồng tự nhiên, công nghệ sinh khối tế bào thực vật có nhiều ưu ñiểm như không chịu tác ñộng của các yếu tố tự nhiên như ñịa lý, khí hậu, thổ nhưỡng, bệnh dịch, thiên tai, yếu tố thời vụ… nên có thể chủ ñộng ñược nguồn

nguyên liệu phục vụ sản xất, thời gian sản xuất nguyên liệu theo công nghệ sinh khối tế bào rút ngắn hơn nhiều so với gieo trồng tự nhiên, chất lượng sản phẩm ổn ñịnh do các ñiều kiện nuôi cấy ñược kiểm soát chặt chẽ, có thể ñiều khiển quá trình sinh tổng hợp tạo ra các hoạt chất cao hơn so với nuôi trồng tự nhiên bằng cách bổ sung các chất kích thích tăng tích lũy các hoạt chất chính Có thể sản xuất các hợp chất thứ cấp theo yêu cầu với số lượng khác nhau

Thách thức lớn nhất ñối với công nghệ tế bào thực vật là sự ổn ñịnh, khả năng nuôi cấy tế bào thực vật trên quy mô lớn và ñạt hiệu suất tối ña cho sự tích lũy và sản xuất các chất thứ cấp ðiều này có thể thực hiện bằng cách chọn lọc các kiểu gen thích hợp và các dòng tế bào có sản lượng cao, xây dựng các công thức môi trường dinh dưỡng hợp lý ñể nuôi cấy tế bào, thiết kế và vận hành các hệ thống nuôi cấy tế bào (bioreactor) hiệu quả (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006)

Trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật nhằm làm giảm hoặc mất tính biệt hóa ở các mô tế bào nuôi cấy người ta cần thiết phải bổ sung các chất ñiều hòa sinh trưởng vào trong môi trường nuôi cấy, vấn ñề này là một trong những khó khăn khi ñưa sản phẩm ra ngoài thị trường do tồn dư của các chất ñiều hòa sinh trưởng trong sinh khối tế bào nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp ñến sản phẩm và sức khỏe người sử dụng

Có thể khắc phục nhược ñiểm trên bằng nuôi cấy sinh khối từ rễ tơ Rễ tơ ở

thực vật ñược gây ra bởi quá trình tương tác giữa vi khuẩn Agrobacterium

rhizogenes và tế bào vật chủ Rễ tơ có thể sinh trưởng tốt trên môi trường không bổ

sung các chất ñiều hòa sinh trưởng Rễ tơ có khả năng sinh trưởng nhanh, phân nhánh cao, kỹ thuật nuôi cấy không phức tạp, chuyển gen dễ dàng và có thể ñược nuôi cấy tạo sinh khối liên tục, ñiều này có ý nghĩa trong dây chuyền sản xuất các chất thứ cấp hay các dược phẩm sinh học

Nuôi cấy rễ tơ có khả năng rút ngắn thời gian nuôi cấy, rễ tơ là cơ quan biệt hóa nên ổn ñịnh về mặt di truyền và sinh hóa hơn nuôi cấy tế bào huyền phù và mô sẹo, nuôi cấy trên môi trường không có chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật tạo ra các nguyên liệu sạch cho công nghiệp dược, thực phẩm, mỹ phẩm

Yêu cầu ñối với công nghệ sinh khối tế bào thực vật là nuôi cấy ñạt hiệu suất tối ña cho sự tích lũy và sản xuất các hợp chất thứ cấp Do ñó cần chọn lọc các dòng rễ tơ sinh trưởng nhanh, môi trường dinh dưỡng hợp lý, tối ưu quy trình kỹ thuật nuôi cấy, thiết kế và vận hành các hệ thống nuôi cấy tế bào (bioreactor) hiệu quả Tế bào thực vật có sự trao ñổi chất chậm hơn vi sinh vật vì thế ñòi hỏi phải duy trì một ñiều kiện nuôi cấy vô trùng trong thời gian lâu hơn Các thông số hóa học, vật lý như thành phần môi trường, chất ñiều hòa sinh trưởng, nhiệt ñộ nuôi cấy, sự thông khí, lắc khuấy, ánh sáng, … ñều ảnh hưởng lớn tới hàm lượng và chất lượng các hợp chất thứ cấp

Xuất phát từ thực tế trên tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài “Nghiên cứu khảo

sát ñiều kiện chuyển gen tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn Agrobacterium

rhizogenes ở sâm Ngọc linh (Panax Vietnamensis Ha et Grushv)”

1.2 Mục ñích

Xác ñịnh khả năng chuyển gen vào sâm Ngọc Linh và ñiều kiện chuyển gen

thích hợp cho tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ở sâm Ngọc Linh (Panax Vietnamensis Ha et Grushv)

Bước ñầu xác ñịnh môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng của rễ tơ sâm Ngọc Linh

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cây sâm Ngọc Linh

1.1.1 Phân loài

Sâm Ngọc Linh (danh pháp hai phần: Panax Vietnamensis) là một loài cây thuộc họ Cam tùng (Araliaceae), còn gọi là sâm Việt Nam, sâm Khu Năm (sâm

K5), sâm trúc (sâm ñốt trúc, trúc tiết nhân sâm), sâm cung, sâm ñắng, sâm rừng,

củ ngải rọm con hay cây thuốc giấu

Phân loại khoa học của cây sâm Ngọc Linh như sau:

Họ: Araliaceae Phân họ: Aralioideae Chi: Panax

Phân chi: Panax Loài: P Vietnamensis Tên khoa học: Panax Vietnamensis Ha et Grushv

Hình 1.1 Cây sâm Ngọc Linh

1.1.2 Hình thái

Cây thảo, sống nhiều năm, cao 0,4 - 0,8 m Thân khí sinh cao khoảng 30 -

60 cm, mảnh mai, thẳng, nhẵn, ruột xốp Thân khí sinh tàn lụi hàng năm sau mùa sinh trưởng và ñể lại trên thân rễ một vết sẹo (là căn cứ ñể tính tuổi của cây) Mỗi cây thường có một thân khí sinh, có khi có 2 - 3 thân

Thân rễ (củ) nạc gồm nhiều ñốt, phân nhánh, nằm ngang, ñường kính 1,5 - 2,5

cm, phần ñầu có nhiều vết sẹo do thân khí sinh tàn lụi Sâm ngoài tự nhiên thân

rễ dài 5 - 25 cm hoặc hơn, màu vàng nhạt hoặc vàng nâu, thân rễ mang nhiều

rễ phụ nạc dễ ñứt Trên sâm trồng thường có 2 - 3 rễ củ hoặc hơn hình con quay, bám dọc theo thân Thân rễ có mùi thơm mát, vị ñắng ngọt dễ chịu Thân rễ sâm hoang dại có thể nặng tới 700g và mang ñến 70 vết sẹo (Nguyễn Như Chính, 2003)

Lá kép chân vịt, mỗi cây thường có 3 - 6 lá kép, mỗi lá kép có từ 5 - 7 lá chét, lá mọc vòng, lá chét thuôn, dài 10 - 14 cm, rộng 3 - 5 cm, gốc nhọn, ñầu vuốt nhọn, mép khía răng cưa, cuống lá chét ngắn dưới 1 cm, có lông ở cả hai mặt, gân phụ 10 cặp hình lông chim, gân nhỏ hình mạng

Cụm hoa tán, mọc ở ngọn, thường tán ñơn, cá biệt có tán phụ, cuống cụm hoa dài 15 - 30 cm Hoa nhỏ, màu trắng ngà, cuống hoa 1 - 1,5 cm, ñài 5, hợp ở gốc, hình tam giác, 5 cánh hoa hình tam giác rộng, nhị 5, chỉ nhị mảnh, bầu 2 ô, cá biệt 1

ô, ñầu nhụy chẻ ñôi Mùa hoa thường từ tháng tư ñến tháng bảy, cây trồng từ hạt thường sau 3 năm ra hoa

Quả mọng, hình cầu hoặc hình cầu hơi dẹt, ñường kính 0,6 - 1 cm, khi non màu xanh nhạt, lớn dần có màu xanh ñậm, khi chín màu ñỏ, có chấm ñen Hạt hình thận gần tròn, ñường kính 2 - 3 mm, dài 3 - 4 mm, màu trắng xám Số quả trên cây dao ñộng từ 5 - 40 quả, bình quân 6 - 7 quả trên cây Mùa quả vào khoảng tháng chín ñến tháng mười (Nguyễn Tập, 2006)

Hình 1.2 Một số ñặc ñiểm hình thái cây sâm Ngọc Linh

1.1.3 đặc ựiểm sinh thái

Cây ựặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, thường mọc rải rác hoặc thành ựám nhỏ dưới tán rừng kắn thường xanh ở ựộ cao từ 1,200 - 2,300 m Nhiệt ựộ trung bình từ

15 - 18oC, ựộ ẩm 90%, lượng mưa hàng nă m khoảng 3000 mm, ựất nhiều mùn, giàu chất dinh dưỡng

1.1.4 Sinh trưởng

Hạt nảy mầm vào giữa tháng 12 ựến tháng 2 năm sau Cây ra hoa kết quả vào tháng 4 - 6 Từ tháng 7 - 9 là thời kỳ quả chắn có thể kéo dài ựến tháng 10 Sau ựó là giai ựoạn thân khắ sinh tàn lụi, gọi là thời kỳ ngủ ựông vào tháng 11, ựến tháng 3 năm sau mọc lên thân mới lớn dần lên thành cây sâm trưởng thành có 1 tán hoa

Cá biệt có một số thân khắ sinh tồn tại sang năm sau Tái sinh tự nhiên từ hạt hoặc

từ phần ựầu mầm thân rễ Căn cứ vào vết sẹo trên ựầu củ, người ta có thể nhận biết

ựộ tuổi của cây sâm Sau 3 năm ựầu, cây sâm mới rụng lá và ựể lại vết sẹo ựầu tiên

Củ từ 3 tuổi trở lên bắt ựầu ựược thu hoạch, tốt nhất là trên 5 tuổi Mùa ựông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân rễ của sâm (Nguyễn Như Chắnh, 2003)

1.1.5 Phân bố

Sâm Ngọc Linh là loài ựặc hữu của Việt Nam, phân bố ở vùng núi Ngọc Linh thuộc 2 tỉnh Kon Tum và Quảng Nam, ngoài ra còn có ở núi Langbiang Ờ Lâm đồng, nhưng hiện nay không còn Việt Nam là nơi phân bố duy nhất của sâm Ngọc Linh trên toàn thế giới

Năm 1968 Vũ Minh đức ựã phát hiện sâm này ở Bắc Bền (Trà Linh) và ựặt tên là Sâm khu 5 Năm 1973 dược sỹ đào Kim Long, dược sỹ Trần Thanh Dân, dược sỹ Nguyễn Châu Giang, kỹ sư Nguyễn Bá Hoạt tìm thấy ở đăk Tô, Kon tum

và ựặt tên là sâm ựốt trúc với tên khoa học là Panax Articulatus (Nguyễn Như

Chắnh, 2003)

1.1.6 Giá trị dược liệu

Theo ựánh giá của Nguyễn Minh đức, thì từ sâm Ngọc Linh ựã chiết ựược 50 hợp chất, xác ựịnh cấu trúc hóa học cho thấy 26 hợp chất có cấu trúc ựã biết (thường thấy ở sâm Triều Tiên, sâm Mỹ, sâm Nhật) và 24 saponin damaran có cấu trúc mới không bắt gặp tại các loại sâm khác trên thế giới ựược ựặt tên là vina-ginsenosid-R1-R24 Sâm Ngọc Linh chứa chủ yếu các saponin triterpen, nhưng

cũng là một trong những cây sâm có hàm lượng saponin khung pammaran cao nhất (khoảng 12 - 15%) và số lượng saponin nhiều nhất so với các loài khác của chi Trong lá và cọng ñã phân lập ñược 19 saponin damaran, ñã ñược phân lập, gồm 11 saponin ñã biết và 8 saponin có cấu trúc mới ñặt tên là vinaginsenosid-L1-L8

(Nguyen MD et al., 1993, 1994)

Sâm Ngọc Linh chứa chủ yếu saponin thuộc nhóm damaran và có rất ít saponin nhóm olean Thành phần saponin của sâm Ngọc Linh rất giống với thành phần của các loài sâm trồng khác (Bảng 1.1) Nó chứa hầu như ñầy ñủ các saponin chủ yếu có trong các loài sâm trồng như ginsenosid-Rb1, -Rd, - Re, -Rg1, và notoginsenosid-R1, nhưng hàm lượng saponin toàn phần của sâm Ngọc Linh lại cao hơn, ngoài ra sâm Ngọc Linh chứa một hàm lượng saponin có cấu trúc mạch nhánh ocotillol rất cao, nhất là chất majonosid-R2 (khoảng 5% và chiếm nửa lượng saponin toàn phần) Thành phần ñặc biệt này ñã giúp sâm Ngọc Linh trở thành một

loài Panax ñộc ñáo không những về mặt hoá phân loại mà còn về mặt dược lý (Nguyen MD et al., 1993, 1994)

Bảng 1.1 Hàm lượng saponin (%) của sâm Việt Nam và các loài Panax trồng

tỷ lệ lớn nhất là acid linoleic (40%), acid palmitic (29,6%), acid oleic (13,3%), acid stearic (4,5%) và acid linolenic (2,6%) 18 axít amin trong ñó có 8 axít amin không thay thế, một số acid amin có tỷ lệ rất cao như arginine 46,6%, lysine 17,9% và tryptophan 10,2% ñã ñược xác ñịnh có tính chống lão hoá tế bào và 18 nguyên tố ña lượng, vi lượng trong ñó bao gồm một số các nguyên tố có tác dụng sinh học như

K, Na, Mg, Mn, Cu, Fe, Co, Zn, Se và hàm lượng tinh dầu là 0,1% (Nguyen MD et

al., 1993, 1994)

Theo Nguyễn Bá Hoạt những kết quả nghiên cứu dược lý thực nghiệm sâm Ngọc Linh có tác dụng chống stress vật lý, stress tâm lý và trầm cảm, kắch thắch

hệ miễn dịch, chống ôxi hóa, lão hóa, phòng chống ung thư, bảo vệ tế bào gan Nghiên cứu dược lý lâm sàng của sâm Ngọc Linh cũng cho kết quả tốt: bệnh nhân ăn ngon, ngủ tốt, lên cân, tăng thị lực, hoạt ựộng trắ tuệ và thể lực cải thiện, gia tăng sức

ựề kháng, cải thiện các trường hợp suy nhược thần kinh và suy nhược sinh dục, nâng cao huyết áp ở người bị huyết áp thấp Ngoài ra, nó còn có tác ựộng kháng khuẩn

ựáng kể ựối với các loài Streptococci và có tác dụng tốt với chứng viêm họng

Ngoài những tác dụng như trên, theo dược sĩ đào Kim Long, sâm Ngọc Linh

có những tắnh năng như tăng lực, phục hồi sự suy giảm chức năng giúp cho tình trạng của cơ thể trở lại bình thường, kháng các ựộc tố gây hại tế bào, giúp kéo dài

sự sống của tế bào và tăng các tế bào mới đặc biệt, sâm Ngọc Linh có những tắnh năng mà sâm Triều Tiên và sâm Trung Quốc không có là tắnh kháng khuẩn, chống trầm cảm, giảm lo âu, chống ôxi hóa, và hiệp lực tốt với thuốc kháng sinh, thuốc trị bệnh tiểu ựường

Theo nghiên cứu của Trần Mỹ Tiên và Nguyễn Thị Thu Hương (2005) thì không chỉ thân rễ và rễ củ sâm Ngọc Linh mới cho tác dụng tốt mà cả phần lá cũng

có tác dụng ựối với hệ thần kinh trung ương, có tác dụng chống stress, tăng lực, chống oxy hóa, phụ hồi sức khỏe Khi thử nghiệm trên thần kinh trung ương ở liều thấp 60 mg/kg và 120 mg/kg cao lá sâm Ngọc Linh có tác ựộng rút ngắn thời gian ngủ của pentobarbital và ở liều cao là 1800 mg/kg có tác dụng ức chế thần kinh trung ương, kéo dài thời gian ngủ của pentobarbital Cao lá sâm Ngọc Linh ở liều

600 - 1200 mg/kg ựều thể hiện tác dụng phục hồi thời gian ngủ bị rút ngắn bởi stress, ựưa trở về trạng thái bình thường Saponin toàn phần lá sâm Ngọc Linh có tác ựộng chống stress thể hiện rõ ở liều 2000 mg/kg Hợp chất notoginsenoside-Fc, một saponin có hàm lượng cao trong lá sâm Ngọc Linh, là hợp chất quyết ựịnh tác dụng chống trầm cảm của cao lá sâm Ngọc Linh Cao lá sâm Ngọc Linh có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành MDA Ở thử nghiệm dùng cao lá sâm Ngọc Linh cho thấy có tác dụng phục hồi sinh lực, giữ nguyên thời gian vận ựộng của ựộng vật thắ nghiệm

1.1.7 Tình hình nghiên cứu về cây sâm Ngọc Linh

Cây sâm Ngọc Linh ñược biết ñến khá muộn so với các loài sâm khác trên thế giới, ngay khi loài sâm này ñược các nhà khoa học phát hiện thì việc nghiên cứu về thành phần hóa học và giá trị dược liệu của sâm Ngọc Linh ñã ñược tiến hành Năm 1974, Nguyễn Thới Nhâm tiến hành nghiên cứu bước ñầu về thành phần hóa học sâm Ngọc Linh, khi so sánh với sâm Hàn Quốc và tam thất Trung Quốc qua sắc ký ñồ cho thấy sâm Ngọc Linh có thành phần hóa học rất giống sâm Hàn Quốc Năm 1978, bộ y tế thành lập ñơn vị nghiên cứu chuyên ñề sâm K5 ñể ñiều tra nguồn gốc sinh thái, trữ lượng và khoanh vùng bảo vệ ðến năm 1980 ñã tìm thấy ñược 108 vùng sâm mọc tập trung với trữ lượng lớn và ñộ tuổi rất cao (10 - 70 tuổi chiếm 70%) Năm 1985, Hà Thị Dụng ñã mang tiêu bản sâm Ngọc Linh sang Liên Xô ñể phân loại và chính thức công bố trên toàn thế giới sâm Ngọc Linh là một loài mới

và ñặc hữu với tên khoa học Panax vietnamensis Ha et Grushv

Khi nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy sâm Ngọc Linh là loài dược liệu quý, nó chứa ñầy ñủ các saponin chủ yếu có trong các loài sâm trồng như ginsenosid-Rb1, -Rd, - Re, -Rg1, và notoginsenosid-R1, nhưng hàm lượng saponin toàn phần của lại cao hơn, ngoài ra sâm Ngọc Linh chứa một hàm lượng saponin có

cấu trúc mạch nhánh ocotillol rất cao, nhất là chất majonosid-R2 (Nguyen MD et al

1993, 1994)

Hiện nay có nhiều nghiên cứu về cây sâm Ngọc Linh, nghiên cứu về ứng dụng công nghệ sinh học trong nhân sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh, nghiên cứu môi trường nuôi cấy tế bào, hệ thống nuôi cấy, hệ thống chiếu sáng ñến cây sâm Ngọc

Linh, Trong nghiên cứu của Nhut et al (2009) về xác ñịnh một số yếu tố ảnh

hưởng ñến sinh khối của cây sâm Ngọc Linh thì mô sẹo ñược cảm ứng thành công trên môi trường MS bổ sung 1mg/l 2,4-D và 0,2 mg/l TDZ trong ñiều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày và mô sẹo có khả năng tăng sinh nhanh trên môi trường MS có bổ sung 1mg/l 2,4-D và 0,2 mg/l TDZ Số chồi tái sinh từ mô sẹo ñạt cao nhất trên môi trường MS bổ sung 1mg/l BA, 1mg/l NAA và 50 g/l sucrose Môi trường 1/2 MS có

bổ sung 5 mg/l NAA kích thích sự phân rễ tốt nhất, cho tỷ lệ ra rễ cao nhất và rễ

phân nhánh nhiều nhất Kết quả phân tích ñịnh tính saponin bằng phương pháp TLC cho thấy trong sinh khối mô sẹo, sinh khối chồi và sinh khối rễ ñều có ginsenoside-Rg1 và majonoside-R2, riêng sinh khối rễ còn có ginsenoside-Rb1

Khi xác ñịnh hàm lượng saponin và dư lượng chất ñiều hòa sinh trưởng trong callus, chồi và rễ sâm Ngọc Linh qua kết quả ñịnh tính bằng sắc ký lớp mỏng và ñịnh lượng bằng HPLC, dựa trên sự ñối chiếu 3 chất chuẩn có ñược và so sánh với sâm Ngọc Linh tự nhiên cho thấy ñều có sự hiện diện của ginsenoside và majonoside R2 với tỷ lệ và hàm lượng khác nhau Ở mô sẹo hàm lượng MR2, G-

Rb1và GRg1 thấp nhất, tiếp ñến là mô sẹo biệt hóa rễ, mô sẹo biệt hóa chồi có hàm lượng 3 chất trên cao nhất Cũng sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng và HPLC

ñã xác ñịnh ñược dư lượng NAA và BA trong sinh khối sâm Ngọc Linh nuôi cấy in

vitro kết quả không thấy xuất hiện vạch của NAA và BA trong các mẫu phân tích

(Dương Tấn Nhựt và cs., 2010)

Theo nghiên cứu của tác giả Hoàng Xuân Chiến và cs (2011) khi tạo củ sâm

Ngọc Linh in vitro và xác ñịnh hàm lượng saponin trong cây tạo từ củ trồng thử nghiệm ở núi Ngọc Linh thì môi trường thích hợp nhất ñể tạo củ sâm Ngọc Linh in

vitro là SH có bổ sung 1 mg/l NAA, 2 mg/l BA trong ñiều kiện chiếu sáng 16

giờ/ngày, nồng ñộ ABA thích hợp cho quá trình tạo củ là 3 mg/l, nồng ñộ sucrose tốt nhất cho quá trình tạo củ là 50 g/l, qua hệ thống HPLC cho thấy trong sâm Ngọc Linh nuôi cấy mô trồng thử nghiệm 17 tháng tại núi Ngọc Linh có chứa 3 loại saponin quan trọng của sâm Ngọc Linh là MR2(0,77%), G-Rg1(0,17%), G-

Rb1(0,21%)

Khi khảo sát một số yếu tố ña lượng trong môi trường nuôi cấy tế bào cây sâm Ngọc Linh Khi bổ sung NH4NO3 với nồng ñộ 0,5 mg/l thu ñược sinh khối cao nhất, nồng ñộ KNO3 tối ưu cho sự sinh trưởng của tế bào là 1,0 mg/l, còn sản phẩm ginsenoside thu ñược lớn nhất (6,1 mg/g DW) ở nồng ñộ 2,0 mg/l Sinh khối tế bào và thành phần ginsenoside tăng trưởng ñáng kể khi bổ sung CaCl2 vào

môi trường ở nồng ñộ 1,5mg/l (Thanh et al., 2011)

Nghiên cứu tạo rễ bất ñịnh của sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro mẫu cấy

trên môi trường MS có bổ sung 50 g/l sucrose, 8 g agar, 1 mg/l 2,4D cho kết quả hình thành mô sẹo và rễ bất ñịnh tốt nhất sau 2 tháng nuôi cấy ðoạn rễ bất ñịnh trên môi trường Gamborg bổ sung 50 g/l sucrose, 8 g agar, 5 mg/l IBA cho kết quả hình thành rễ và tăng sinh khối khả quan.Từ kết quả này mở ra hướng ñi mới ñể tạo sinh khối rễ sâm Ngọc Linh trong thời gian ngắn, số lượng nhiều, chủ ñộng nguồn nguyên liệu (Nguyễn Thị Liễu và cs., 2011)

Nghiên cứu về ảnh hưởng của ánh sáng ñơn sắc lên sinh trưởng và khả năng

tích lũy saponin của cây sâm Ngọc Linh in vitro của tác giả Hoàng Văn Cương và

cs (2012) cho thấy kết hợp ánh sáng xanh và ñỏ với tỷ lệ 50:50 thích hợp cho sinh

trưởng và phát triển của cây sâm Ngọc Linh in vitro Các cây nuôi dưới ánh sáng

huỳnh quang cho sự tích lũy saponin cao nhất

Dương Tấn Nhựt và cs (2012) ñã bước ñầu ñánh giá ảnh hưởng của methyl jasmonate acid lên khả năng tích lũy saponin trong mô sẹo sâm Ngọc Linh và khảo sát một số hệ thống nuôi cấy trong nuôi cấy rễ bất ñịnh và rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh có nguồn gốc từ mô sẹo lên khả năng tạo saponin Kết quả cho thấy rễ bất ñịnh hình thành tốt nhất trong hệ thống bioreactor Hàn Quốc chứa 2 lít môi trường

SH có bổ sung 3 mg/l NAA, 30 g/l sucrose, trong ñó rễ hình thành chứa ñược cả 3 loại saponin quan trọng MR2, G-Rb1, G-Rg1

Trần Quang Trung và cs (2013) ñã xác ñịnh hàm lượng của 3 ginsenoside

Rb1, Re, Rg1 trong sâm Ngọc Linh tự nhiên lần lượt là 1,0916%, 0,1226%, 1,4215%, trong sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh lần lượt là 0,3281%, 0,0817% và 0,3646%

Gần ñây nhất là nghiên cứu của tác giả Vũ Thị Hiền và cs (2014) ñã tạo ñược phôi trực tiếp từ lá, cuống lá, thân rễ cây sâm Ngọc Linh trên môi trường MS bổ sung 2mg/l NAA cho hiệu quả phát sinh phôi cao nhất

Cho ñến nay ñã có nhiều nghiên cứu về cây sâm Ngọc Linh, nghiên cứu về tác dụng dược lý của sâm Ngọc Linh, thành phần môi trường, thành phần hóa học trong

sâm nuôi cấy in vitro tuy nhiên các nghiên cứu về chuyển gen tạo rễ tơ ở sâm Ngọc

Linh ñể thu hợp chất thứ cấp vẫn còn hạn chế

1.2 Tình hình nghiên cứu về cây chuyển gen

1.2.1 Khái niệm cây chuyển gen

Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật ñưa một hay nhiều gen lạ ñã ñược thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nói chung (vi sinh vật, ñộng vật, ) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmit tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ Trong tế bào chủ, các gen này hoạt ñộng tổng hợp nên các protein ñặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các ñặc tính mới của vật chủ tiếp nhận gen (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005)

1.2.2 Lịch sử chuyển gen vào thực vật

Năm 1980 vi khuẩn ñất Agrobacterium tumefaciens ñược sử dụng làm

phương tiện vận chuyển DNA Ở ñiều kiện bình thường vi khuẩn này gây bệnh ở thực vật, tạo nên khối u Một phần nhỏ của Ti-plasmid có trong vi khuẩn này, ñược

gọi là T-DNA, ñược vận chuyển từ Agrobacterium vào cây hai lá mầm Năm 1980,

lần ñầu tiên thành công trong việc chuyển ñoạn DNA ngoại lai ñã ñược xác ñịnh

(transposon Tn7) vào thực vật nhờ A Tumefaciens, ñoạn Tn7 trở thành một phần

của DNA trong tế bào tạo nên khối u, tuy nhiên T-DNA vẫn chứa các ñoạn gen

gây ñộc với tế bào thực vật (Hernalsteens et al., 1980)

Năm 1981, xác ñịnh ñược tác nhân gây ra bệnh rễ tơ ở thực vật, do plasmid của

vi khuẩn chuyển vào trong DNA của tế bào thực vật (Chilton and Tepfer, 1982)

Năm 1983, nhiều nghiên cứu cải tiến T-DNA và ñưa DNA ngoại lai vào tế bào thực vật Ngoài ra, các gen tạo khối u ñược cắt ra DNA ngoại lai cùng với phần còn lại ñược chuyển vào thực vật Thành công này nhờ nghiên cứu chính

xác con ñường lây nhiễm của A tumefaciens trước ñó và khả năng của hệ thống

chọn lọc ñối với thực vật Hoekema ñã tiến hành cải tiến plasmid ở vi khuẩn,

Ti-plasmid này chứa vùng T-DNA và vùng vir Plasmid này có thể chuyển ñược vào trong tế bào vi khuẩn A Tumefaciens và cho phép chuyển ñoạn T-DNA vào thực vật (Hoekema et al., 1983)

Cây chuyển gen ñầu tiên thu ñược vào năm 1983, ñiều này cho thấy rằng mới chỉ hơn hai thập niên các công cụ của công nghệ DNA tái tổ hợp và sinh học tế bào

ñã giúp ích rất nhiều cho các nhà chọn giống thực vật (Trần Quốc Dung, 2006)

Năm 1984, thành công trong chuyển gen vào tế bào cây một lá mầm, mở ra một tiềm năng mới trong chuyển gen vào tế bào thực vật một lá mầm nhờ

Agrobacterium ( Hooykaas et al., 1984)

Kể từ năm 1984, bắt ñầu tạo ñược cây trồng chuyển gen và ñến nay ñã có những bước tiến lớn Nhiều cây trồng quan trọng chuyển gen ra ñời như lúa, ngô, lúa mì, ñậu tương, bông, khoai tây, cà chua, cải dầu, ñậu Hà Lan, bắp cải Các gen ñược chuyển là gen kháng vi sinh vật, virus gây bệnh, kháng côn trùng phá hại, gen cải tiến protein hạt, gen có khả năng sản xuất những loại protein mới, gen chịu hạn, gen bất thụ ñực, gen kháng thuốc diệt cỏ (Trần Quốc Dung, 2006) Năm 1985, Nicola ñã phát hiện ra yếu tố trung gian trong việc truyền DNA từ

A tumefaciens vào trong tế bào thực vật là các plasmid dạng vòng, ñoạn DNA

ñược chuyển vào trong tế bào thực vật là ñoạn T-DNA có kích thước 25kb (Nicola

et al., 1985) Cùng năm này Stachel ñã phát hiện ra sự có mặt của acetosyringone

(AS) và alpha-hydrocyacetosyringone (OH-AS) tại vùng tổn thương của tế bào

thực vật giúp các vi khuẩn Agrobacterium nhận biết ñược các tế bào thực vật trong

tự nhiên (Stachel et al., 1985)

Từ ñó ñến nay các nhà khoa học ñã ñạt ñược nhiều thành tựu trong lĩnh vực chuyển gen tạo ra thực vật kháng virus, cây có gen kháng thuốc diệt cỏ, kháng côn

trùng Một số cây trồng chuyển gen thành công nhờ vi khuẩn Agrobacterium như cà chua có chứa gen Bt chống ñược nhiều loài côn trùng cánh vảy Lepidoptera, cà chua chứa gen CP-TMV kháng virus, bông chuyển gen Bt chống sâu ñục quả, thuốc lá

chống sâu, côn trùng cánh vảy, kháng nấm khô vằn, chống mặn, chống lạnh

Từ năm 1996 ñến năm 2007 diện tích ñất canh tác cây chuyển gen lên tới 114,3 triệu héc-ta Năm 2007, ñã có 23 quốc gia canh tác cây trồng chuyển gen, bao gồm 12 nước ñang phát triển và 11 nước công nghiệp Các loại cây ñược trồng nhiều như bông Bt, ngô, ñậu tương, cà chua, cải canola (James Clive, 2007)

Năm 2008, số nước trồng cây chuyển gen ñã lên tới 25 nước, tổng diện tích ñất trồng cây chuyển gen trên toàn thế giới từ trước tới nay ñã ñạt mức 2 tỉ mẫu Ngô, ñậu tương, bông, cải canola, ñu ñủ kháng virus, hoa cẩm chướng, cây dương, cỏ alfalfa và bí là những cây trồng chuyển gen ñược trồng nhiều (James Clive, 2008)

Năm 2013 diện tích trồng cây chuyển gen tăng lên tới 175 triệu ha ñưa cây trồng công nghệ sinh học trở thành công nghệ cây trồng ñược ứng dụng nhanh nhất trong thời gian gần ñây Trong số 27 nước trồng cây trồng công nghệ sinh học vào năm 2013, có 19 nước ñang phát triển và 8 nước công nghiệp Giống ngô chịu hạn ñược ñưa vào sản xuất (James Clive, 2013)

1.2.3 Các phương pháp chuyển gen

Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng có thể phân loại thành hai nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyển gen gián tiếp và chuyển gen trực tiếp

* Phương pháp chuyển gen trực tiếp

- Phương pháp chuyển gen nhờ kỹ thuật xung ñiện

- Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm

- Phương pháp chuyển gen trực tiếp qua ống phấn

- Chuyển gen nhờ súng bắn gen

- Chuyển gen nhờ silicon carbide

* Phương pháp chuyển gen gián tiếp

- Chuyển gen nhờ virus

- Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium

1.3 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium ñược nghiên cứu từ những năm

1960 - 1970 Việc phát hiện ra Agobacterium tumefaciens (A.tumefaciens) có khả

năng chuyển gen vào thực vật vào ñầu những năm 1980 ñã biến loài này trở thành một trong những công cụ quan trọng nhất của công nghệ sinh học thực vật với những ưu ñiểm nổi trội: số bản sao của gen biến nạp ñược chuyển vào tế bào thực vật thấp (khoảng 1 - 2 bản sao, trong khi sử dụng súng bắn gen là nhiều hơn), do vậy giảm tối thiểu sự không biểu hiện của gen ñược chuyển, tăng khả năng chuyển gen bền vững, hiệu quả chuyển gen cao, tránh ñược sự hình thành của các cây chuyển gen khảm, kỹ thuật ñơn giản, dễ thực hiện, không ñòi hỏi thiết bị ñắt tiền (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005)

Phương pháp chuyển gen này ñã ñược áp dụng thành công trên nhiều ñối tượng cây trồng ñặc biệt là trên cây hai lá mầm (khoai tây, cà chua, thuốc lá, ñu ñủ, ) Sự chuyển gen vào cây một lá mầm khó thành công Gần ñây ñã chuyển gen nhờ

Agrobacterium ở một số cây hòa thảo: lúa, ngô thành công Trong trường hợp này

người ta thường dùng tế bào phôi ở dạng huyền phù làm ñối tượng chuyển nạp, môi trường nuôi cấy có bổ sung acetosyringone (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005)

1.3.1 Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

Agrobacterium là các loài vi khuẩn ñất, thuộc nhóm Gram (-), yếm khí, xâm

nhập qua vết thương, các loài vi khuẩn nay gây bệnh u rễ hay bệnh rễ tơ

Agrobacterium thuộc: Giới Bacteria

Có 4 loài chính Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes,

Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rubi Trong ñó hai loài Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes ñược nghiên cứu nhiều nhất

Hình 1.3 Vi khuẩn Agrobacterium sp, rễ tơ do vi khuẩn Agrobacterium

nhiễm (Chilton and Tepfer, 1982) Nhìn chung cơ chế quá trình xâm nhiễm và cơ chế phân tử của quá trình vận chuyển T-DNA vào tế bào vật chủ của hai vi khuẩn này ñược chứng minh là tương tự nhau (Sevon and Oksman, 2002)

Khi cây nhiễm A tumefaciens, do T-DNA nạp vào trong hệ gen của cây chủ

bắt ñầu hoạt ñộng và sản sinh ra auxin, cytokinin và opine, toàn bộ sinh trưởng của cây bị rối loạn, các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các khối u Opine là sản phẩm ngưng kết giữa một acid và keto acid amin hoặc với ñường, ñược vi khuẩn

sử dụng như một loại “thức ăn” nhờ gen chuyển hóa opine trên Ti-plasmid Cơ

chế lây nhiễm của A rhizogenes ñối với cây hai lá mầm cũng tương tự, nhưng trong vùng T-DNA của A rhizogenes chỉ có gen sản sinh ra auxin, vì thế sự thay

ñổi hình thái chính của thực vật là chúng tạo ra rất nhiều rễ tơ (hairy roots) khi bị nhiễm bệnh (Cardarelli and Spanò, 1987; Sevon and Oksman, 2002)

Hình 1.4 Cấu trúc Ri- plasmid

Cấu trúc của Ri-plasmid và Ti-plasmid là phân tử DNA mạch vòng, sợi kép

có trọng lượng phân tử lớn từ 200 - 800 kb gồm 4 vùng cơ bản: vùng khởi ñầu sao

chép (ORI), vùng mang cấu trúc gen ñộc (vir), vùng T-DNA và vùng gen phân giải opine Vùng T-DNA và vùng gen ñộc vir ñóng vai trò quan trọng trong việc chuyển

gen vào tế bào thực vật

Vùng vir chứa nhiều ñoạn gen khác nhau mã hóa cho các enzym E, D, C, G,

B, A Các enzym này có hai chức năng chính là cắt ñứt vùng bờ trái và bờ phải ñể giải phóng ñoạn T-DNA, chức năng thứ hai là bao bọc và vận chuyển T-DNA vào

tế bào thực vật và tiếp cận với bộ gen của thực vật một cách an toàn, tại ñây nó chuyển một ñoạn T-DNA (transfer DNA) từ Ri-plasmid vào hệ gen của tế bào vật

chủ (Bernard et al., 2010)

T-DNA ở Ri-plasmid của nhóm agropine bao gồm 2 vùng chính là vùng bên trái TL-DNA và bên phải TR-DNA Hầu hết các gen ñược ñịnh vị bên trong T-DNA chỉ ñược hoạt hóa sau khi chèn vào bộ gen thực vật Hai vùng này ñều có kích thước khoảng 15-20 kb và ñược xen kẽ bởi một ñoạn DNA, ñoạn DNA này sẽ không ñược chuyển vào hệ gen của tế bào vật chủ

Vùng TR-DNA mang các gen mã hóa sinh tổng hợp auxin (tms1 và tms2), vùng TL-DNA bao gồm 18 khung ñọc mở (ORFs), trong ñó có locus 10, 11, 12 và

15 mã hóa cho rolA, B, C và D (root locus) Các Ri-plasmid của các chủng

A.rhizogenes thuộc nhóm mannopine, cucumopine và mikimopine chứa vùng

T-DNA ñơn, có cấu trúc giống như vùng TL-DNA của các chủng thuộc nhóm

agropine nhưng khuyết gen rolD (Christey MC, 2001; Britton et al., 2008)

Một số nghiên cứu cho thấy nếu chèn vào một ñoạn gen lạ hay xóa bỏ các gen ở phần TL-DNA có thể làm mất kiểu hình biểu hiện rễ tơ ở cây Kalanchoe

diagremontiana Nếu chỉ có một vùng TR-DNA biểu hiện thì có thể hình thành rễ nhưng sẽ không mạnh bằng ñồng thời cả TL-DNA và TR-DNA kết hợp với nhau (White et al., 1985) ðiều này cho thấy TL-DNA có vai trò quan trọng trong biểu hiện hình thái rễ ở tế bào thực vật

Các gen rolA, rolB và rolC ñóng vai trò quan trọng trong quá trình cảm ứng

tạo rễ tơ ở mô tế bào thực vật ñược xác ñịnh là nằm trên vùng TL-DNA Sự biểu hiện ñồng thời của ba gen này gây nên kiểu hình rễ tơ ở mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm Các rễ tơ này có khả năng sinh trưởng và phát triển nhanh hơn rất nhiều so

với rễ bình thường (Britton et al., 2008) Một số nghiên cứu ñã tách dòng gen rolA

và biểu hiện trong cây thuốc lá và ghi nhận ñược sự thay ñổi kiểu hình rõ rệt Khi

biểu hiện gen rolA bằng chính promotor nguyên gốc thì cây thuốc lá trở nên còi

cọc, lá xanh ñậm nhăn nheo, hoa dị dạng, giảm chiều cao và chiều dài lóng thân

Việc biểu hiện gen rolA trong cây thuốc lá là nguyên nhân của trạng thái suy giảm

một vài hợp chất ñiều hòa sinh trưởng, trong ñó có nhóm auxin, cytokin, gibberellin

và axit abscisic Sự suy giảm các hooc môn trên phụ thuộc vào từng giai ñoạn phát triển và loại mô (Tomy and Angelo, 1995)

Trong 3 gen rol trên, gen rolB ñóng vai trò quan trọng nhất, gen rolB ñược

tìm thấy hầu hết trong các Ri plasmid và gần 60% gen ñã ñược nhận dạng giữa

các chủng A.rhizogenes khác nhau Khi gen rolB ñược biểu hiện, mô tế bào thực vật ñã cảm ứng tạo kiểu hình rễ tơ, trong khi ñó khi bất hoạt gen rolB không tạo ñược kiểu hình rễ tơ Trong một số loài thực vật chỉ mình gen rolB biểu hiện cũng tạo ra rễ tơ (Britton et al., 2008)

Kết quả cho thấy khi biểu hiện gen rolB bằng chính promotor gốc trong cây

thuốc lá, sự hình thành cây thuốc lá sẽ thay ñổi bao gồm: sự thay ñổi hình thái lá

và hoa và ñặc biệt gia tăng sự hình thành rễ bất ñịnh ở thân cây Bên cạnh ñó,

nhiều nghiên cứu có sự liên quan chặt chẽ giữa gen rolB và auxin Ở cây cà rốt, nếu chỉ có một mình gen rolB thì không thể hiện kiểu hình rễ tơ, auxin là cần thiết

cho việc tạo rễ tơ và có thể ñược cung cấp bởi gen aux-TR-DNA mã hóa cho các enzyme sinh tổng hợp auxin IAA nằm trên vùng TR-DNA (Britton et al., 2008) Các gen rolC và rolD vẫn ñang ñược nghiên cứu về chức năng trong quá trình tạo rễ tơ Thực vật mang gen rolC cùng với promotor gốc sẽ bị ngắn, giảm ưu thế

ngọn, tạo lá hình mũi mác, ra hoa sớm và nhỏ, số lượng nhị hoa ít Cây thấp lùn do kích thước của tế bào biểu bì trong lóng giảm, số lượng rễ ở những cây ñược

chuyển gen rolC có tăng so với nhưng cấy ñối chứng không chuyển gen nhưng lại giảm so với những cây có mặt ñầy ñủ các gen rolA, rolB, rolC, rolD Khi chuyển gen rolC vào cây thì cây con có khả năng chịu ñựng cao hơn với các hooc môn sinh

trưởng như auxin, giberelin và acid abscisic, nhưng tăng nhạy cảm với cytokinin

Chuyển gen rolC vào cây làm thay ñổi nồng ñộ gibberellin vì giảm GA1 và sự gia

tăng nồng ñộ GA19 và làm cây bất dục ñực, khi khắc phục bằng GA3 thì khôi phục ñược chiều dài lóng nhưng không khôi phục ñược sự hữu dục (Schmulling et al., 1993) Khi chuyển gen rolC vào cây thuốc lá thì cây có kiểu hình thấp, lá ngắn,

nhỏ, ra hoa sớm nhỏ giảm khả năng thụ phấn, hạt nhỏ, ít (Scorza et al., 1994) Gen rolD ñược tìm thấy trên vùng TL-DNA của Ri-plasmid, gen này không có khả năng hình thành rễ tơ khi chuyển một mình nó vào trong cây Kiểu hình của

cây do gen rolD gây ra trên cây thuốc lá là tăng số lượng hoa và giảm số lượng rễ,

tuy số lượng hoa tăng nhưng nhị và nhụy chín không ñều ngăn cản sự tự thụ phấn

(Britton et al., 2008)

Khi kết hợp cả ba gen rolA, B, C tạo ra rễ tơ ở cây thuốc lá tuy nhiên khi thể

hiện riêng rẽ sẽ tạo ra kiểu hình ñặc biệt của mỗi gen Mặc dù từng gen có thể hình thành rễ tơ trên cây thuốc lá nhưng khi kết hợp 3 gen thì cho hiệu quả ra rễ cao nhất

(Schmulling et al., 1988)

Ngoài các gen sinh tổng hợp auxin và cytokinin ra thì vùng T-DNA còn mang gen tổng hợp opine ðây là sản phẩm ngưng kết giữa một acid và keto acid amin hoặc với ñường Opine ñược tổng hợp bên trong khối u và ñược tiết ra ngoài,

Agrobacterium sử dụng opine như một nguồn dự trữ cacbon hay nito do ñều có

vùng gen phân giải opine trong plasmid Dựa vào khả năng sinh tổng hợp các opine

ở rễ tơ, Ri-plasmid ñược chia làm 2 nhóm chính: agropine và mannopine, và một số nhóm phụ ñược tìm thấy và phân loại sau này như cucumonpine và mikimopine Trong ñó các chủng thuộc nhóm mannopine (8196, TP7, TR101) và các chủng này ñược sử dụng chủ yếu trong các nghiên cứu tạo rễ tơ ở thực vật (Sevon and Oksman, 2002)

1.3.2 Cơ chế chuyển gen

Cơ chế gây bệnh khối u của vi khuẩn A.tumefaciens và rễ tơ của vi khuẩn

A.rhizogenes là tương tự nhau Khi tế bào thực vật bị thương tiết ra các

polyphenol: acetonsyringone và hydrocyacetonsyringone thu hút các vi khuẩn tập

trung vào vùng vết thương, ñồng thời chúng cũng hoạt hóa các gen ở vùng vir hoạt ñộng Gen của vùng vir có nhiều loại: E, D, C, G, B, A và tạo ra các protein tương

ứng Các protein này có hai chức năng chính: Cắt ñứt bờ phải và bờ trái ñể giải phóng ñoạn T-DNA, bao bọc và vận chuyển T-DNA vào tế bào thực vật và tiếp cận

với bộ gen của cây chủ một cách an toàn (Bernard et al., 2010)

Hình 1.5 Cơ chế chuyển T-DNA của Ti-plasmid sang genome thực vật

(http://science.leidenuniv.nl/index.php/ibl/mdg/profile)

ðể gắn T-DNA vào tế bào thực vật, ñầu tiên vi khuẩn Agrobacterium phải

tiếp xúc với thành tế bào thực vật bị tổn thương Quá trình này ñược thực hiện

nhờ các gen chvA và chvB Gen chvB mã hoá một protein liên quan ñến hình thành β-1,2 glucan mạch vòng, trong khi ñó gen chvA xác ñịnh một protein vận

chuyển, ñịnh vị ở màng trong của tế bào vi khuẩn Protein vận chuyển giúp vận chuyển β-1,2 glucan vào khoảng giữa thành tế bào và màng sinh chất β-1,2

glucan giữ vai trò quan trọng ñể vi khuẩn Agrobacterium tiếp xúc với thành tế

bào thực vật Nếu không có sự tiếp xúc này, sẽ không có sự dẫn truyền T-DNA

Các sản phẩm protein của vùng vir có tác dụng cho việc dẫn truyền T-DNA

từ vi khuẩn vào tế bào thực vật Các loại protein ñó rất cần thiết cho quá trình cắt T-DNA khỏi Ti-plasmid, cảm ứng thay ñổi màng tế bào thực vật mà chúng tiếp xúc, tham gia di chuyển phần T-DNA qua màng vi khuẩn tới tế bào chất của

tế bào thực vật, vận chuyển tới nhân rồi cuối cùng xâm nhập vào genome của cây chủ

Quá trình chuyển gen chỉ do sản phẩm của các gen vir (vùng vir) và gen

chv quyết ñịnh mà không liên quan ñến các gen khác trên T-DNA Tuy nhiên,

chuỗi DNA 25 bp (RB và LB của T-DNA) có vai trò là vị trí cảm ứng cho các

sản phẩm của tổ hợp các gen vùng vir, ñặc biệt là protein từ gen virE mang

chúng dẫn truyền vào tế bào thực vật Chúng hoạt ñộng như các tín hiệu nhận biết và khởi ñộng quá trình dẫn truyền

Sau khi tiếp xúc, protein virA có chức năng như một sensor sẽ nhận biết

các phân tử tín hiệu từ tế bào thực vật Các tín hiệu này chính là các hợp chất acetonsyringone và hydrocyacetonsyringone do tế bào thực vật bị tổn thương tiết

ra ðây là tín hiệu quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn vào tế bào

thực vật Acetonsyringone (AS) ñược nhận diện bởi protein virA-receptor trên

màng vi khuẩn Protein này có chức năng chuyển phân tử tín hiệu AS từ vị trí mô

cây bị tổn thương xuyên qua màng tế bào ñể vào tế bào Agrobacterium Sau khi vào tế bào vi khuẩn AS hoạt ñộng như một nhân tố hoạt hóa gen vùng vir

Protein virA tự phosphoryl hóa rồi sau ñó phosphoryl hóa protein virG Các tín hiệu hóa học này sẽ ñược dẫn truyền từ protein virA sang protein virG Sản phẩm của protein virG tiếp tục làm hoạt hóa toàn bộ các gen vir còn lại mà hai gen ñược hoạt hóa cuối cùng là virB và virE (Schmulling et al., 1988)

Trước ñó, khi virD ñược hoạt hóa sản phẩm của nó cảm ứng nhận biết bờ

trái và bờ phải của T-DNA và làm ñứt phần T-DNA ra khỏi DNA của plasmid, sản phẩm của gen này sẽ thực hiện quá trình tạo sợi ñơn T-DNA chiều

Ti-3’ ñến 5’ (ss T-DNA) từ sợi kép ban ñầu Hai protein virD1 và virD2 nhận biết

hai trình tự 25 kb ñặc hiệu tại bờ trái (LB) và bờ phải (RB), sau ñó ñoạn T-DNA ñơn ñược cắt ra khỏi sợi kép Quá trình phosphoryl hóa này cũng làm thay ñổi thẩm suất màng tế bào thực vật, màng tế bào bị mềm ra và bị thủng ðoạn ss T-

DNA sẽ ñược bảo vệ, bao bọc chặt chẽ bởi protein virE khỏi sự phân giải bởi

các nuclease nội bào Tiếp ñến phức hợp ss T-DNA sẽ ñược ñưa sang tế bào

thực vật thông qua kênh vận chuyển ñược tạo bởi các protein virB, có khoảng 11 loại protein ñược mã hóa bởi gen virB Khi T- DNA ñã ñược chuyển giao vào tế

bào thực vật, chúng nhanh chóng xâm nhập vào genome tế bào thực vật ñược ổn

ñịnh và di truyền như các gen bình thường khác (Bernard et al., 2010)

Cuối cùng khi vào ñến nhân tế bào thực vật cần phải gắn kết sợi ñơn

T-DNA vào genome tế bào thực vật Hai protein virE2 và virD2 có chức năng quan trọng trong quá trình gắn kết Protein virE2 là một loại protein bám sợi ñơn

có chức năng bao bọc bảo vệ ñoạn T-DNA khỏi bị các endonuclease phân hủy

Protein virD2 có chức năng gắn kết T-DNA vào genome thực vật Protein virD2

không chỉ phân cắt tạo sợi ñơn mà còn có chức năng như một enzym nối, nối ñầu 5’ của T-DNA vào ñầu kết thúc 3’ của genome tế bào chủ tại vị trí ngẫu

nhiên (Benoit et al., 2008) Trong quá trình chèn, một số ñoạn DNA ngắn của tế

bào thực vật bị mất, các biên của T-DNA xuất hiện sự tương ñồng với DNA

thực vật tại vị trí chèn (Bernard et al., 2010) Giai ñoạn gắn kết là giai ñoạn cuối

cùng của quá trình biến nạp và cần các protein của tế bào chủ tham gia vào quá trình chuyển ñoạn T-DNA từ dạng sợi ñơn trở về dạng sợi kép và tồn tại trong genome thực vật (Chilton and Qiudeng Que, 2003)

Sau khi chuyển gen vào tế bào thực vật, sự tương tác giữa các gen với nhau

sẽ ảnh hưởng tới kiểu hình của rễ tơ Hình thái rễ tơ khác nhau sau khi chuyển gen có thể là do khả năng chuyển các ñoạn gen khác nhau trên T-DNA vào các

vị trí khác nhau trên nhiễm sắc thể Nếu sự hợp nhất của gen chuyển xảy ra ở vùng tích cực dịch mã kết quả biểu hiện gen có thể bị ảnh hưởng bởi các trình tự ñiều hòa ở phía ñầu gen và ngược lại nếu gen chuyển ñược chèn vào vùng dị nhiễm sắc thì gen chuyển có thể bị bất hoạt Ngoài ra còn có một số yếu tố khác ảnh hưởng ñến sự biểu hiện gen như tương tác gen, sự sắp xếp lại gen, số bản sao của gen

ðể nghiên cứu ñoạn T-DNA ñược chuyển vào người ta ñã sử dụng gen chỉ

thị gus ñể làm sáng tỏ sự biểu hiện của các gen trong từng loại mô và giai ñoạn phát triển (Britton et al., 2008)

1.4 Nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật và sinh khối rễ tơ

1.4.1 Nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật

Công nghệ sinh khối tế bào thực vật ñơn giản là nuôi vô tính các dòng tế bào ñể tạo khối lượng lớn sản phẩm có thể sử dụng cho việc tách chiết các hoạt chất Quá trình này cũng bắt ñầu từ việc tạo ra mô sẹo từ những tế bào, mô khác

nhau của thực vật, sau ñó chúng ñược làm giảm hoặc mất tính biệt hóa và ñược thuần hóa trên môi trường nuôi cấy và cuối cùng là tăng khối lượng trên hệ thống các bình nuôi cấy lớn (bioreactor) (Chawla, 2003)

Nghiên cứu ñầu tiên về nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật ñược thực hiện vào năm 1920, khi các nhà khoa học thành công nhân giống vô tính cây lan Từ năm 1990 ñến nay nhiều sản phẩm nghiên cứu thành công ñã ñược áp dụng rộng rãi trong sản xuất các thực phẩm, dược phẩm, như sản xuất paclitaxeln, taxol dùng làm thuốc ñiều trị ung thư, sản xuất chất kháng khuẩn shikonin và rất nhiều nghiên cứu khác ñang ñược nghiên cứu sản xuất quy mô công nghiệp Nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật ñể thu những hoạt chất sinh học ñược làm dược liệu ñáp ứng nhu cầu về dược phẩm

Cho ñến nay rất nhiều các hoạt chất nguồn gốc từ thực vật có giá trị kinh tế cao là sản phẩm của sinh khối tế bào thực vật: sản xuất chất diệt khuẩn shikonin,

có trong rễ của cây Lithospermum erythrorhizon Shikonin tích lũy không nhiều

trong rễ Tuy nhiên, các nhà khoa học Nhật ñã tạo ñược dòng tế bào rễ cây

Lithospermum có khả năng tích lũy ñến 15% shikonin và ñã hoàn chỉnh công

nghệ nuôi cấy tế bào sản xuất shikonin Công nghệ này cho phép trong một chu

kỳ nuôi cấy thu hoạch tới 5 kg hoạt chất và giúp giảm rất nhiều giá thành của shikonin Ứng dụng hệ thống bioreactor 10000 lít trong sản xuất reserpine

(alkaloid chiết xuất từ cây Rauwolfia serpentina có tác dụng chữa bệnh cao

huyết áp và các bệnh rối loạn tuần hoàn máu) có thể sản xuất ñược 3500 kg resperine trong thời gian 30 ngày, tương ñương với tổng lượng thu ñược hàng năm từ rễ cây ñó Hàm lượng chất thứ cấp cao nhất ñược tìm thấy trong nuôi cấy

tế bào của cây Coleus blumei ñó là chất rosmarinic acid chiếm 13-15% trọng

lượng khô trong chu kỳ nuôi 13 ngày, lớn gấp 5 lần so với hàm lượng trong cây trồng ở ñiều kiện tự nhiên (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006) Betalain từ mô sẹo củ cải

ñường, berberin từ cây Coptis japonica, loài cây này phải trồng từ 4 - 6 năm mới

thu ñược hàm lượng berberin ñáng kể trong rễ, trong khi hàm lượng này có thể thu ñược sau 4 tuần nuôi cấy (Muller and Zenk, 1992), các hoạt chất dùng trong

dược phẩm như caffein thu ñược từ nuôi cấy tế bào Coffea arabica (Kurata et

al., 1998); các chất dùng trong thực phẩm bao gồm các chất tạo mầu

(anthocyanin, crocin), các chất tạo mùi (vani, mùi hành, mùi tỏi)

Nhiều nghiên cứu cho thấy sản phẩn ñược sản xuất theo phương pháp sinh khối cho chất lượng cũng như số lượng cao hơn cây hoàn chỉnh Một số chất thường ñược sản xuất theo phương pháp này như alkaloid, tinh dầu và hợp chất glycosid Các loại vật liệu ñược nuôi cấy có thể là: tế bào ñơn, mô sẹo, protoplast hoặc nuôi cấy rễ

So với nuôi trồng tự nhiên, công nghệ sinh khối tế bào thực vật có nhiều ưu ñiểm như không chịu tác ñộng của các yếu tố tự nhiên nên có thể chủ ñộng nguồn nguyên liệu phục vụ sản xuất, thời gian sản xuất nguyên liệu theo công nghệ sinh khối tế bào rút ngắn hơn nhiều so với gieo trồng tự nhiên, chất lượng sản phẩm ổn ñịnh do các ñiều kiện nuôi cấy ñược kiểm soát chặt chẽ và có thể ñiều khiển quá trình sinh tổng hợp ñể tăng tích lũy các hoạt chất chính

Trên cây nhân sâm ñã có rất nhiều các nghiên cứu về tạo sinh khối sâm từ

tế bào huyền phù, mô sẹo, nuôi cấy rễ hay rễ tơ ñể thu các hoạt chất quý Hiện nay, một số nước tiêu thụ và xuất khẩu sâm lớn như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc ñã ứng dụng nuôi cấy sinh khối tế bào từ nhân sâm trong sản xuất các sản phẩm chức năng hiện nay làm thuốc bổ, thuốc phòng chống bệnh tim mạch, chống gốc tự do, tăng cường chức năng hệ thần kinh trung ương, các loại mỹ

phẩm (Jeong et al., 2002)

Tại Hàn Quốc và một số nước khác, nhân sâm (Panax ginseng) ñã ñược

nuôi cấy tạo rễ bất ñịnh thành công và ñược ứng dụng sản xuất ở quy mô công nghiệp, tạo ñược sinh khối rất lớn ñáp ứng nhu cầu của xã hội, rút ngắn thời gian sản xuất ñáng kể, cho hiệu quả kinh tế vô cùng to lớn Một số công ty ñang sản xuất rễ tơ nhân sâm với bioreactor có dung tích 10000 ñến 20000 lít Sản phẩm này ñược làm nguyên liệu cho các dạng thực phẩm chức năng và thực phẩm khác

nhau trên thị trường (Murthy et al., 2008)

Sâm Ngọc Linh là cây dược liệu quý, ñặc hữu cho vùng sinh thái nhất ñịnh Thời gian sinh trưởng của cây sâm Ngọc Linh dài, cần tới 6 năm mới có thể bắt ñầu thu hoạch và 7 - 10 năm mới thu ñược củ sâm chất lượng tốt Trong khi ñó,

việc khai thác bừa bãi và không có phương pháp quản lý hiệu quả ñã dẫn ñến không ñủ ñáp ứng nhu cầu cung cấp nguyên liệu cho sản xuất

Nhóm nghiên cứu của Học viện Quân y trong nghiên cứu tạo sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh ñã hoàn thiện quy trình tạo khối tế bào sâm Ngọc Linh từ giai ñoạn nuôi cấy tạo mô sẹo ñến nuôi cấy trong bioreactor 15 lít Sau khi nghiên cứu thành công quy trình nuôi cấy tế bào trong phòng thí nghiệm, các nhà khoa học ở Học viện Quân y tiếp tục triển khai hệ thống các phòng sinh khối tế bào thực vật với trang thiết bị hiện ñại, nâng công suất sinh khối từ 5 lít/mẻ lên thành 100 lít/mẻ (tương ñương 35 kg sinh khối sâm tươi) (Oanh Vũ, 2009) Nguyễn Thành Sum và cộng sự thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm TP.HCM cũng ñã thành công trong nghiên cứu tạo rễ bất ñịnh từ mô sẹo

và nhân sinh khối rễ ñể thu hoạch Kết quả nghiên cứu cho thấy thời gian thu hoạch ñược rễ sâm Ngọc Linh như trên chỉ mất khoảng 4 tháng mà vẫn ñảm bảo ñược hàm lượng saponin thiết yếu của sâm (Nguyễn Văn Long, 2011)

Trong thí nghiệm ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ñến sự tăng sinh khối và sản phẩm trao ñổi chất thứ cấp ginsenoside trong nuôi cấy lỏng tế bào sâm Ngọc Linh cho thấy khi tăng lượng ñường 0 - 50g/lít thì sinh khối tăng từ 5,4 - 10,3 g/lít Nồng ñộ ñạm 30mM là tối ưu cho sự sinh trưởng tế bào và sự

tích lũy sản phẩm trao ñổi chất thứ cấp ginsenoside (Nguyen Trung Thanh et

al., 2007)

Theo nghiên cứu của Tống Thị Ngọc lệ và cs (2010) về tác dụng của viên nang mềm sâm Ngọc Linh ñược bào chế từ sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh trên chuột cho thấy viên nang mềm sâm Ngọc Linh có ñộ an toàn cao, không gây ñộc

và có tác dụng tăng lực trên chuột

Trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật nhằm giảm hoặc mất tính biệt hóa ở các mô tế bào nuôi cấy có bổ sung các chất ñiều hòa sinh trưởng vào trong môi trường nuôi cấy, tồn dư của các chất ñiều hòa sinh trưởng trong sinh khối tế bào nuôi cấy ảnh hưởng ñến sản phẩm và sức khỏe người sử dụng

Có thể khắc phục trong nuôi cấy sinh khối từ rễ tơ do rễ tơ có thể sinh trưởng, phát triển tốt trên môi trường không cần bổ sung các chất ñiều hòa sinh trưởng,

rễ tơ có khả năng sinh trưởng nhanh, phân nhánh cao, kỹ thuật nuôi cấy, chuyển gen dễ dàng và có thể ñược nuôi cấy tạo sinh khối liên tục, ñiều này có ý nghĩa trong dây chuyền sản xuất các chất thứ cấp hay các dược phẩm sinh học (Pham, 2009) Rễ tơ có thể sản xuất một lượng lớn các hợp chất thứ cấp và là cơ quan biệt hóa nên rễ tơ có sự di truyền ổn ñịnh hơn nuôi cấy tế bào huyền phù và mô

sẹo (Woo et al., 2004)

1.4.2 Nuôi cấy sinh khối rễ tơ

Rễ tơ do vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes gây ra ở cây hai lá mầm Số

lượng các rễ tơ ñược tạo ra khá nhiều, phát triển thành một hệ thống lông rễ, hay còn gọi là hệ thống rễ tơ

Trong tự nhiên, rễ tơ có khả năng phát triển mạnh, gây ảnh hưởng cho cây chủ và làm cho cây chết Tuy nhiên, dựa trên một số ñặc ñiểm ñặc trưng, rễ tơ

ñã ñược ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu Hiện nay, hệ thống nuôi cấy sinh khối rễ tơ ñược sử dụng trong một số lĩnh vực nghiên cứu như: nghiên cứu chức năng của gen, biểu hiện protein ngoại lai, nghiên cứu sinh lý rễ, tạo giống cây trồng chuyển gen, nghiên cứu tương tác giữa hệ thống rễ và ñiều kiện môi trường… Trong số các ứng dụng, công nghệ nuôi cấy sinh khối rễ tơ nhằm thu hoạt chất sinh học ñược quan tâm hơn cả

Rễ tơ có khả năng sinh trưởng cao và có tính ổn ñịnh di truyền trên môi trường nuôi cấy không cần bổ sung chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật Rễ tơ có khả năng tổng hợp ra nhiều loại hợp chất tự nhiên với hiệu suất cao, có thể mở rộng quy mô sản xuất bằng bioreactor nhưng cần có thiết kế ñặc biệt ñể các mô phân bố ñồng ñều, cần kết nối với hệ thống máy tính ñể xác ñịnh ñược thông số

về dinh dưỡng, oxy, pH, nhiệt ñộ và các hợp chất trao ñổi trong môi trường ñể ñảm bảo rễ sinh trưởng tốt, cho năng suất cao (Giri and Narasu, 2000)

Về bản chất rễ tơ phát sinh từ những tế bào thực vật mang một ñoạn gen

gây bệnh của Agrobacterium rhizogenes do ñó những tế bào này vẫn mang ñầy

ñủ bộ gen vốn có của cây và vẫn có khả năng tổng hợp những hoạt chất có trong thực vật Các ñoạn rễ chuyển gen này sau ñó ñược tách ra và nuôi cấy trong môi trường không chứa chất ñiều hòa sinh trưởng xem như là một nguồn nguyên liệu

có giá trị trong sản xuất các hợp chất thứ cấp hữu ích phục vụ cho các mục ñích

nghiên cứu và ứng dụng trong y dược, công nghiệp (Pistelli et al., 2010)

Năm 1985, Flores và Filner lần ñầu tiên sản xuất chất trao ñổi thứ cấp từ

nhân nuôi rễ tơ ở Hyoscyamus muticus Những rễ này sản xuất nhiều hoạt chất

hyoscyamine hơn cây tự nhiên (Giri and Narasu, 2000)

Phạm Bích Ngọc và cs (2012) ñã tìm ra ñược qui trình chuyển gen tạo rễ tơ

vào cây Bá Bệnh thông qua chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC

15834 Các tác giả ñã thu ñược tỷ lệ cảm ứng tạo rễ tơ cao nhất là 71% và thấp nhất là 64,5% khi tiến hành biến nạp vào thân và lá cây mầm cây Bá bệnh Kết quả và môi trường phù hợp cho việc nuôi cấy là WPM Thông qua quá trình chọn lọc ñã tuyển chọn ñược 23 dòng rễ tơ có khả năng sinh trưởng nhanh, khả năng phân nhánh mạnh, có thể ứng dụng cho công nghệ nuôi cấy sinh khối bioreactor thu hợp chất thứ cấp

Rễ tơ Glycyrrhiza glara trong bình bioreactor

(a) rễ ñang phát triển trong bình; (b),(c) thu hoạch rễ tơ sau 30 ngày nuôi cấy

Hình 1.6 Nuôi cấy rễ tơ (http://www.ejbiotechnology.cl/content/vol11/issue2 /full/6/f4.html)

Quá trình sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp trong rễ tơ ñược kiểm soát bởi bộ gen, nhưng nó cũng bị ảnh hưởng bởi yếu tố dinh dưỡng, thành phần môi trường nuôi rễ tơ có ảnh hưởng một cách ý nghĩa ñến số lượng các chất thứ cấp ñược sản xuất Yêu cầu cơ bản khi thiết kế các công thức môi trường dinh dưỡng là ñảm bảo hoàn thành sự sinh trưởng của tế bào Sau khi tế bào ñạt ñến một lượng sinh khối nhất ñịnh, sự thay ñổi thành phần môi trường cũng

có thể ảnh hưởng ñến sự tích lũy sản phẩm Chẳng hạn, người ta ñã cải thiện hàm lượng của shikonin có nguồn gốc từ nuôi cấy dịch huyền phù tế bào của

cây Lithospermum erythrorhizon bằng cách dùng môi trường sản xuất ñể thay

cho môi trường sinh trưởng Môi trường sản xuất thường chứa nhiều sucrose hơn nhưng ít các thành phần vô cơ và vitamin hơn so với môi trường sinh trưởng (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006)

Công ty Escagenetics (California, Mỹ) ñã thành công trong sản xuất taxol

bằng nuôi cấy rễ tơ Taxol là chất tách chiết từ vỏ và lá của cây thông ñỏ (Taxus

brevifolia) ñang ñược sử dụng hiệu quả trong ñiều trị nhiều loại ung thư Việc

cung cấp taxol gặp khó khăn vì cây thông ñỏ khan hiếm và hàm lượng taxol trong chúng rất thấp (Ở 100 cây thông ñỏ một trăm năm tuổi, trung bình thu ñược 3 kg vỏ, chiết xuất ñược khoảng 300 mg taxol) Công ty Escagenetics ñã

có thể sản xuất taxol với nồng ñộ cao hơn nồng ñộ tự nhiên thấy trong vỏ và lá cây thông ñỏ (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006)

Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

Cây sâm Ngọc Linh invitro (do phòng Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện

Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp)

Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 và ATCC 15834 mang vector PTN289 chứa gen gusA mã hóa cho enzym β- glucuronidase (do Viện

Dược liệu và Sinh học phân tử, trường ðại học Heidelberg, CHLB ðức cung cấp)

2.2 ðịa ñiểm, thời gian

ðề tài ñược tiến hành tại phòng Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Thời gian tiến hành ñề tài: từ tháng 4 năm 2013 ñến tháng 7 năm 2014

Xác ñịnh mô, cơ quan thích hợp cho quá trình chuyển gen

Xác ñịnh các thông số tối ưu cho quy trình chuyển gen

Kiểm tra các dòng rễ tơ nhận gen chuyển bằng kỹ thuật PCR

Xác ñịnh môi trường nuôi cấy rễ tơ

2.5 Phương pháp thực hiện

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm ñược bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần

nhắc lại

ðiều kiện thí nghiệm:

Bố trí trong tủ tối hoặc trên giàn ñèn có cường ñộ ánh sáng 2000 lux

Chu kỳ 16 giờ sáng 8 giờ tối tùy theo thí nghiệm

Nhiệt ñộ phòng nuôi cấy ñiều chỉnh ở mức 22 ± 1oC

Phương pháp nghiên cứu:

- Sử dụng phương pháp nuôi cấy mô hiện hành

- Các loại môi trường sử dụng:

Môi trường nuôi khuẩn YMB – Yeast Manitol Broth

Môi trường cơ bản SH (Schenk & Hildebrandt, 1972)

Môi trường ñồng nuôi cấy SH + saccharose 30 g/l + agar 8g/l

Môi trường cảm ứng ra rễ SH + saccharose 30 g/l + agar 8g/l + kháng sinh cefotaxime (500 mg/l)

Môi trường pha khuẩn ½ SH + 20g/l saccharose + 10g/l glucose

Môi trường nuôi rễ SH + saccharose 30 g/l + kháng sinh cefotaxime (500 mg/l)

2.5.1 Tiến hành với chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC15834 chứa gen gusA

ðể khảo sát khả năng chuyển gen và tìm ra quy trình chuyển gen vào sâm Ngọc Linh

Lượng mẫu: 90 mẫu/công thức

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nguồn mẫu ñến hiệu quả chuyển gen nhờ vi khuẩn

A rhizogenes qua biểu hiện của gen gus

Công

thức Nguồn mẫu Ghi chú

1 Mẫu lá Sử dụng chủng vi khuẩn A.rhizogenes ATCC 15834 có mang

vectơ pTN289 Mẫu lá cây in vitro ñược cắt thành các ñoạn có

kích thước 0,5 x 0,5 cm, cuống lá ñược cắt thành ñoạn 1cm, củ ñược tạo tổn thương sau ñó cắt thành lát có ñộ dày 0,1 - 0,15

cm chuyển vào ñĩa petri Lây nhiễm trong 15 - 20 phút, giá trị

OD600 0,3-0,6, tiến hành ñồng nuôi cấy trên môi trường SH trong tối 24 - 48 giờ Sau ñó nhuộm X-gluc ñể kiểm tra sự

biểu hiện tạm thời của gen gusA

Callus ñược tạo từ mô lá, callus 10 tuần tuổi ñược sử dụng ñể biến nạp

2 Cuống lá

3 Callus

4 Củ