bước đầu nghiên cứu chuyển gen ipt (isopentenyl transferase) vào mô sẹo sâm ngọc linh (panax vietnamensis ha et grushv )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Tạ Thị Diễm Thu BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN IPT (ISOPENTENYL TRANSFERASE) VÀO MÔ SẸO SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Tạ Thị Diễm Thu BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN IPT (ISOPENTENYL TRANSFERASE) VÀO MÔ SẸO SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) Chuyên ngành : Sinh Học Thực Nghiệm Mã số : 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS NGUYỄN HỮU HỔ Thành phố Hồ Chí Minh – 2011 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tôi.Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình TẠ THỊ DIỄM THU LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực đề tài, nhận quan tâm, giúp đỡ nhiều cá nhân tập thể Luận văn hoàn thành, lúc có hội bày tỏ lòng biết ơn chân thành: TS Nguyễn Hữu Hổ- Thầy hướng dẫn, động viên từ ngày bắt đầu lúc hoàn thành đề tài Thầy truyền đạt cho nhiều kinh nghiệm, đồng thời Thầy giúp có tính nhẫn nại, kiên trì lòng tâm huyết lĩnh vực nghiên cứu Thầy Lê Tấn Đức- tận tình dẫn, hỗ trợ kinh nghiệm phương pháp nghiên cứu để hoàn thành tốt luận văn Các Thầy, Cô khoa Sinh, trường Đại học Sư phạm TP.HCM truyền đạt tri thức hướng dẫn suốt khóa học Các anh chị, bạn bè làm việc thực tập phòng Công Nghệ Gen, Viện Sinh học Nhiệt đới chia sẻ, giúp đỡ thời gian làm việc Ba Mẹ, anh chị hỗ trợ, động viên thời gian thực luận văn Ban Giám Hiệu đồng nghiệp trường THPT Nguyễn Thái Bình (Tây Ninh) tạo điều kiện tốt cho chuyên tâm vào việc nghiên cứu hoàn thành luận văn Tất bạn giúp đỡ, đóng góp ý kiến, chia sẻ động viên thời gian làm luận văn, công việc sống Tạ Thị Diễm Thu MỤC LỤC Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU CHI PANAX 1.1.1 Đặc điểm 1.1.2 Phân bố 1.1.3 Phân loại 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Tác dụng sâm 1.2 SÂM NGỌC LINH 1.2.1 Nguồn gốc lịch sử phát 1.2.2 Đặc điểm sinh học phân bố 10 1.2.3 Phân bố 12 1.2.4 Thành phần hóa học 12 1.2.5 Tác dụng dược lý sâm Ngọc Linh 18 1.3 PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT NHỜ VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS (A TUMEFACIENS) 21 1.3.1 Vi khuẩn A tumefaciens 22 1.3.2 Ti-plasmid A tumefaciens 23 1.3.3 Cơ chế biến nạp T–DNA vào tế bào ký chủ 25 1.3.4 Ứng dụng vi khuẩn A tumefaciens chuyển gen thực vật 28 1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN SAU KHI CHUYỂN VÀO TẾ BÀO THỰC VẬT 29 1.4.1 Phương pháp thử in vitro khả kháng kháng sinh mô chuyển gen 29 1.4.2 Phương pháp hóa mô tế bào (Phương pháp thử GUS) 30 1.4.3 Phương pháp PCR (Polimerase Chain Reaction) 30 1.5 GEN IPT (ISOPENTENYL TRANSFERASE) 32 1.5.1 Một số nghiên cứu chuyển gen ipt 32 1.5.2 Cơ chế tác dụng gen ipt 33 1.6 NUÔI CẤY TẾ BÀO – SẢN XUẤT HỢP CHẤT THỨ CẤP 34 1.6.1 Hợp chất thứ cấp nuôi cấy tế bào 34 1.6.2 Quy trình nuôi cấy tế bào sản xuất hợp chất thứ cấp 35 1.6.3 Một số phương pháp tăng hiệu sản xuất hợp chất thứ cấp nuôi cấy mô, tế bào 36 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 38 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 38 2.1.1 Mẫu cấy 38 2.1.2 Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 38 2.1.3 Enzyme cắt giới hạn 39 2.1.4 Mồi thang chuẩn 39 2.1.5 Hóa chất, thiết bị dụng cụ thí nghiệm 40 2.1.6 Môi trường điều kiện nuôi cấy 43 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44 2.2.1 Thí nghiệm nuôi cấy mô 44 2.2.2 Thí nghiệm chuyển gen 46 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54 3.1 THÍ NGHIỆM VỀ NUÔI CẤY MÔ 54 3.1.1 Tạo mô sẹo từ sâm ex vitro cuống sâm in vitro 54 3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng kết hợp 2,4-D TDZ đến khả tăng sinh khối mô sẹo sâm 55 3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng NAA BA lên tái sinh chồi từ mô sẹo sâm 58 3.2 THÍ NGHIỆM CHUYỂN GEN 66 3.2.1 Khảo sát nồng độ hygromycin thích hợp cho thí nghiệm chuyển gen 66 3.2.2 Chuyển gen vào mô sẹo sâm Ngọc Linh nhờ vi khuẩn A tumefaciens 68 3.2.3 Kiểm tra diện/biểu gen chuyển 73 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO 80 PHỤ LỤC T T T T3 T T DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D: 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid BA: 6-Benzylaminopurin bp: Base pair cs.: Cộng dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate DNA: Deoxyribonucleic acid EDTA: Ethylenediamine tetraacetic acid EtBr: Ethidium bromide gus A: Gen tạo enzyme β-D-glucuronidase GUS: Enzyme β-D-glucuronidase hpt: Gen tạo enzyme hygromycin phosphotransferase HPT: Enzyme hygromycin phosphotransferase ipt: Gen tạo enzyme isopentenyl transferase IPT: Enzyme isopentenyl transferase kD: Kilodalton MS: Môi trường Murashige and Skoog RNA: Ribonucleic acid SH: Môi trường Schenk Hidebrandt PCR: Polymerase chain reaction pVDH396: Plasmid pVDH396 SAG: Senescence-associated gene SAG 12 -IPT: Promoter SAG 12 -IPT Taq: Thermus aquaticus TDZ: Thidiazuron Ti: Tumor-inducing X-gluc: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide Vir: Gen gây độc (Virulence) R R R R DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Hệ thống phân loại loài thuộc chi Panax châu Á giới Bảng 1.2 Hàm lượng số saponin sâm (đã trừ độ ẩm) 13 Bảng 1.3 Hàm lượng saponin sâm Ngọc Linh so với loài Panax 13 Bảng 1.4 Các saponin yếu thành phần saponin dẫn chất protopanaxatriol 14 Bảng 1.5 Acid Oleanolic 14 Bảng 1.6 Ocotillol 14 Bảng 1.7 Các axid béo tìm thấy 15 Bảng 1.8 Thành phần acid amin chủ yếu 16 Bảng 1.9 Các nguyên tố vi lượng 17 Bảng 1.10 Vai trò gen vir 25 Bảng 2.1 Kích thước thang λ-HindIII 40 Bảng 2.2 Kích thước thang kb 40 Bảng 2.3 Nồng độ 2,4-D TDZ cho thí nghiệm tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh 45 Bảng 2.4 Nồng độ NAA BA cho thí nghiệm tạo chồi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh 46 Bảng 2.5 Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR 52 Bảng 3.1 Kết khảo sát ảnh hưởng 2,4-D TDZ lên khả tăng sinh hối mô sẹo sâm Ngọc Linh 55 Bảng 3.2 Kết tái sinh chồi sâm Ngọc Linh sau 12 tuần 58 Bảng 3.3 Kết khảo sát nồng độ hygromycin 67 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cây sâm Ngọc Linh 11 Hình 1.2 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens bám vào tế bào thực vật 22 Hình 1.3 Khối u thực vật Agrobacterium tumefaciens gây 23 Hình 1.4 Sơ đồ gen Ti–plasmid vi khuẩn A tumefaciens 24 Hình 1.5 Acetosyringone giúp hoạt hóa vùng vir trình chuyển gen 26 Hình 1.6 Trình tự biến nạp T-DNA vào tế bào ký chủ 27 Hình 1.7 Sơ đồ plasmid tái tổ hợp dựa nguyên tắc Ti-plasmid 29 Hình 1.8 Sơ đồ tạo cytokinin thực vật tác dụng gen ipt 34 T Hình 2.1 Sơ đồ plasmid pVDH396 mang gen chọn lọc kháng hygromycin 38 Hình 2.2 Vị trí gen hpt, gen ipt, gen gusA vùng T-DNA plasmid pVDH396 39 Hình 2.3 Vật liệu dùng nuôi cấy tạo mô sẹo 45 Hình 3.1 Mô sẹo hai loại vật liệu dùng nghiên cứu sau tháng nuôi cấy 54 Hình 3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng 2,4-D TDZ lên khả tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh sau tuần 56 Hình 3.3 Chồi tái sinh từ mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 12 tuần môi trường C1, C2, C3, C4, C5 C6 60 Hình 3.4 Cận cảnh chồi tái sinh từ mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 12 tuần môi trường C1, C2, C3 61 Hình 3.5 Cận cảnh chồi tái sinh từ mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 12 tuần môi trường C4, C5 C6 62 Hình 3.6 Sự hình thành phát triển phôi soma từ mô sẹo mảnh 63 Hình 3.7 Sự hình thành phát triển phôi soma từ mô sẹo cuống in vitro 65 Hình 3.8 Kết thử hygromycin sau tuần 68 Hình 3.9 Kết điện di sản phẩm cắt plasmid pVDH396 69 Hình 3.10 Kết kiểm tra diện gen ipt plasmid tách chiết từ vi khuẩn A tumefaciens LBA4404 tạo qua biến nạp 70 Hình 3.11 Chọn lọc mô chuyển gen 72 Hình 3.12 Thử nghiệm hóa mô GUS mô chuyển gen 74 Hình 3.13 Ảnh chụp gel điện di sản phẩm PCR gen hpt (băng DNA 800 bp) 75 Hình 3.14 Ảnh chụp gel điện di sản phẩm PCR gen ipt (băng DNA 650 bp) 76 Hình 3.15 Chồi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh chuyển gen 78 84 41 Bourgaud F., Gravot A., Milesi S., Gontier (2001), "Production of plant secondary metabolites: a historical perspective", Plant Science, Vol 161, 13: 839-851 42 Calderini O., Bovone T., Scotti C., Pupilli F., Piano E and Arcioni S (2006), “Delay of leaf senescence in Medicago sativa transformed with the ipt gene controlled by the senescence-specific promoter SAG12”, Plant cell report, Vol 26 (5), 611-615 43 Chang H., Michelle L J., Gary M B and David G C (2003), “Overproduction of Cytokinins in Petunia Flowers Transformed with PSAG12-IPT Delays Corolla Senescence and Decreases Sensitivity to Ethylene”, Plant Physiology, 132: 2174-2183 44 Chang W.C., Hsing Y.I (1980) Plant regeneration through somatic embryogenesis in root-derived callus of ginseng (Panax ginseng C A Meyer) Theor Appl Genet 57: 133-136 45 Chen C (1997), “Cytokinin biosynthesis and interconvertion”, Physiol Plant, 101: 665-673 46 Choi K.T., Lee C.H., Ahn I.O., Lee J.H., Park J.C (1994), "Characteristics of the growth and ginsenosides in the suspension - culture cells of Korean ginseng (Panax ginseng C A Mayer)", Proc Intl Ginseng Conf, 259-268 47 Choi Y.E (2006) Ginseng (Panax ginseng) In: Wang K, ed Agrobacterium Protocols, 2/e, vol Humana Press Inc., Totowa, NJ 48 Choi Y.E., Jeong J.H., In J.K., Yang D.C (2003), “Production of herbicideresistant transgenic Panax ginseng through the introduction of the phosphinothricin acetyl transferase gene and successful soil transfer”, Plant Cell Rep, 21: 563-568 49 Choi Y.E., Yang D.C., Choi K.T (1998), “Induction of somatic embryos by macrosalt stress from mature zygotic embryos of Panax ginseng”, Plant Cell Tiss Org Cult, 52: 177-181 85 50 Choi Y.E., Yang D.C., Kusano T., Sano H (2001), “Rapid and efficient Agrobacterium-mediated genetic transformation by plasmolyzing pretreatment of cotyledons in Panax ginseng”, Plant Cell Rep, 20: 616-621 51 Chopra V.L., Anwan N (1990), Genetic Engineering and Biotechnology, Oxford and IBH Publishing CO.PVT 52 Clive W (Indianapolis, IN) (2002), "Hygromycin-resistant transgenic plants", United States Patent, 6365799 53 Coleman C.I., Herbert J.H., Reddy P (2003), “The effects of Panax ginseng on quality of life”, J.Clin Pharm Ther., 28 (1): 5-15 54 Dornenburg H., Knorr D (1995), "Strategies for the improvement of secondary metabolite production in plant cell cultures", Enzyme Microb Technol, 17: 674-684 55 Ebinuma H., Sugita K., Matsunaga E and Yamakado M (1997), "Selection of marker-free transgenic plants using the isopentenyl transferase gene (plant genetic engineering DNA transformation selectable marker ipt gene transposon Ac)", Proc Natl Acad Sci USA., 94: 2117-2121 56 Engels H.J., Said J.M., Wirth J.C (1996), "Failure of chronic ginseng supplementation to affect work performance and energy metabolism in healthy adult females", Nutr Res, 16: 1295-1305 57 Florence C., Lee (1992), Facts about ginseng – The elixir of life, Hollym Ltd.Co 58 Franklin G., Oliveira M.M., Dias A.C (2009), “Transgenic Hypericum perforatum”, Methods Mol Biol, 547: 217-34 59 Furuya T., Yoshikawa T (1987), "Saponin production by cultures of Panax ginseng transformed with Agrobacterium rhizogenes", Plant Cell Rep, 6: 449-453 60 Garcia J.E (1986) “Conceptus transfer In Jones H.W., Jones G.S., Hodgen G.D and Rosenwaks, Z (eds), In Vitro Fertilisation Williams & Williams”, Baltimore, 215–220 86 61 Geng S., Ma M., Ye H.C., Liu B.Y., Li G.F., Chong K (2001), "Effects of ipt gene expression on the physiological and chemical characteristics of Artemisia annua L.", Plant Sci, 160: 691-698 62 Glick B.R , Jackj P (1994), Molecular Biotechnology, ASM Press Washington D.C USA 63 Gorpenchenko T.Y., Kiselev K.V., Bulgakov V.P., Tchernoded G.K., Bragina E.A., Khodakovskaya M.V., Koren O.G., Batygina T.B., Zhuravlev Y.N (2006), “The Agrobacterium rhizogenes rolC-gene-induced somatic embryogenesis and shoot organogenesis in Panax ginseng transformed calluses”, Planta, 223(3): 457-467 64 Guo B., Abbasi B.H., Zeb A., Xu L.L and Wei Y H (2011), “Thidiazuron: A multi-dimensional plant growth Regulator (Review)”, African Journal of Biotechnology, Vol 10(45), 8984-9000 65 Haberer G., and Kiebers J.J (2001), “Cytokinins: New insights into a classic T T phytohormone”, Plant Physiol, 128, 354–362 T T 66 Han J.L., Wang H., Ye H.C., Liu Y., Li Z.Q., Zhang Y.S., Li G.F (2005) "High efficiency of genetic transformation and regeneration of Artemisia annua L via Agrobacterium tumefaciens-mediated Procedure", Plant Sci, 16: 73-80 67 Han J.Y., Choi Y.E (2009), "Rapid induction of Agrobacterium tumefaciensmediated transgenic roots directly from adventitious roots in Panax ginseng", Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 96:143-149 68 Hiai S., Yokoyama H., Oura H (1979), "Features of ginseng saponin induced corticosterone release", Endocrinol Jpn., 26: 737-40 69 Huang K.C (1993), "The Pharmacology of Chinese Herbs", CRC Press, Boca Raton, FL, USA, 21-45 70 Hwang I and Sheen J (2001), “Two-component circuitry in Arabidopsis T T T signal transduction”, Nature, 413, 383–389 T T T 87 71 Hyo-Won B (1978), Korean ginseng, Samhwa Printing Co., Ltd., Seoul, Korean 72 Inomata N (1993), “Crossability and cytology of hybrid progenies in the cross between Brassica campestris and three wild relatives of B oleracea, B bourgeaui, B cretica and B Montana”, Euphytica, 69: 7–17 T T 73 Jefferson R.A., Burgess S.M and Hirsh D (1986), “ß-Glucuronidase from E coli as a Gene Fusion Marker”, Proc Natl Acad Sci USA, 83: 8447-8451 74 Jeong G.T and Park D.H (2005), "Comparative Evaluation of Modified Bioreactors for Enhancement of Growth and Secondary Metabolite Biosynthesis Using Panax ginseng Hairy Root", Biotechnology and Bioprocess Engineering, 10: 528-534 75 Jeong G.T and Park D.H (2006), "Characteristic of Transformed Panax ginseng C.A Meyer Hairy Root: Growth and Nutrient Profile", Biotechnology and Bioprocess Engineering, 11: 43-47 76 Jeong G.T and Park D.H (2005), "Enhancement of Growth and Secondary Metabolite Biosynthesis: Effect of Elicitors Derived from Plants and Insects", Biotechnology and Bioprocess Engineering, 10: 73-77 77 John M.C and Amasino R.M (1988), "Expression of an Agrobacterium Ti Plasmid Gene Involved in Cytokinin Biosynthesis Is Regulated by Virulence Loci and Induced by Plant Phenolic Compounds", Journal of bacteriology, 6: 790-795 78 Kakimoto T (2001), “Identification of plant cytokinin biosynthetic enzymes T T as dimethylallyl diphosphate:ATP/ADP isopentenyltransferases”, Plant Cell Physiol, 42, 677–685 T T 88 79 Khalafalla M.M and Hattori K (1999), “A combination of thidiazuron and benzyladenine promotes multiple shoot production from cotyledonary node explants of faba bean (Vicia faba L.)”, Plant Regulation, Vol 72, 145-148 80 Kim Y.S., Han J.Y., Lim S and Choi Y.E (2009), “Ginseng metabolic engineering: Regulation of genes related to ginsenoside biosynthesis”, Journal of Medicinal Plants Research, Vol 3(13), 1270-1276 81 Kitts D.D and Hu C (2000), "Efficacy and safety of ginseng", Public Health Nutrition, 3(4A): 473-485 82 Lee B.H., Lee S.J., Hui J.H., Lee S., Huh J.D., Moon C.K (1998), "In vitro antigenotoxic activity of novel ginseng saponin metabolites formed by intestinal bacteria", Planta Med, 64: 500-3 83 Lee H.S., Kim S.W., Lee K.W., Eriksson T and Liu J.R (1995), "Agrobacterium-mediated transformation of ginseng (Panax ginseng) and mitotic stability of the inserted beta-glucuronidase gene in regenerates from isolated protoplasts", Plant Cell Rep, 14: 545- 549 84 Li T.S.C, Mazza G., Cottrell A.C., Gao L (1996), "Ginsenosides in roots and leaves of American ginseng", J Agric Food Chem, 44: 717-20 85 Lian M.L., Chakrabarty D and Paek K.Y (2002), "Effect of Plant Growth Regulators and Medium Composition on Cell Growth and Saponin Production during Cell- Suspension Culture of Mountain Ginseng (Panax ginseng C A Mayer)", Joumal of Plant Biology, 45 (4): 201-206 86 Lim H.T., et al (1997), "Regeneration of Panax ginseng C.A Meyer by organogenesis and nuclear AND analysis of regenerants", Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 49: 179-187 87 Liou C.J., Huang W.C., Tseng J (2005), Long-term oral administration of ginseng extract modulates humoral immune response and spleen cell functions, Am J Chin, Med, 33(4): 651-661 88 Lisa V., et al (2003), "Agrobacterium tumefaciens and the Plant: The David and Goliath of Modern Genetics”, Plant Physiology, 133: 948-955 89 89 Liu B., Wang H., Du Z., Li G., Ye H (2010), "Metabolic engineering of artemisinin biosynthesis in Artemisia annua L.", Plant Cell Rep, Review 90 Liu C.X., Xiao P.G (1992), "Recent advances on ginseng research in China", J Ethnopharmacol, 36: 27-38 91 Lu L., Zhu Y., Liu Y., Zhao D (2010), "Ethanol inducible isopentenyl transferase as a high efficiency marker for tobacco transformation", African Journal of Biotechnology, Vol 9(48): 8139-8145 92 Ma Q.H., Liu Y.C (2009), "Expression of isopentenyl transferase gene (ipt) in leaf and stem delayed leaf senescence without affecting root growth", Plant Cell Rep, 28: 1759-1765 93 Ma Y.C., Zhu J., Luo L (1995), "A comparative evaluation of ginsenosides in commercial ginseng products and tissue culture samples using HPLC", J Herb Spices Med Plants, 3: 41-50 94 Matsunaga H., Katano M., Yamamoto H., Fujito H., Mori M., Tanaka K (1990), “Cytotoxic activity of polyacetylene compounds in Panax ginseng C.A Meyer”, Chem Pharm Bull Tokyo, 38 (12): 3480-3482 95 Matthew S.M., Lee C.G., Frank S., Wilco J.R.M.J., Geert M.S., Evert D., J Hans A.V.R, Power J.B and Davey M.R (2001), "Effects of PSAG12-IPT Gene Expression on Development and Senescence in Transgenic Lettuce", American Society of Plant Biologists, Vol 127, 505-516 96 McKenzie M.J., Mett V., Reynolds P.H.S., Jameson P.E (1998), "Controlled cytokinin induction in transgenic tobacco using a copper inducible promoter", Plant Physiol, 116: 969-977 97 Misawa M (1985), “Production of useful plant metabolites”, Adv Bilchem Eng, 31: 59-88 98 Mizuno M., Yamada J., Terai H, Kozukue N., Lee Y.S., Tsuchida H (1994), "Differences in immunomodulating effects between wild and cultured Panax ginseng", Biochem Biophys Res Commun, 200: 1672-8 90 99 Murashige T., Skoog F (1962), “A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture”, Physiol Plant, 15: 473-497 100 Murthy H.N, Hahn E.J and Paek K.Y (2008), "Adventitious Roots and Secondary Metabolism", Chinese J Biotechnology, Vol 24, 711 101 Nhut D.T., Huy B.N, Phong P.T., Hai N.T and Luan T.C (2006), "Primary Study on Multiplication of Advaentitious Roots of Panax vietnamensis - A Valuable Source for Saponin Isolation", Proceedings of International Workshop on Biotechnology in Agriculture, 118-121 102 Pant D.R., Bhattarai T., Beck E and Fettig S (2009), "Genetic Transformation of Nepalese Spring Wheat (Triticum aestivum L.) Cultivars with ipt Gene under the Regulation of a Senescence Enhanced Promoter from Maize", Pakistan Journal of Biological Sciences 12, (2): 101-109 103 Perkins D and Buckley K.W (1987), “Transformative change In Donald L Kirkpatrick, How to manage change effectively”, San Francisco: JosseyBass Publishers, 45-63 104 Proctor J.T.A., Slimmon T and Saxena P.K (1996), “Modulation of root growth and organogenesis in thidiazuron-treated ginseng (Panax quinquefolium L.)”, Plant Growth Regulation, 20: 201-208 105 Ramachandra R.S and Ravishankar G.A (2002), "Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites", Biotechnol Adv, 20: 101153 106 Robak J., and Gryglewski I (1988), “Flavonoides are scavengers of superoxide anions”, Biochemical Pharmacology, 37, 837 – 841 107 Sa G., Mi M., He-chun Y., Ben-ye L., Guo-feng L., Kang C (2001), "Effects of ipt gene expression on the physiological and chemical characteristics of Artemisia annua L.", Plant Sci., 160(4): 691-698 108 Sakakibara H (2006), “Cytokinins: Activity, Translocation”, Plant Biology, Vol 57: 431-449 Biosynthesis, and 91 109 Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T (1999), Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press 110 Schenk R.U and Hildebrandt A.C (1972), "Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonuous plant cell cultures", Can J Bot, 50: 199-204 111 Shahla S.N., Donald W.P (1987), "Acetosyringone promotes high frequency transformation of Arabidopsis thaliana explants by Agrobacterium tumefaciens", Plant Molecular Biology, 8: 291-298 112 Shim J.S., Lee O.R., Kim Y.J., Lee J.H., Kim J.H., Jung D.Y., In J.G., Lee B.S., Yang D.C (2010), “Overexpression of PgSQS1 increases ginsenoside production and negatively affects ginseng growth rate in Panax ginseng”, J Ginseng Res, 34(2): 98-103 113 Song J.Y., Akhalaia M., Platonov A., Kim H.D., Jung I.S., Hang Y.S., Yun Y.S (2004), “Effects of polysaccharide ginsan from Panax ginseng on liver function”, Arch Pharm Res, 27 (5): 531-538 114 Sotaniemi E.A., Haapakoski E., Rautio A (1995), "Ginseng therapy in noninsulin dependent diabetic patients", Diabetes Care, 18: 1373-5 115 Tang W., Eisenbrand G (1992) "Panax ginseng C A Mayer, Chinese Drugs of Plant Origin", Springer-Verlag, Berlin, 710-737 116 Thanh N.T., Ket N.V, Yoeup P.K (2007), "Effecting of medium composition on biomass and ginsenoside production in cell suspension culture of Panax vietnamensis Ha et Grushv.", VNU Journal of Science, Natural Sciences and Technology, 23: 269-274 117 Thanh N.T., Murthy H.N., Y K.W., Jeong C.S., Hahn E.J., Paek K.Y (2006) “Effect of oxygen supply on cell growth and saponin production in bioreactor cultures of Panax ginseng”, J Plant Physiology, 163(12): 13371341 92 118 Thanh N.T., Son L.T and Paek K.Y (2007), "Induction and proliferation of callus of Ngoc Linh ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.): Effects of plant growth regulators", J of Science, 167 119 Tirajoh A., et al (1996), "Tissue culture and Agrobacterium - mediated transformation of most American ginseng (Panax quinquefolium L.)", Biological Sciences, 120 Tirajoh A., Kyung T S and Punja Z K (1998), "Somatic Embryogenesis and Plantlet Regeneration in American Ginseng (Panax quinquefolium L.)", In Vitro Cellular and Developmental Biology, 203-211 121 Vergauwe A., Cammaert R., Vandenberghe D., Genetello C., Inze D, VanMontagu M., VandenEeckhout E (1996), "Agrobacterium tumefaciensmediated transformation of Artemisia annua and regeneration of transgenic plants", Plant Cell Rep, 15: 929-933 122 Vergauwe A., Van Geldre E., Inze D., Van Montagu M., Van den Eeckhout E (1998), "Factors influencing Agrobacterium tumefaciens- mediated transformation of Artemisia annua L.", Plant Cell Rep, 18:105-110 123 Verpoorte R., Memelink J (2002), "Engineering secondary metabolite production in plants", Curr Opin Biotechnol, 13:181-187 124 Wang J., Letham D S., Cornish E., Stevenson K R (1997), “Studies on cytokinins action and metabolism using tobacco p lants expressing either the ipt or the gus gene controlled by a chalcone synthase promoter”, Aus J Plant Physiol, 24: 661-672 125 Yancheva S.D., Golubowicz S., Fisher E., Lev-Yadun S., Flaishman M.A (2003), “Auxin type and timing of application determine the activation of the developmental program during in vitro organogenesis in apple”, Plant Science, Vol 165, 11: 299-309 126 Yoder J.I, Golgsbrough A.P (1994), "Transformation system for generating marker- free transgenic plants", Biotechnology, 12: 263-267 93 127 Yuan C.S., Wu J.A., Lowell T., Gu M (1998), "Gut and brain effects of American ginseng root on brainstem neuronal activities in rats", Am J Chin Med., 26: 47-55 128 Zhong J., Wang S.J (1998), "Effects of nitrogen source on the production of ginseng saponin and polysaccharide by cell cultures of Panax quinquefolium", Pro Biochem 33: 671-675 129 Zhong J.J., Bai Y., Wang S.J (1996), "Effects of plant growth regulators on cell growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium", J Biotech, 45: 227-234 TÀI LIỆU INTERNET 130 http://www.snv.jussieu.fr/vie/dossiers/transgenese/agrobacterium/agro.htm 131 hppt://www.answers.com/topic/agrobacterium-tumefaciens-2 132 http://ykhoaviet.vn/home/73/sam-khong-nen-lam-dung.htm T T PHỤ LỤC Phụ lục Các polyacetylen tìm thấy số loài sâm Loài Hợp chất Panax ginseng Panaxynol (falcarinol) C.A Meyer Panaxytriol Panaxydol Heptadeca-1-en-4,6-diyn-3,9-diol Heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol Heptadeca-1,4-dien-6,8-diyn-3,10-diol Panaxycol 9,10-epoxy-1,16-heptadecadien-4,6-diyn-3-ol 10-cloro-1,16-heptadecadien-4,6-diyn-3,9,10-triol 9,10-epoxy-4,6-heptadecadiyn-3-on 9,10-epoxy-1-heptadecen-4,6-diyn-3-on 3-acetoxy-9,10-epoxy-1,16-heptadecadien-4,6-diyn 3-acetoxy-9,10-epoxy-4,6-heptadecadiyn 3-acetoxy-9,10-epoxy-16-heptadecen-4,6-diyn Panax Falcarinol quinquefolium Panaxytriol Panaxydol Heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol Heptadeca-1-en-9,10-epoxy-4,6-diyn-3,8-diol 3-oxo-9,10-epoxy-heptadeca-1-en-4,6-diyn 6,7-epoxy-13-tetradecen-1,3-diyn 1,2,9,10-diepoxy-4,6-heptadecadiyn-3-on Panax 8-acetoxy-9,10-epoxy-1-heptadecen 4,6-diyn-3-ol notoginseng 10-metoxyheptadeca-1-en-4,6-diyn 3,9-diol Panaxytriol Panax Heptadeca-1,9(Z)-dien-4,6-diyn-3-ol Vietnamensis (Panaxynol, Falcarinol) Ha et Grushv 10-acetoxy-hetadeca-8(E)-en-4,6-diyn-3-ol Heptadeca-1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol Heptadeca-1,8(Z)-dien-4,6-diyn-3,10-diol Heptadeca-1,8(E),10 (E)-trien-4,6-diyn-3,12-diol Phụ lục Thành phần môi trường AB (Chilton cs., 1974) Thành phần Khối lượng (g/l) Dung dịch đệm AB 20X K HPO R R 30 R NaH PO R R R Dung dịch muối khoáng 20X NH Cl 20 MgSO KCl R R R CaCl 2H O FeSO 7H O 0,005 R R R R R R R R Phụ lục Thành phần môi trường LB (Luria Bertoni) Thành phần Khối lượng (g/l) Cao nấm men Bactotrypton 10 NaCl 10 Phụ lục Thành phần môi trường MS (Murashige Skoop, 1962) (pH = 5,8) Khối lượng (mg/l) Thành phần Khoáng đa lượng NH NO R R R KNO R 1650 R 1900 R CaCl 2H O 440 MgSO 7H O 370 FeSO 7H O 27,3 Na EDTA 37,3 R R R R R R R R R R R R R R Khoáng vi lượng H BO R R R 6,2 R MnSO 4H O 22,3 ZnSO 4H O 8,6 KI 0,83 R R R R R R R R Na MoO 2H O 0,25 CuSO 5H O 0,025 CoCl 6H O 0,025 R R R R R R R R R R R R R R Vitamin Glycine B1 0,1 B6 0,5 Acid nicotinic 0,5 Inositol 100 Phụ lục Hình tăng sinh mô sẹo sau tuần nuôi cấy (a., b., c., d., e., f.: Nuôi cấy môi trường S1, S2, S3, S4, S5, S6) a b c d e f Phụ lục Hình tái sinh chồi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh sau tuần nuôi cấy môi trường C1, C2, C3, C4, C5 C6 C1 C2 C3 C4 C5 C6 [...]... về biến nạp gen nói chung và biến nạp gen ipt nói riêng trên đối tượng sâm Ngọc Linh 2 Do vậy, đề tài Bước đầu nghiên cứu chuyển gen ipt (isopentenyl transferase )vào mô sẹo sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv. ) được đặt ra với mục đích tạo được mô sẹo sâm Ngọc Linh mang gen ipt bằng kỹ thuật biến nạp gen phục vụ cho mục đích nghiên cứu dài hạn về ảnh hưởng của gen chuyển ipt đến khả năng... cấp Mục tiêu của đề tài Tạo được một số dòng mô sẹo sâm Ngọc Linh mang gen đích ipt qua biến nạp gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Giới hạn của đề tài Đề tài chỉ tập trung nghiên cứu tạo ra dòng mô sẹo chuyển gen, bước đầu đánh giá sự hiện diện và biểu hiện của các gen chuyển bằng thử nghiệm định tính (thử GUS) và phương pháp sinh học phân tử (PCR) Chưa nêu nội dung phân tích hàm lượng hợp... (Makino) Hara Subsp Himalaycus Hara Var elagantior (Burk .) Wu et Feng Jun Wen (200 1) P ginseng C.A Mey P Wanggianus S.C Sun Var major (Burk .) Var Angustifolius (Burk .) Li P Bipinnatifidus Seem Var Angustifolius (Burk .) Jun Wen P Stipuleanatus Tsai et Feng P Zingiberensis C.Y Wu et K.M Feng P Stipuleanatus Tsai et Feng P Zingiberensis C.Y Wu et K.M Feng P trifolius L P Quinquefolius P Vietnamensis Ha et Grushv. .. phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium là hoạt chất acetosyringone hỗ trợ cho quá trình chuyển gen 26 Hình 1.5 Acetosyringone giúp hoạt hóa vùng vir trong quá trình chuyển gen Acetosyringone (tên hóa học: 1-(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl) ethanol), công thức phân tử là C 10 H 12 0 4 , có tác dụng kích thích quá trình biến nạp gen của A R R R R R R tumefaciens vào tế bào mô vì acetosyringone... là Panax articulates 10 L., họ Nhân sâm (Araliaceae) Từ đó cây sâm này được nghiên cứu nhiều về đặc điểm hình thái, phân tích thành phần hóa học, tác dụng dược lý,… Trải qua hơn 30 năm, sâm Ngọc Linh hay sâm Việt Nam, một loài sâm đặc hữu của nước ta đã được thế giới biết đến với tên khoa học là Panax vietnamensis Ha et Grushv Tên khoa học này do Hà Thị Dung và Grushvistky I V.đặt, được công bố nǎm...1 MỞ ĐẦU Một số loài thực vật họ Sâm (Araliaceae) nói chung, sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv. ) nói riêng – giống đặc hữu của nước ta là các loài cây dược liệu rất quý đối với nhiều nước trên thế giới đặc biệt đối với các nước châu Á như Trung Quốc, Triều Tiên, Việt Nam, ; rễ sâm chứa nhiều hợp chất có tác dụng dược lý quan trọng Sâm Ngọc Linh đã được chứng minh ngoài... Ha et Grushv. ), còn gọi là sâm K5, sâm Ngọc Linh Ngoài ra, ở Việt Nam còn phát hiện loài sâm Vũ Diệp (Panax bipinatifidus) và sâm Tam Thất (Panax pseudoginseng) ở các tỉnh miền núi phía Bắc giáp Trung Quốc Một số nghiên cứu các cây thuộc họ Nhân sâm có đặc điểm chung sau: Về thành phần hóa học: hợp chất saponin thường được đánh giá là thành phần hoạt chất chính của những cây thuộc họ Nhân sâm và được... học công nghệ, có nhiều phương pháp chuyển gen được khám phá và ngày càng hoàn thiện về quy trình: phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn A tumefaciens (Klee và Roger, 198 9), chuyển gen trực tiếp bằng kỹ thuật bắn gen (Klein và cs., 198 9), vi tiêm (Neuhaus và cs., 198 7), xử lý laser (Weber và cs., 198 8), … Trong điều kiện của nước ta thì phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens được... Hiệu suất ( %) Bảng 1.5 Acid Oleanolic [5] Tên Kiểu R1 R2 Hiệu suất ( %) G-R 0 (O) -Glc2-Glc -Glc- 0.038 H-Ma (O) -Glc2-Glc-Ara(p) -Glc- 0.05 R R P P P P Bảng 1.6 Ocotillol [5] Kiểu R1 R2 (M) -Glc- -CH 3 0.065 (M) -Glc2-Rha -CH 3 0.005 M-R 1 * (M) -Glc2-Glc -CH 3 0.14 M-R 2 * (M) -Glc2-Xyl -CH 3 5.29 G-R 1 (M) -Glc2-Rha-Ac 6 -CH 3 0.033 G-R 2 (M) -Glc2-Xyl-Ac 4 -CH 3 0.014 Tên PG-RT 4 R 24(s)-PGF 11 R... R2 G-ReI (I) -H- -Glc2-Rha -Glc- 0.17 20-glc-G-Rf (I) -H- -Glc2-Glc -Glc- 0.01 G-Rg 1 * (I) -H- -Glc2-Glc -Glc- 1.37 G-Rh 1 (I) -H- -Glc- -H- 0.008 N-R 1 * (I) -H- -Glc2-Xyl -Glc- 0.36 N-R 6 (I) -H- -Glc- -Glc6- 0.01 G-R 4 (I) -Glc2-Glc -H- -Glc- 0.004 G-R 12 (K) -H- -Glc- -H- 0.005 G-R 15 (J) -H- -Glc- -Glc- 0.003 G-R 17 (K) -H- -Glc- -Glc- 0.002 G-R 18 (K) -H- -Glc- -Glc- 0.002 G-R 19 (L) -Glc2-Glc ... nạp gen nói chung biến nạp gen ipt nói riêng đối tượng sâm Ngọc Linh 2 Do vậy, đề tài Bước đầu nghiên cứu chuyển gen ipt (isopentenyl transferase )vào mô sẹo sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha. .. SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Tạ Thị Diễm Thu BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN IPT (ISOPENTENYL TRANSFERASE) VÀO MÔ SẸO SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) Chuyên ngành : Sinh Học Thực Nghiệm... Tạo số dòng mô sẹo sâm Ngọc Linh mang gen đích ipt qua biến nạp gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Giới hạn đề tài Đề tài tập trung nghiên cứu tạo dòng mô sẹo chuyển gen, bước đầu đánh giá