nghiên cứu khảo sát điều kiện chuyển gen tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn agrobacterium rhizogenes ở sâm ngọc linh (panax vietnamensis ha et grushv)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM --------- --------- ðINH THỊ LAN NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT ðIỀU KIỆN CHUYỂN GEN TẠO RỄ TƠ THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM RHIZOGENES Ở SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV) CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mà SỐ: 06.472.0201 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. CHU HOÀNG HÀ GS. TS. NGUYỄN QUANG THẠCH HÀ NỘI - 2014 LỜI CAM ðOAN - Tôi xin cam ñoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa ñược công bố công trình khoa học nào. - Tôi xin cam ñoan giúp ñỡ cho việc thực luận văn ñã ñược cảm ơn thông tin trích dẫn luận văn ñều ñược rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn ðinh Thị Lan Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS. TS. Chu Hoàng Hà, GS. TS. Nguyễn Quang Thạch, TS. Phạm Bích Ngọc ñã tận tình hướng dẫn, giúp ñỡ tạo ñiều kiện cho hoàn thành chương trình học tập, thực ñề tài hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp. Tôi xin ñược trân trọng cảm ơn KS. Nguyễn Khắc Hưng, KS. Nguyễn ðình Trọng tập thể cán Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam ñã nhiệt tình giúp ñỡ trình thực nghiên cứu ñề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học Học viện Nông nghiệp Việt Nam ñã hướng dẫn, truyền ñạt kiến thức cho suốt thời gian học tập nghiên cứu. Tôi chân thành cảm ơn người thân gia ñình bạn bè ñã tạo ñiều kiện giúp ñỡ, ñộng viên thực ñề tài hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Hà nội, tháng 07 năm 2014 Tác giả luận văn ðinh Thị Lan Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN I LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC III DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VI DANH MỤC BẢNG VII DANH MỤC HÌNH VIII MỞ ðẦU 1.1. Tính cấp thiết 1.2. Mục ñích 1.3. Ý nghĩa khoa học thực tiễn CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cây sâm Ngọc Linh 1.1.1. Phân loài 1.1.2. Hình thái 1.1.3. ðặc ñiểm sinh thái 1.1.4. Sinh trưởng 1.1.5. Phân bố 1.1.6. Giá trị dược liệu 1.1.7. Tình hình nghiên cứu sâm Ngọc Linh 10 1.2. 13 Tình hình nghiên cứu chuyển gen 1.2.1. Khái niệm chuyển gen 13 1.2.2. Lịch sử chuyển gen vào thực vật 13 1.2.3. Các phương pháp chuyển gen 15 1.3. 15 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 1.3.1. Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 16 1.3.2. Cơ chế chuyển gen 20 1.4. 23 Nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật sinh khối rễ tơ Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii 1.4.1. Nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật 23 1.4.2. Nuôi cấy sinh khối rễ tơ 27 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1. Vật liệu 30 2.2. ðịa ñiểm, thời gian 30 2.3. Hóa chất thiết bị 30 2.4. Nội dung 30 2.5. Phương pháp thực 30 2.5.1. Tiến hành với chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC15834 chứa gen gusA 31 2.5.2. Tiến hành chuyển gen vào sâm Ngọc Linh với chủng Agrobacterium rhizogenes ATCC15834 ñể kiểm tra lại quy trình cảm ứng rễ. 33 2.5.3. Chuẩn bị vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 37 2.5.4. Quy trình lây nhiễm 37 2.5.5. Phương pháp kiểm tra có mặt gen gus 38 2.5.6. Phương pháp kiểm tra dòng chuyển gen 39 2.5.7. Phương pháp tách chiết DNA tổng số 39 2.5.8. Phương pháp PCR – Polymerase Chain Reaction 41 2.5.9. Các tiêu theo dõi 43 2.5.10. Xử lý kết 43 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 3.1. Khảo sát khả chuyển gen vào sâm Ngọc Linh nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 có chứa gen gusA 44 3.1.1. Ảnh hưởng nguồn mẫu ñến hiệu chuyển gen nhờ vi khuẩn 44 Agrobacterium rhizogenes 3.1.3. Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm ñến hiệu chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 48 3.1.4. Ảnh hưởng thời gian ñồng nuôi cấy ñến hiệu chuyển gen nhờ 50 vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv 3.1.5. Ảnh hưởng mật ñộ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ñến hiệu chuyển gen 52 3.1.6. Kết chuyển gen sâm Ngọc Linh thông qua vi khuẩn A.Rhizogenes 53 3.2. 54 Chuyển gen tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn A. rhizogenes ATCC 15834 3.2.1. Ảnh hưởng nguồn mẫu ñến khả tạo rễ tơ 55 3.2.2. Ảnh hưởng nồng ñộ chất cảm ứng acetonsyringone (AS) ñến khả tạo rễ tơ 57 3.2.3. Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm ñến khả tạo rễ tơ 59 3.2.4. Ảnh hưởng thời gian ñồng nuôi cấy ñến khả tạo rễ tơ 61 3.2.5. Ảnh hưởng mật ñộ vi khuẩn A. rhizogenes ñến khả tạo rễ tơ 63 3.2.6. Ảnh hưởng tổ hợp ñiều kiện ñến khả tạo rễ tơ 64 3.3. 65 Chọn lọc kiểm tra có mặt gen rol dòng rễ tơ 3.3.1. Chọn lọc dòng rễ tơ 65 3.3.2. Kiểm tra có mặt gen rol dòng rễ tơ 66 3.4. 68 Xác ñịnh môi trường nuôi cấy dòng rễ tơ KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72 Kết luận 72 Kiến nghị 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 PHỤ LỤC 82 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A. rhizogenes : Agobacterium rhizogenes AS : Acetosyringone bp : Base pair DNA : Desoxyribonucleic acid GusA : β-glucuronidase kp : Kilobase pair LB : Left border PCR : Polymerase Chain Reaction : RB Right border Ri-plasmid : Root induction plasmid Rol : Root locus SH : Schenk Hildebrandt, 1972 ss T-DNA : Single strain T-DNA Vir : Virulence genes WPM : Woody Plant Medium YMB : Yeast Malnitol Broth Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 1.1 Hàm lượng saponin sâm Việt Nam loài Panax trồng trọt. 3.1 Ảnh hưởng nguồn mẫu ñến hiệu chuyển gen nhờ vi khuẩn A. rhizogenes qua biểu gen gus 3.2 45 Ảnh hưởng nồng ñộ chất cảm ứng acetonsyringone ñến hiệu chuyển gen nhờ vi khuẩn A. rhizogenes qua biểu gen gus 3.3 Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm vi khuẩn A. rhizogenes ñến hiệu chuyển gen qua biểu gen gus 3.4 49 Ảnh hưởng thời gian ñồng nuôi cấy ñến hiệu chuyển gen nhờ vi khuẩn A. rhizogenes qua biểu gen gus 3.5 51 Ảnh hưởng mật ñộ vi khuẩn A.rhizogenes ñến hiệu chuyển gen qua biểu gen gus 3.6 52 Ảnh hưởng tổ hợp ñiều kiện tối ưu ñến hiệu chuyển gen nhờ vi khuẩn A. rhizogenes qua biểu gen gus 3.7 54 Ảnh hưởng nguồn mẫu ñến khả tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn 56 A. rhizogenes 3.8 Ảnh hưởng nồng ñộ chất cảm ứng acetonsyringone (As) ñến khả tạo rễ tơ 3.9 47 58 Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm vi khuẩn A. rhizogenes ñến khả tạo rễ tơ 60 3.10 Ảnh hưởng thời gian ñồng nuôi cấy ñến khả tạo rễ tơ 62 3.11 Ảnh hưởng mật ñộ vi khuẩn A. rhizogenes ñến khả tạo rễ tơ 63 3.12 Ảnh hưởng tổ hợp ñiều kiện tới ñến khả tạo rễ tơ 65 3.13 Ảnh hưởng nước dừa casamino acid tới sinh trưởng rễ tơ 69 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Cây sâm Ngọc Linh 1.2 Một số ñặc ñiểm hình thái sâm Ngọc Linh 1.3 Vi khuẩn Agrobacterium sp, rễ tơ 16 1.4 Cấu trúc Ri- plasmid 17 1.5 Cơ chế chuyển T-DNA Ti-plasmid sang genome thực vật 21 1.6 Nuôi cấy rễ tơ 28 3.1 Kết thử vật liệu chuyển gen 46 3.2 Kết kiểm tra nồng ñộ AS 48 3.3 Kết kiểm tra thời gian lây nhiễm 50 3.4 Kết kiểm tra ảnh hưởng thời gian ñồng nuôi cấy 52 3.5 Kết kiểm tra OD600 53 3.6 Khả rễ loại mô khác 56 3.7 Mẫu rễ tơ nồng ñộ AS 100 µM 59 3.8 Kết kiểm tra thời gian lây nhiễm 61 3.9 Kết kiểm tra thời gian ñồng nuôi cấy 63 3.10 Kết kiểm tra nồng ñộ vi khuẩn 64 3.11 Các dạng hình thái rễ tơ 66 3.12 Kết phản ứng PCR kiểm tra gen rolA rolB 67 3.13 Kết phản ứng PCR kiểm tra gen rolC 67 3.14 Ảnh hưởng nước dừa 70 3.15 Ảnh hưởng casamino acid 71 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii MỞ ðẦU 1.1.Tính cấp thiết Sâm Ngọc Linh có tên khoa học Panax vietnamensis Ha et Grushv, thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae). Panax xuất phát từ chữ Panacea tiếng Hy Lạp, có nghĩa thuốc trị bách bệnh, thần dược. Tác dụng dược lý sâm Ngọc Linh ñã ñược nhiều nhà khoa học Việt Nam giới nghiên cứu chứng minh thuốc quý dùng ñể chữa nhiều bệnh tăng cường sức khỏe tăng lực, tăng trí nhớ, bảo vệ thể chống stress, tác ñộng lên hệ miễn dịch, tăng sức ñề kháng cho thể, giúp chống viêm, ngăn cản lão hóa, v.v . (Duc N.M et al., 1996). Theo nhà khoa học sâm Ngọc Linh có tác dụng kích thích hệ miễn dịch, chống ôxi hóa, lão hóa, phòng chống ung thư, bảo vệ tế bào gan, tăng thị lực, hoạt ñộng trí tuệ cải thiện thể lực, nâng cao huyết áp người bị huyết áp thấp, có tính kháng khuẩn, chống trầm cảm, giảm lo âu. Chính mà sâm ñược xem vị thuốc quý, ñứng ñầu vị thuốc bổ theo thứ tự Sâm, Nhung, Quế, Phụ y học cổ truyền, ñã ñược sử dụng từ lâu ñời nước giới Việt Nam (ðỗ Tất Lợi, 2006). Những kết nghiên cứu thân rễ rễ củ sâm Ngọc Linh (2007) ñã thu nhận ñược tới 50 saponin ñó 26 sanopin thường thấy sâm Triều Tiên, sâm Mỹ, sâm Nhật 24 saponin damaran có cấu trúc mới. Trong cọng ñã phân lập ñược 19 saponin, ñó có saponin có cấu trúc mới. ðã xác ñịnh ñược sâm Ngọc Linh 17 axít amin ñó có axít amin không thay thế, 17 axít béo, 20 nguyên tố ña lượng, vi lượng hàm lượng tinh dầu 0,1%. Sâm Ngọc Linh chứa chủ yếu saponin triterpen, loại sâm có hàm lượng saponin số lượng saponin nhiều so với loài khác chi Panax. Sâm Ngọc Linh chứa hợp chất ña dạng ñược xem thần dược với sức khỏe người khiến giá sâm Ngọc Linh thị trường cao, có thời ñiểm kg sâm Ngọc Linh tươi Quảng Nam có giá 25 - 30 triệu ñồng, lúc khan Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 9. Nguyễn Như Chính (2003). Tóm tắt số kết kinh nghiệm tạo giống sâm Việt nam từ hạt, Kỷ yếu hội nghị khoa học, công nghệ môi trường, 377-386. 10. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005). Công nghệ Sinh học nông nghiệp, NXB Nông nghiệp. 11. Nguyễn Thị Liễu, Nguyễn Trung Thành, Nguyễn Văn Kết (2011). Nghiên cứu khả tạo rễ bất ñịnh sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nuôi cấy invitro, Tạp chí Khoa học ðHQGHN, 27: 30-36. 12. Nguyễn Văn Long (2011). Nghiên cứu trình tạo sinh khối tế bào ñánh giá số tác dụng sâm Ngọc Linh sinh khối, Luận án tiến sĩ Y học, Học viện Quân y. 13. Nguyễn Tập (2006). Danh lục ðỏ thuốc Việt Nam năm 2006, Tạp chí Dược liệu, 3(11): 97-105. 14. Oanh Vũ (2009). Nuôi cấy tế bào ñể sản xuất hợp chất thứ cấp, Tạp chí Stinfo, :12-14. 15. Phạm Bích Ngọc (2012). Nghiên cứu khả tạo rễ tơ bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefacsiens, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 50(3B): 166-173. 16. Phạm Quốc Hùng, Nguyễn Huy Dũng, Nguyễn Quốc Dựng, Lê ðức Thanh, Lê Mạnh Tuấn, Nguyễn Mạnh Hùng, Trần Văn Hổ, Nguyễn Thị Hằng (2010). ðiều tra ñánh giá tình trạng bảo tồn loài thực vật rừng nguy cấp, quý thuộc danh mục nghị ñịnh 32/2006/Nð-CP theo vùng sinh thái, Báo cáo dự án. 17. Tống Thị Ngọc Lệ, Nguyễn Văn Thư, Nguyễn Văn Long, Vũ Bình Dương (2010). Nghiên cứu ñộc tính cấp tác dụng tăng lực viên nang mềm sâm Ngọc Linh ñộng vật thực nghiệm, Tạp chí Y dược học Quân sự, 1:1-5. 18. Trần Mỹ Tiên, Nguyễn Thị Thu Hương (2005). Nghiên cứu số tác dụng dược lý sâm Việt nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv, Araliacea), Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học công nghệ 2001 – 2005, viện Dược liệu: 95-96. 19. Trần Quang Trung, Phan Thị Hằng, Nguyễn Văn Bạch (2013). Xác ñịnh hàm lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1, sâm Ngọc Linh tự nhiên sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu cao, Tạp chí Y dược Quân sự, 9: 25-31. 20. Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ (2006). Công nghệ chuyển gen Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 74 ñộng vật, thực vật, Nxb ðại học Huế. 21. Vũ Thị Hiền, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Phúc Huy, Nguyễn Bá Nam, Bùi Thế Vinh, Thái Xuân Du, Dương Tấn Nhựt (2014). Phát sinh phôi trực tiếp từ lá, cuống thân rễ sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), Tạp chí Sinh học, 36(1): 277-282. Tài liệu tiếng Anh 22. Agampodi V. A. and Jayawardena Bimali (2009). Effect of coconut (Cocos nucifera L.) water extracts on adventitious root development in vegetative propagation of Dracaena purplecompacta L., Acta Physiologiae Plantarum, 31(2): 279-284. 23. Benoit Lacroix, Michael Elbaum, Vitaly Citovsky and Tzvi Tzfira (2008). Intracellular transport of Agrobacterium T-DNA, Biology to Biotechnology, New York: Springer publish: 365-385. 24. Bensaddek Lamine, Villarreal María Luisa and Fliniaux Marc-André (2008). Induction and growth of hairy roots for the production of medicinal compounds, Electronic Journal of Integrative Biosciences, 3(1): 2-9. 25. Bernard R Glick, Jack J Pasternak and Cheryl L Patten (2010). Molecular Biotechnology: Principles and applications of recombinant DNA, ASM press. 26. Burrus M, Chanabe C, Alibert G and Bidney D (1991). Regeneration of fertile plants from protoplasts of sunflower (Helianthus annuus L.), Plant cell rep, 10(4): 161-166. 27. Britton Monica T, Escobar Matthew A and Dandekar Abhaya M Dandekar (2008). The oncogenes of Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes, Biology to Biotechnology, New York: Springer publish: 524-565. 28. Cardarelli M and Spnò L (1987). The role of auxin in hairy root induction, Mol Gen Gennet, 208(3): 457-463. 29. Chandran R. P. and Potty V. P. (2011). Different inducer molecules and strains of Agrobacterium rhizogenes on enhancing transformation frequency in host plants, Biotechnology, 10(2): 203-208. 30. Chawla HS (2003). Introduction plant biotechnology, Amazon Press. 31. Chilton MD and Tepfer DA (1982). Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells, Nature, 295: 432-434. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 75 32. Chilton Mary-Dell M. and Qiudeng Que (2003). Targeted integration of T-DNA into the tobacco genome at doublestrand breaks: New insights on the mechanism of T-DNA integration, Plant Physiol, 133(3): 956-965. 33. Choi Y. E., Jeong J. H., In J. K. and Yang D. C. (2003). Production of herbicideresistant transgenic Panax ginseng through the introduction of the phosphinothricin acetyl transferase gene and successful soil transfer, Plant Cell Reports, 21(6): 563-568. 34. Christey MC (2001). Use of Ri-mediated transformation for production of transgenic plants, In Vitro Cell. Dev, Biol-Plant, 37(6): 687-700. 35. Duc NM, Kasai R, Ohtani K, Ito A, Yamasaki K, Nguyen TN and Tanaka O (1996). New saponins from Vietnamese ginseng: highlights on biogenesis of dammaranetriterpenoids, Advances in Experimental Medicine and Biology, 404: 129-49. 36. Duc NM, Kasai R, Ohtani K, Ito A, Nham NT, Yamasaki K and Tanaka O (1994). Saponins from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv. collected in central Vietnam. III, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 42(3): 634-640. 37. Dupre Patricia, Lacoux Jerome, Neutelings Godfrey, Mattar-Lauran Dominique, Fliniaux Marc-Andre, David Alain and Jacquin Dubreuil Annie (2000). Genetic transformation of Ginkgo biloba by A. tumefaciens, Physiologia Plantarum, 108(4): 413-419. 38. Fang Guowei and Grumet Rebecca (1990). Agrobacterium tumefaciens mediated transformation and regeneration of muskmelon plants, Plant Cell Reports, 9(3): 160-164. 39. Gao N., Shen W., Cao Y., Su Y. and Shi W. (2009). Influence of bacterial density during preculture on Agrobacterium-mediated transformation of tomato, Plant Cell, 98: 321-330. 40. Giri A and Narasu ML (2000). Transgenic hairy roots recent trends and applications, Biotechnology Advances, 18(1): 1-22. 41. Hamid R., Zubeda C. and Mohammad H. K. (2011). Effect of explant plant source and acetosyringone concentration on transformation efficiency of wheat cultivars, African Journal of Biotechnology, 10(44): 8737-8740. 42. Hernalsteens Jean Pierre, Francoise Van Vliet, Marc Debeuckeleer, Ann Depicker, Gilbert Engler, Michel Lemmers, Marcelle Holsters, Marc Van Montagu and Jeff Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 76 Schell (1980). The Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid as a host vector system for introducing foreign DNA in plant cells, Nature, 287: 654-656. 43. Hoekema A., Hirsch P. R., Hooykaas P. J. J. and Schilperoort R. A. (1983). A binary plant vector strategy based on separation of vir and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid, Nature, 303: 179-180. 44. Hooykaas G. M. S., Van Slogteren, Hooykaas P. J. J. and Schilperoort R. A. (1984). Expression of Ti plasmid genes in monocotyledonous plants infected with Agrobacterium tumefaciens, Nature, 311: 763-764. 45. James Clive (2007). Hiện trạng trồng công nghệ sinh học/cây trồng chuyển gen ñã ñược thương mại hóa toàn giới, Báo cáo tóm tắt ISAAA, 37. 46. James Clive (2008). Tình trạng trồng công nghệ sinh học/cây chuyển gen (GM) ñược ñưa vào thương mại hoá toàn cầu năm 2008, Báo cáo tóm tắt, 39. 47. James Clive (2013). Hiện trạng trồng công nghệ sinh học/cây trồng chuyển gen ñược thương mại hoá toàn cầu năm 2013, Báo cáo tóm tắt, 46. 48. Jeong G. T., Part D. H., Hwang B., Park K., Kim S. W., Woo J. C. (2002). Studies on mass production of transformed Panax ginseng hairy roots in bioreactor, Applied Biochemistry and Biotechnology, 98: 1115-1127. 49. Khan M. M. A., Robin A. B. M. A. H. K., Nazimuddowla M. A. N., Talukder S. K. and Hassan L. (2009). Agrobacterium mediated genetic transfomation of two varieties of Brassica: optimization of protocol, Bangladesh J. Agril, Res, 34(2): 287-301. 50. Kurata H., Achioku T., Okuda N. and Furusaki S. (1998). Intermittent light irradiation with second-scale interval enhances caffeine production by coffea Arabica cells, Biotechnology prog, 14(5): 797-799. 51. Li D. D. Shi W., Deng X. X. (2003). Factors influencing Agrobacterium-mediated embryogenic callus transformation of Valencia sweet orange (Citrus sinensis) containing the pTA29-barnase gene, Tree Physiology, 23: 1209-1215. 52. Michael Patrick S. (2011). Effects of coconut water on callus initiation and plant regeneration potentials of sweetpotato, Journal and Proceedings of the Royal Society of New South Wales, 144: 91-101. 53. Mohammad Alimohammadi and Mohammad B. Bagherieh-Najjar (2009). Agrobacterium-mediated transformation of plants: Basic principles and influencing Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 77 factors, African Journal of Biotechnology, 8(20): 5142-5148. 54. Muller MJ. and Zenk MH. (1992). The norcoclaurine pathway is operative in berberine biosynthesis in Coptis japonica, Planta Med, 58(6): 524-527. 55. Murthy H.N, E.J. Hahn and Paek K.Y. (2008). Adventitious Roots and Secondary Metabolism, Chinese J. Biotechnology, 24(5): 711. 56. Duong Tan Nhut, Vu Quoc Luan, Nguyen Vang Binh, Pham Thanh Phong, Bui Ngoc Huy, Dang Thi Ngoc Ha, Phan Quoc Tam, Nguyen Ba Nam, Vu Thi Hien, Bui The Vinh, Lam Thi My Hang, Duong Thi Mong Ngoc, Lam Bich Thao, Tran Cong Luan (2009). The effect of some factor on in vitro biomass production of Vietnamese ginseng (Panax vietmamensis Ha et Grushv.) and preliminary analysis of saponin content, Journal of Biotechnology, 7(3): 357-370. 57. Nguyen MD, Nguyen TN, Kasai R, Ito A, K Yamasaki and Tanaka O (1993). Saponins from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv. Collected in central Vietnam. I, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 41(11): 2010-2014. 58. Nguyen MD, Kasai R, K Ohtani, Ito A, Nguyen TN, Yamasaki K and Tanaka O (1994). Saponins from Vietnamese Ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv. Collected in central Vietnam. II, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 42(1): 115-122. 59. Nguyen Trung Thanh, Nguyen Van Ket and Paek Kee Yoeup (2007). Effecting of medium composition on biomass and ginsenoside production in cell suspension culture of Panax vietnamensis Ha et Grushv, VNU Journal of Science Natural Sciences and Technology, 23: 269-274. 60. Piqueras A., Alburquerque N., and Folta K. M. (2010). Explants used for the generation of transgenic plants, Transgenic Crop Plants, 1:31-56 61. Pistelli Laura, Giovannini Annalisa, Ruffoni Barbara, Bertoli Alessandra and Pistelli Luisa (2010). Hairy root cultures for secondary metabolites production, Bio farm for Nutraceuticals, 698: 167-185. 62. Pham N. B (2009). Production and secrecion of recombinant sweet-tasting thaumatin from suspension cells and hairy root of Nicotiana tabacum, PhD Thesis, University of Heidelberg. 63. Qing Zhao, Ji Jing, Gang Wang, Jie Hua Wang, Yuan Yuan Feng, Han Wen Xing and Chun Feng Guan (2010). Optimization in Agrobacterium-mediated Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 78 transformation of Anthurium andraeanum using GFP as a reporter, Electronic Journal of Biotechnology, 13(5): 1-12. 64. Schmulling T, Schell J and Spena A (1988). Single genes from Agrobacterium rhizogenes influence plant development, The EMBOJ, 7(9): 2621-2629. 65. Schmulling T, Fladung M, Grossmann K, Schell J (1993). Hormonal content and sensitivity of transgenic tobacco and potato plants expressing single rol genes of Agrobacterium rhizogenes T-DNA, Plant J, 3: 371-382. 66. Scorza R, Zimmerman T.W, Cordts J.M, and Footen K.J (1994). Horticultural Characteristics of Transgenic Tobacco Expressing the rolC Gene from Agrobacterium rhizogenes, J. AMER. SOC. HORT. SCI, 119(5): 1091-1098. 67. Sevon N. and Oksman-Caldentey KM. (2002). Agrobacterium rhizogenes – mediated transformation: root cultures as a source of alkaloids, Planta Med, 68(10): 859-868. 68. Sharmila R. and Subburathinam K.M. (2013). Effect of signal compounds on andrographolide in the hairy root cultures of andrographis paniculata, IJPSR, 4(5): 1773-1776. 69. Sheikholeslam S. N. (1987). Acetosyringone promotes high efficiency transformation of Arabidopsis thaliana explants by Agrobacterium tumefaciens, Plant Molecular Biology, 8(4): 291-298. 70. Shekarriz Parisa, Kafi Mohsen, Deilamy Shirin Dianati and Mirmasoumi Masoud (2014). Coconut water and peptone improve seed germination and protocorm like body formation of hybrid Phalaenopsis, Agric. sci. dev., 3(10): 317-322. 71. Stachel Scott E., Eric Messens, Marc Van Montagu and Patricia Zambryski (1985). Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens, Nature, 318: 624-629. 72. Sureerat Yenchon and Sompong Techato (2012). Effect of bacteria density, inoculation and co-cultivation period on Agrobacterium-mediated transformation of oil palm embryogenic callus, Journal of Agricultural Technology, 8(4): 14851496. 73. Tang Wei (2001). Agrobacterium-mediated transformation and assessment of factors influencing transgene expression in loblolly pine (Pinus taeda L.), Cell Research, 11: 237-243. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 79 74. Thanh, N. T., Anh, H. T., Yoeup, P. K. (2011). Effects of macro elements on biomass and ginsenoside production in cell suspension culture of Ngoc Linh ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), VNU Journal of Science, Natural Sciences and Technology, 24: 248-252. 75. Tomy Michael and Angelo Spena (1995). The Plant Oncogenes rolA, B, and C from Agrobacterium rhizogenes, Methods in Molecular Biology, 44: 207-222. 76. Trick H. N., Finer J. J. (1997). Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation of soybean (Glycine max (L.) Merrill) embryogenic suspension culture tissue, Plant Cell Reports, 17(6+7): 482-488. 77. Tripathi R. M., Bish H. S. and Singh R. P. (2010). Effect of acetosyringone and callus age on transfomation for scutellum-deived callus of rice, International Journal of Pharma and Bio Sciences, 1(4): 163-171. 78. Wahyu Widoretno, Ratna Perwitasari, Estri Laras Arumingtyas, Edi Priyo Utomo and Tatik Wardiati (2012). Genetic transformation of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) with Agrobacterium rhizogenes and production of lycopene in transformed root culture, International Research Journal of Biotechnology, 3(9): 158-165. 79. White FF, Taylor BH, Huffman GA, Gordon MP, Nester EW (1985). Molecular and genetic analysis of the transferred DNA regions of the rootinducing plasmid of Agrobacterium rhizogenes, J Bacteriol, 164: 33-44. 80. Woo SS, Song JS, Lee JY, In DS, Chung HJ, Liu JR and Choi DW (2004). Selection of high ginsenoside producing ginseng hairy root lines using targeted metabolic analysis, Phytochemistry, 65(20): 2751-2761. 81. Yadav S. K., Katikala S., Yellisetty V., Kannepalle A., Narayana J. L., Maddi V., Mandapaka M., Shanker A. K., Bandi V. and Bharadwaja K. P. (2012). Optimization of Agrobacterium mediated genetic transformation of cotyledonary node explants of Vigna radiata, Springerplus, 1(1): 1-59. 82. Nicola Zdena Koukolíková, Raymond Shillito D., Barbara Hohn, Kan Wang, Marc Van Montagu and Patricia Zembryski (1985). Involvement of circular intermediates in the transfer of T-DNA from Agrobacterium tumefaciens to plant cells, Nature, 313: 191-196. 83. Zhang F. L., Takahata Y., Watanabe M., Xu J. B. (2000). Agrobacterium- Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 80 mediated transformation of cotyledonary explants of Chinese cabbage (Brassica campestris L. ssp. pekinensis), Plant Cell Reports, 19(6): 569-575. Tài liệu internet 84. Shakti Mehrotra (2007). Genetic transformation studies and scale up of hairy root culture of Glycyrrhiza glabra in bioreactor. Truy cập ngày 10/12/2014 http://www.ejbiotechnology.cl/content/vol11/issue2 /full/6/f4.html 85. Anonymous (2010). Molecular and Developmental Genetics. Truy cập ngày 10/12/2014 từ http://science.leidenuniv.nl/index.php/ibl/mdg/profile Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 81 PHỤ LỤC Thành phần môi trường YMB – Yeast Manitol Broth Yeast extract 0,4g/l K2HPO4.3H2O 0,5 g/l 10 g/l Manitol g/l MgSO4.7H2O 0,1 g/l NaCl pH 15 g/l cho môi trường YMB ñặc Bacto agar Thành phần môi trường SH (Schenk & Hildebrandt, 1972) KNO3 250 g/l 30 g/l NH4H2PO4 15,1 g/l CaCl2.2H2O 19,5 g/l MgSO4.7H2O 100 mg/l KI 500 mg/l H3BO3 1000 mg/l MnSO4.H2O 100 mg/l ZnSO4.7H2O 10 mg/l Na2MoO4.2H2O 20 mg/l 10 mg/l CuSO4.5H2O g/l CoCl2.6H2O 1,5 g/l Na2EDTA 100 g/l FeSO4.7H2O 500 mg/l myo-Inositol 500 mg/l Thiamine HCl 50 mg/l Nicotinic acid Pyridoxine HCl Dung dịch nhuộm X-gluc Thành phần 1ml dịch nhuộm Tris/NaCl 890 µl X-gluc 100 µl Triton X-100 10µl Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 82 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH PHƯƠNG SAI BALANCED ANOVA FOR VARIATE GUS FILE MAUGUS 2/ 8/14 16:42 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA NGUON MAU TOI TY LE MAU BAT MAU VARIATE V003 GUS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NLAI 24.6667 12.3333 22.20 0.002 MAU$ 32.6667 10.8889 19.60 0.002 * RESIDUAL 3.33333 .555555 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 11 60.6667 5.51515 ----------------------------------------------------------------------------TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE MAUGUS 2/ 8/14 16:42 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA NGUON MAU TOI TY LE MAU BAT MAU MEANS FOR EFFECT NLAI ------------------------------------------------------------------------------NLAI NOS GUS 10.0000 11.5000 13.5000 SE(N= 4) 0.372678 5%LSD 6DF 1.28915 ------------------------------------------------------------------------------MEANS FOR EFFECT MAU$ ------------------------------------------------------------------------------MAU$ NOS GUS M1 13.3333 M2 12.6667 M3 9.00000 M4 11.6667 SE(N= 3) 0.430331 5%LSD 6DF 1.48858 ------------------------------------------------------------------------------ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE MAUGUS 2/ 8/14 16:42 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA NGUON MAU TOI TY LE MAU BAT MAU F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI |MAU$ | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | GUS 12 11.667 2.3484 0.74536 4.8 0.0021 0.0000 BALANCED ANOVA FOR VARIATE RARE FILE MAURARE 2/ 8/14 16:48 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA NGUON MAU TOI TY LE RA RE VARIATE V003 RARE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NLAI 2.16667 1.08333 1.11 0.389 MAU$ 3891.67 1297.22 ****** 0.035 * RESIDUAL 5.83350 .972251 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 11 3899.67 354.515 ----------------------------------------------------------------------------TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE MAURARE 2/ 8/14 16:48 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA NGUON MAU TOI TY LE RA RE MEANS FOR EFFECT NLAI ------------------------------------------------------------------------------NLAI NOS RARE 17.2500 18.0000 18.2500 SE(N= 4) 0.493014 5%LSD 6DF 1.70541 ------------------------------------------------------------------------------MEANS FOR EFFECT MAU$ ------------------------------------------------------------------------------MAU$ NOS RARE Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 83 M1 M2 M3 M4 3 3 0.000000 0.666667 29.3333 41.3333 SE(N= 3) 0.569283 5%LSD 6DF 1.96924 ------------------------------------------------------------------------------ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE MAURARE 2/ 8/14 16:48 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA NGUON MAU TOI TY LE RA RE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI |MAU$ | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | RARE 12 17.833 18.829 0.98603 4.5 0.3891 0.0000 BALANCED ANOVA FOR VARIATE GUS FILE ASGUS 2/8/14 13: ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA NONG DO AS TOI TY LE NHUOM GUS VARIATE V003 GUS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NLAI 25.7333 12.8667 24.13 0.001 AS$ 93.3334 23.3333 43.75 0.004 * RESIDUAL 4.26664 .533331 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 14 123.333 8.80952 ----------------------------------------------------------------------------TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE ASGUS 2/8/14 13: ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA NONG DO AS TOI TY LE NHUOM GUS MEANS FOR EFFECT NLAI ------------------------------------------------------------------------------NLAI NOS GUS 10.8000 12.2000 14.0000 SE(N= 5) 0.326598 5%LSD 8DF 1.06500 ------------------------------------------------------------------------------MEANS FOR EFFECT AS$ -----------------------------------------------------------------------------AS$ NOS GUS A1 8.66667 A2 10.0000 A3 14.6667 A4 14.0000 A5 14.3333 SE(N= 3) 0.421636 5%LSD 8DF 1.37491 ------------------------------------------------------------------------------ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE ASGUS 2/8/14 13: ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA NONG DO AS TOI TY LE NHUOM GUS F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI |AS$ | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | GUS 15 12.333 2.9681 0.73029 4.4 0.0005 0.0000 BALANCED ANOVA FOR VARIATE RARE FILE ASRARE 2/8/14 13:10 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA NONG DO AS TOI TY LE RA RE TO VARIATE V003 RARE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NLAI 14.4000 7.20000 61.72 0.015 AS$ 192.267 48.0667 412.01 0.006 * RESIDUAL .933306 .116663 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 14 207.600 14.8286 ----------------------------------------------------------------------------TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE ASRARE 2/8/14 13:10 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA NONG DO AS TOI TY LE RA RE TO MEANS FOR EFFECT NLAI Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 84 ------------------------------------------------------------------------------NLAI NOS RARE 24.2000 25.4000 26.6000 SE(N= 5) 0.152750 5%LSD 8DF 0.498103 ------------------------------------------------------------------------------MEANS FOR EFFECT AS$ ------------------------------------------------------------------------------AS$ NOS RARE A1 19.0000 A2 26.0000 A3 30.0000 A4 26.6667 A5 25.3333 SE(N= 3) 0.197200 5%LSD 8DF 1.164309 ------------------------------------------------------------------------------ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE ASRARE 2/8/14 13:10 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA NONG DO AS TOI TY LE RA RE TO F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI |AS$ | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | RARE 15 25.400 3.8508 0.34156 2.8 0.0002 0.0000 BALANCED ANOVA FOR VARIATE GUS FILE NHIEMGUS 2/ 8/14 17:15 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA THOI GIAN LAY NHIEM TOI TY LE MAU BAT MAU GUS VARIATE V003 GUS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NLAI 13.5556 6.77778 15.25 0.015 LAYNHIEM$ 60.2222 30.1111 67.75 0.002 * RESIDUAL 1.77777 .444442 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 75.5556 9.44444 ----------------------------------------------------------------------------TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE NHIEMGUS 2/ 8/14 17:15 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA THOI GIAN LAY NHIEM TOI TY LE MAU BAT MAU GUS MEANS FOR EFFECT NLAI ------------------------------------------------------------------------------NLAI NOS GUS 11.3333 12.6667 3 14.3333 SE(N= 3) 0.384899 5%LSD 4DF 1.50872 ------------------------------------------------------------------------------MEANS FOR EFFECT LAYNHIEM$ ------------------------------------------------------------------------------LAYNHIEM$ NOS GUS N1 9.66667 N2 12.6667 N3 16.0000 SE(N= 3) 0.384899 5%LSD 4DF 1.50872 ------------------------------------------------------------------------------ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE NHIEMGUS 2/ 8/14 17:15 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA THOI GIAN LAY NHIEM TOI TY LE MAU BAT MAU GUS F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI |LAYNHIEM| (N= 9) -------------------- SD/MEAN | |$ | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | GUS 12.778 3.0732 0.66666 5.2 0.0154 0.0000 BALANCED ANOVA FOR VARIATE RARE FILE NHIEM 2/ 8/14 17:22 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA THOI GIAN LAY NHIEM TOI TY LE RA RE VARIATE V003 RARE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 85 ============================================================================= NLAI 13.5556 6.77778 15.25 0.015 LAYNHIEM$ 309.556 154.778 348.25 0.021 * RESIDUAL 1.77776 .444440 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 324.889 40.6111 ----------------------------------------------------------------------------TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE NHIEM 2/ 8/14 17:22 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA THOI GIAN LAY NHIEM TOI TY LE RA RE MEANS FOR EFFECT NLAI ------------------------------------------------------------------------------NLAI NOS RARE 21.3333 23.0000 3 24.3333 SE(N= 3) 0.384898 5%LSD 4DF 1.50872 ------------------------------------------------------------------------------MEANS FOR EFFECT LAYNHIEM$ ------------------------------------------------------------------------------LAYNHIEM$ NOS RARE N1 31.0000 N2 20.3333 N3 17.3333 SE(N= 3) 0.384898 5%LSD 4DF 1.50872 ------------------------------------------------------------------------------ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE NHIEM 2/ 8/14 17:22 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA THOI GIAN LAY NHIEM TOI TY LE RA RE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI |LAYNHIEM| (N= 9) -------------------- SD/MEAN | |$ | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | RARE 22.889 6.3727 0.66666 2.9 0.0154 0.0000 BALANCED ANOVA FOR VARIATE GUS FILE DNCGUS 2/ 8/14 21:11 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA THOI GIAN DONG NUOI CAY TOI TY LE MAU BAT MAU VARIATE V003 GUS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NLAI 16.8889 8.44444 76.00 0.002 DNC$ 113.556 56.7778 511.00 0.005 * RESIDUAL .444446 .111111 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 130.889 16.3611 ----------------------------------------------------------------------------TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE DNCGUS 2/ 8/14 21:11 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA THOI GIAN DONG NUOI CAY TOI TY LE MAU BAT MAU MEANS FOR EFFECT NLAI ------------------------------------------------------------------------------NLAI NOS GUS 11.3333 12.6667 3 14.6667 SE(N= 3) 0.192450 5%LSD 4DF 0.754364 ------------------------------------------------------------------------------MEANS FOR EFFECT DNC$ ------------------------------------------------------------------------------DNC$ NOS GUS D1 8.00000 D2 14.3333 D3 16.3333 SE(N= 3) 0.192450 5%LSD 4DF 0.754364 ------------------------------------------------------------------------------ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE DNCGUS 2/ 8/14 21:11 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA THOI GIAN DONG NUOI CAY TOI TY LE MAU BAT MAU F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI |DNC$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 86 OBS. TOTAL SS RESID SS | | | GUS 12.889 4.0449 0.33333 2.6 0.0016 0.0000 BALANCED ANOVA FOR VARIATE RARE FILE DNCRARE 4/8/14 20:54 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA THOI GIAN DONG NUOI CAY TOI TY LE RA RE VARIATE V003 RARE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NLAI 10.8889 5.44444 8.91 0.035 DNC$ 1403.56 701.778 ****** 0.002 * RESIDUAL 2.44456 .611139 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 1416.89 177.111 ----------------------------------------------------------------------------TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE DNCRARE 4/8/14 20:54 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA THOI GIAN DONG NUOI CAY TOI TY LE RA RE MEANS FOR EFFECT NLAI ------------------------------------------------------------------------------NLAI NOS RARE 21.3333 21.3333 3 23.6667 SE(N= 3) 0.451346 5%LSD 4DF 1.76918 ------------------------------------------------------------------------------MEANS FOR EFFECT DNC$ ------------------------------------------------------------------------------DNC$ NOS RARE D1 11.6667 D2 39.6667 D3 15.0000 SE(N= 3) 0.451346 5%LSD 4DF 1.76918 ------------------------------------------------------------------------------ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE DNCRARE 4/8/14 20:54 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA THOI GIAN DONG NUOI CAY TOI TY LE RA RE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI |DNC$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | RARE 22.111 13.308 0.78175 3.5 0.0354 0.0000 BALANCED ANOVA FOR VARIATE GUS FILE ODGUS 2/ 8/14 16:58 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA GIA TRI OD TOI TY LE MAU BAT MAU VARIATE V003 GUS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NLAI 12.5000 6.25000 10.71 0.011 OD$ 106.250 35.4167 60.71 0.004 * RESIDUAL 3.49999 .583332 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 11 122.250 11.1136 ----------------------------------------------------------------------------TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE ODGUS 2/ 8/14 16:58 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA GIA TRI OD TOI TY LE MAU BAT MAU MEANS FOR EFFECT NLAI ------------------------------------------------------------------------------NLAI NOS GUS 12.0000 13.2500 14.5000 SE(N= 4) 0.381881 5%LSD 6DF 1.32099 ------------------------------------------------------------------------------MEANS FOR EFFECT OD$ ------------------------------------------------------------------------------OD$ NOS GUS OD1 8.33333 OD2 16.3333 OD3 14.3333 OD4 14.0000 SE(N= 3) 0.440958 5%LSD 6DF 1.52534 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 87 ------------------------------------------------------------------------------ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE ODGUS 2/ 8/14 16:58 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA GIA TRI OD TOI TY LE MAU BAT MAU F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI |OD$ | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | GUS 12 13.250 3.3337 0.76376 5.1 0.0111 0.0000 BALANCED ANOVA FOR VARIATE RARE FILE ODRARE 2/ 8/14 16:51 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA GIA TRI OD DEN TY LE RA RE TO VARIATE V003 RARE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NLAI 3.16667 1.58333 11.40 0.010 OD$ 1185.67 395.222 ****** 0.001 * RESIDUAL .833376 .138896 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 11 1189.67 108.152 ----------------------------------------------------------------------------TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE ODRARE 2/ 8/14 16:51 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA GIA TRI OD DEN TY LE RA RE TO MEANS FOR EFFECT NLAI ------------------------------------------------------------------------------NLAI NOS RARE 21.2500 21.7500 22.5000 SE(N= 4) 0.186344 5%LSD 6DF 0.644593 ------------------------------------------------------------------------------MEANS FOR EFFECT OD$ ------------------------------------------------------------------------------OD$ NOS RARE OD1 17.3333 OD2 39.0000 OD3 15.6667 OD4 15.3333 SE(N= 3) 0.215171 5%LSD 6DF 1.744312 ------------------------------------------------------------------------------ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE ODRARE 2/ 8/14 16:51 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA GIA TRI OD DEN TY LE RA RE TO F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI |OD$ | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | RARE 12 21.833 10.400 0.37269 2.7 0.0097 0.0000 BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLUONG FILE NUOCDUA 7/ 8/14 16: ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA NUOC DUA TOI KHOI LUONG RE TO VARIATE V003 KLUONG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NLAI .968933E-01 .484467E-01 23.29 0.001 CT$ .885040 .221260 106.38 0.005 * RESIDUAL .166400E-01 .207999E-02 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 14 .998573 .713267E-01 ----------------------------------------------------------------------------TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE NUOCDUA 7/ 8/14 16: ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA NUOC DUA TOI KHOI LUONG RE TO MEANS FOR EFFECT NLAI ------------------------------------------------------------------------------NLAI NOS KLUONG 1.44200 1.55600 1.63800 SE(N= 5) 0.203961E-01 5%LSD 8DF 0.665095E-01 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 88 ------------------------------------------------------------------------------MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------CT$ NOS KLUONG DC 1.06333 CW1 1.63333 CW2 1.63667 CW3 1.71667 CW4 1.67667 SE(N= 3) 0.263312E-01 5%LSD 8DF 0.788633E-01 ------------------------------------------------------------------------------ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE NUOCDUA 7/ 8/14 16: ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA NUOC DUA TOI KHOI LUONG RE TO F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI |CT$ | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | KLUONG 15 1.5453 0.26707 0.45607E-01 3.0 0.0006 0.0000 BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLUONG FILE CASAMINO 7/ 8/14 16:50 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA CASAMINO ACID TOI SINH TRUONG CUA RE TO VARIATE V003 KLUONG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NLAI .609600E-01 .304800E-01 13.77 0.003 CT$ 1.01889 .254723 115.09 0.002 * RESIDUAL .177066E-01 .221333E-02 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 14 1.09756 .783971E-01 ----------------------------------------------------------------------------TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE CASAMINO 7/ 8/14 16:50 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA CASAMINO ACID TOI SINH TRUONG CUA RE TO MEANS FOR EFFECT NLAI ------------------------------------------------------------------------------NLAI NOS KLUONG 1.45000 1.52200 1.60600 SE(N= 5) 0.210396E-01 5%LSD 8DF 0.686081E-01 -----------------------------------------------------------------------------MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------CT$ NOS KLUONG DC 1.06333 CH1 1.53000 CH2 1.48667 CH3 1.77333 CH4 1.77667 SE(N= 3) 0.271620E-01 5%LSD 8DF 0.755726E-01 ------------------------------------------------------------------------------ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE CASAMINO 7/ 8/14 16:50 ------------------------------------------------------------------ :PAGE ANH HUONG CUA CASAMINO ACID TOI SINH TRUONG CUA RE TO F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI |CT$ | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | KLUONG 15 1.5260 0.27999 0.47046E-01 2.7 0.0028 0.0000 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 89 [...]... th c t trên tôi ti n hành nghiên c u ñ tài Nghiên c u kh o sát ñi u ki n chuy n gen t o r rhizogenes tơ thông qua vi khu n Agrobacterium sâm Ng c linh (Panax Vietnamensis Ha et Grushv) 1.2 M c ñích Xác ñ nh kh năng chuy n gen vào sâm Ng c Linh và ñi u ki n chuy n gen thích h p cho t o r tơ thông qua vi khu n Agrobacterium rhizogenes sâm Ng c Linh (Panax Vietnamensis Ha et Grushv) Bư c ñ u xác ñ nh... tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rubi Trong ñó hai loài Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes ñư c nghiên c u nhi u nh t Hình 1.3 Vi khu n Agrobacterium sp, r tơ do vi khu n Agrobacterium rhizogenes gây ra Vi khu n ñ t gram âm A .rhizogenes, gây b nh r tơ th c v t hai lá m m Gi ng như vi khu n A.tumefaciens mang Ti-plasmid, A .rhizogenes mang... ph m, H c vi n Nông nghi p Vi t Nam – Lu n văn Th c s Khoa h c Nông nghi p Page 4 Chương 1: T NG QUAN TÀI LI U 1.1 Cây sâm Ng c Linh 1.1.1 Phân loài Sâm Ng c Linh (danh pháp hai ph n: Panax Vietnamensis) là m t loài cây thu c h Cam tùng (Araliaceae), còn g i là sâm Vi t Nam, sâm Khu Năm (sâm K5), sâm trúc (sâm ñ t trúc, trúc ti t nhân sâm) , sâm cung, sâm ñ ng, sâm r ng, c ng i r m con hay cây thu... Phương pháp chuy n gen gián ti p - Chuy n gen nh virus - Chuy n gen nh vi khu n Agrobacterium 1.3 Chuy n gen nh vi khu n Agrobacterium rhizogenes Chuy n gen nh vi khu n Agrobacterium ñư c nghiên c u t nh ng năm 1960 - 1970 Vi c phát hi n ra Agobacterium tumefaciens (A.tumefaciens) có kh năng chuy n gen vào th c v t vào ñ u nh ng năm 1980 ñã bi n loài này tr thành m t trong nh ng công c quan tr ng nh t... u nghiên c u v cây sâm Ng c Linh, nghiên c u v tác d ng dư c lý c a sâm Ng c Linh, thành ph n môi trư ng, thành ph n hóa h c trong sâm nuôi c y in vitro tuy nhiên các nghiên c u v chuy n gen t o r tơ sâm Ng c Linh ñ thu h p ch t th c p v n còn h n ch H c vi n Nông nghi p Vi t Nam – Lu n văn Th c s Khoa h c Nông nghi p Page 12 1.2 Tình hình nghiên c u v cây chuy n gen 1.2.1 Khái ni m cây chuy n gen. .. b sung acetosyringone (Nguy n Quang Th ch và cs., 2005) 1.3.1 Vi khu n Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium là các loài vi khu n ñ t, thu c nhóm Gram (-), y m khí, xâm nh p qua v t thương, các loài vi khu n nay gây b nh u r hay b nh r tơ Agrobacterium thu c: Gi i Bacteria Nghành: Proteobacteria L p: Alpha Proteobacteria B : Rhizobiales H : Rhizobiaceae Chi: Agrobacterium Có 4 loài chính Agrobacterium. .. các nghiên c u t o r tơ th c v t (Sevon and Oksman, 2002) 1.3.2 Cơ ch chuy n gen Cơ ch gây b nh kh i u c a vi khu n A.tumefaciens và r tơ c a vi khu n A .rhizogenes là tương t nhau Khi t bào th c v t b thương ti t ra các polyphenol: acetonsyringone và hydrocyacetonsyringone thu hút các vi khu n t p trung vào vùng v t thương, ñ ng th i chúng cũng ho t hóa các gen vùng vir ho t ñ ng Gen c a vùng vir có... thương xuyên qua màng t bào ñ vào t bào Agrobacterium Sau khi vào t bào vi khu n AS ho t ñ ng như m t nhân t ho t hóa gen vùng vir Protein virA t phosphoryl hóa r i sau ñó phosphoryl hóa protein virG Các tín hi u hóa h c này s ñư c d n truy n t protein virA sang protein virG S n ph m c a protein virG ti p t c làm ho t hóa toàn b các gen vir còn l i mà hai gen ñư c ho t hóa cu i cùng là virB và virE (Schmulling... c (Pham, 2009) R tơ có th s n xu t m t lư ng l n các h p ch t th c p và là cơ quan bi t hóa nên r tơ có s di truy n n ñ nh hơn nuôi c y t bào huy n phù và mô s o (Woo et al., 2004) 1.4.2 Nuôi c y sinh kh i r tơ R tơ do vi khu n Agrobacterium rhizogenes gây ra cây hai lá m m S lư ng các r tơ ñư c t o ra khá nhi u, phát tri n thành m t h th ng lông r , hay còn g i là h th ng r tơ Trong t nhiên, r tơ có... 3 gen rol trên, gen rolB ñóng vai trò quan tr ng nh t, gen rolB ñư c tìm th y h u h t trong các Ri plasmid và g n 60% gen ñã ñư c nh n d ng gi a các ch ng A .rhizogenes khác nhau Khi gen rolB ñư c bi u hi n, mô t bào th c v t ñã c m ng t o ki u hình r tơ, trong khi ñó khi b t ho t gen rolB không t o ñư c ki u hình r tơ Trong m t s loài th c v t ch mình gen rolB bi u hi n cũng t o ra r tơ (Britton et . kiện chuyển gen tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ở sâm Ngọc linh (Panax Vietnamensis Ha et Grushv) . 1.2. Mục ñích Xác định khả năng chuyển gen vào sâm Ngọc Linh và điều kiện. hưởng của mật độ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes đến hiệu quả chuyển gen 52 3.1.6. Kết quả chuyển gen ở sâm Ngọc Linh thông qua vi khuẩn A .Rhizogenes 53 3.2. Chuyển gen tạo rễ tơ thông qua. kiện chuyển gen thích hợp cho tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ở sâm Ngọc Linh (Panax Vietnamensis Ha et Grushv). Bước đầu xác định môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng