Nghiên cứu quá trình tái sinh và nhân giống in vitro cây sâm ngọc linh (panax vietnamensis ha et grushv ) bằng kỹ thuật cấy lớp mỏng tế bào tt

27 202 0
Nghiên cứu quá trình tái sinh và nhân giống in vitro cây sâm ngọc linh (panax vietnamensis ha et grushv ) bằng kỹ thuật cấy lớp mỏng tế bào tt

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - VŨ THỊ HIỀN NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TÁI SINH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY LỚP MỎNG TẾ BÀO Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Mã số: 9.42.01.12 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC TP HỒ CHÍ MINH - 2018 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: GS.TS Dương Tấn Nhựt Người hướng dẫn khoa học 2: TS Thái Xuân Du Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … , ngày … tháng … năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư Viện Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Thư Viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Sâm Ngọc Linh loài sâm đặc hữu Việt Nam với tên khoa học Panax vietnamensis Ha et Grushv Dù giới y học biết đến từ năm 1973, nói sâm Ngọc Linh phát quan trọng bậc lĩnh vực y dược, qua nghiên cứu nhà khoa học nhận thấy sâm Ngọc Linh khơng có tác dụng dược lý đặc trưng chi Nhân Sâm mà có tác dụng dược lý điển chống (stress), trầm cảm, giảm lo âu, kích thích hệ miễn dịch, kháng độc tố gây hại tế bào, tác dụng lên chống oxy hóa in vitro in vivo… Nhân giống sâm Ngọc Linh gặp nhiều khó khăn loài trồng khu vực quanh đỉnh núi Ngọc Linh, thời gian nuôi trồng kéo dài từ đến năm củ tích trữ đủ hoạt chất để thu hoạch Chính vậy, đề tài “Nghiên cứu trình tái sinh nhân giống in vitro sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào” tiến hành với mục đích thu số lượng lớn với sức sống cao, rễ củ phát triển tốt, thích nghi tốt với điều kiện tự nhiên, từ góp phần bảo tồn nguồn dược liệu quý Mục tiêu nghiên cứu luận án Mục tiêu đề tài tìm nguồn mẫu, phương pháp cắt mẫu, loại nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật (CĐHSTTV), điều kiện nuôi cấy in vitro thích hợp cho q trình phát sinh hình thái khác (cảm ứng mơ sẹo, phát sinh phôi trực tiếp, tạo rễ, tạo chồi…) mẫu cấy Những sâm Ngọc Linh in vitro có nguồn gốc từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào (thin cell layer - TCL) đem trồng thử nghiệm tỉnh Quảng Nam để đánh giá khả thích ứng sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro nơi có quần thể sâm Ngọc Linh tự nhiên sinh sống, so sánh với khả sống sót sinh trưởng sâm Ngọc Linh trồng Vườn Quốc gia Bidoup - Núi Bà, Lâm Đồng Các nội dung nghiên cứu luận án Nội dung 1: Nghiên cứu trình phát sinh hình thái từ nguồn mẫu khác Nội dung 2: Nghiên cứu sinh trưởng phát triển in vitro điều kiện sinh thái khác Nội dung 3: Định tính định lượng saponin sâm in vitro sâm hoàn chỉnh giai đoạn vườn ươm CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tham khảo 34 tài liệu tiếng Việt 94 tài liệu tiếng Anh tài liệu internet; (1) Giới thiệu chi nhân Sâm; (2) Sơ lược sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.); (3) Kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào; (4) Các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh hình thái; (5) Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật; (6) Vai trò ánh sáng tái sinh, sinh trưởng phát triển thực vật; (7) Quá trình tái sinh CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Vật liệu thực vật Nguồn mẫu cho trình phát sinh hình thái: bao gồm lá, cuống củ sâm Ngọc Linh in vitro tháng tuổi; Nguồn mẫu sinh trưởng phát triển điều kiện ex vitro khác nhau: sâm Ngọc Linh hoàn chỉnh có củ lá, có chiều cao khoảng cm; Nguồn mẫu để xác định hoạt chất: sâm in vitro, sâm tháng tuổi, năm tuổi năm tuổi 2.1.2 Thiết bị - dụng cụ, hóa chất chuẩn dung mơi Máy đo cường độ ánh sáng LI-250A Light meter; kính hiển vi soi nổi; Thiết bị dùng phân tích HPLC (High-performance liquid chromatography: sắc lỏng hiệu cao năng; Hóa chất chuẩn: Rg1; Rb1; MR2 Dung môi để chạy sắc lớp mỏng là: Chloroform:methanol:nước (65:35:10) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp nghiên cứu phát sinh hình thái 2.2.2 Phương pháp giải phẫu hình thái thực vật quan sát kính hiển vi soi 2.2.3 Phương pháp phân tích hàm lượng saponin 2.2.3.1 Phương pháp sắc lớp mỏng 2.2.3.2 Phương pháp sắc lỏng hiệu cao (HPLC: High Performance Liquid Chromatography) 2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu trình phát sinh hình thái từ nguồn mẫu khác 2.3.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng CĐHSTTV riêng lẻ lên phát sinh hình thái mẫu tTCL_L điều kiện chiếu sáng tối hồn tồn 2.3.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng CĐHSTTV riêng lẻ lên phát sinh hình thái mẫu cuống tTCL_L điều kiện chiếu sáng tối hồn tồn 2.3.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng CĐHSTTV riêng lẻ lên phát sinh hình thái mẫu cuống lTCL_C điều kiện chiếu sáng tối hồn tồn 2.3.1.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng CĐHSTTV riêng lẻ lên phát sinh hình thái mẫu thân rễ tTCL_R điều kiện chiếu sáng tối hoàn toàn 2.3.1.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng kết hợp auxin cytokinin lên phát sinh hình thái mẫu tTCL_L điều kiện chiếu sáng tối hồn tồn 2.3.1.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng kết hợp auxin cytokinin lên phát sinh hình thái mẫu cuống tTCL_C điều kiện chiếu sáng tối hồn tồn 2.3.1.7 Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng kết hợp auxin cytokinin lên phát sinh hình thái mẫu cuống lTCL_C điều kiện chiếu sáng tối hồn tồn 2.3.1.8 Thí nghiệm 8: Khảo sát ảnh hưởng kết hợp auxin cytokinin lên phát sinh hình thái mẫu thân rễ tTCL_R điều kiện chiếu sáng tối hoàn toàn 2.3.1.9 Giải phẫu hình thái học 2.3.1.10 Tạo hồn chỉnh từ phơi vơ tính sâm Ngọc Linh 2.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu sinh trưởng phát triển in vitro điều kiện sinh thái khác 2.3.2.1 Thí nghiệm 09: Nghiên cứu trình sinh trưởng phát triển sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro trồng Quảng Nam 2.3.2.2 Thí nghiệm 10: Nghiên cứu q trình sinh trưởng phát triển sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro trồng khu vực Cổng Trời, rừng quốc gia Bidoup - Núi Bà (Lâm Đồng) 2.3.3 Nội dung 3: Định tính định lượng saponin sâm in vitro sâm hoàn chỉnh giai đoạn vườn ươm 2.3.3.1 Thí nghiệm 11: Định tính hàm lượng saponin sâm Ngọc Linh in vitro, sâm tháng, năm năm tuổi trồng Quảng Nam 2.3.3.2 Thí nghiệm 12: Định lượng saponin sâm Ngọc Linh in vitro, sâm tháng, năm năm tuổi trồng Quảng Nam 2.4 Phương pháp xử lý thống kê Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design, CDR) Trung bình tiêu theo dõi cơng thức thí nghiệm xử lý phương pháp phân tích phương sai (ANOVA), sau so sánh với phép thử Ducan mức tin cậy P < 0,05 phần mềm SPSS 16.0 [58] 2.5 Điều kiện nuôi cấy 2.5.1 Điều kiện in vitro 2.5.2 Điều kiện ex vitro 2.6 Địa điểm thời gian tiến hành thí nghiệm CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1.1 Nghiên cứu trình phát sinh hình thái từ nguồn mẫu khác 3.1.1.1 Ảnh hưởng CĐHSTTV riêng lẻ lên phát sinh hình thái mẫu tTCL_L điều kiện chiếu sáng tối hoàn toàn Lớp mỏng mẫu tTCL_L in vitro cấy môi trường bổ sung CĐHSTTV riêng lẻ Sau 10 tuần nuôi cấy, kết quan sát ghi nhận thể bảng 3.1; 3.2 hình 3.1; 3.2 Bảng 3.1 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng riêng lẻ lên phát sinh hình thái mẫu tTCL_L điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày CĐHST TV ĐC TDZ TDZ TDZ TDZ TDZ TDZ BA BA BA BA BA 2,4-D 2,4-D Nồng độ (mg/l) 0,01 0,05 0,1 0,2 0,5 1,0 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 0,1 0,2 Phôi (%) 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 43,3 d Mô sẹo (%) 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d Rễ (%) 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e Số rễ/mẫu 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 2,4-D 0,5 70,6 b 44,4 c 0e 0e 2,4-D 1,0 86,3 a 97,7 a 42,1 b 2,86 a 2,4-D 2,0 49,6 c 76,6 b 9,9 d 1,06 c NAA NAA NAA 0,1 0,2 0,5 0e 0e 0e 0d 0d 0d 0e 0e 0e 0e 0e 0e NAA 1,0 70,0 b 74,4 b 26,6 c 0,64 d NAA 2,0 89,0 a 97,7 a 63,3 a 2,59 b Đặc điểm Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu sống không cảm ứng Mẫu sống không cảm ứng Mẫu sống không cảm ứng Mẫu sống không cảm ứng Mẫu sống không cảm ứng Mẫu chết Phôi ít, hình cầu Phơi có dạng hình cầu, tim mầm Mô sẹo màu nâu, cứng Phôi tạo thành cụm Mơ sẹo có màu trắng, nâu, cứng Phơi Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Phơi dạng hình tim, cầu Rễ ít, ngắn Mơ sẹo có màu nâu đen Phơi hình tim, cầu, mầm thủy lơi Rễ màu trắng, ngắn Mơ sẹo có màu nâu đen Ghi chú: Những chữ khác (a, b, …) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test Bảng 3.2 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng riêng lẻ lên phát sinh hình thái mẫu tTCL_L điều kiện tối hoàn toàn NT Nồng độ (mg/l) Phôi (%) Mô sẹo (%) Rễ (%) Số rễ/mẫu Đặc điểm ĐC TDZ TDZ TDZ TDZ TDZ TDZ BA BA BA BA BA 2,4-D 2,4-D 0,01 0,05 0,1 0,2 0,5 1,0 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 0,1 0,2 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 37,6 e 84,3 b 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 39,9 b 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 2,4-D 0,5 71,6 c 96,6 a 73,3 b 2,74b 2,4-D 1,0 92,0 a 98,8 a 79,9 a 2,87a 2,4-D 2,0 47,3 d 97,7 a 57,7 c 2,63c NAA NAA NAA NAA 0,1 0,2 0,5 1,0 0f 0f 0f 0f 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d NAA 2,0 0f 13,3 c 0d 0d Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu sống, không cảm ứng Mẫu sống, không cảm ứng Mẫu sống, không cảm ứng Mẫu sống, không cảm ứng Mẫu sống, không cảm ứng Phơi hình cầu, hình tim Phơi hình cầu, hình tim, hai mầm Phơi hình cầu, hình tim, hai mầm; Rễ màu trắng Phơi hình cầu, hình tim, hai mầm; Rễ màu trắng Mô sẹo màu trắng, vàng; Phơi ít, rễ màu trắng Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mô sẹo màu vàng ít, mọc mép ngồi Ghi chú: Những chữ khác (a, b, …) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa v ới α = 0,05 Duncan’s test 3.1.1.2 Ảnh hưởng CĐHSTTV riêng lẻ lên phát sinh hình thái mẫu cuống tTCL_C điều kiện chiếu sáng tối hoàn toàn Sau 10 tuần ni cấy, tiêu phát sinh hình thái trình bày bảng 3.3 hình 3.3 Bảng 3.3 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng riêng lẻ lên phát sinh hình thái mẫu cuống tTCL_C điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày điều kiện tối hoàn toàn CĐHS TTV Nồng độ (mg/l) ĐC TDZ TDZ TDZ TDZ TDZ TDZ BA BA BA BA 0,01 0,05 0,1 0,2 0,5 1,0 0,1 0,2 0,5 1,0 Mô sẹo (%) Sáng 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e Mô sẹo (%) 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e Rễ (%) Tối 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d Số rễ/mẫu 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d Đặc điểm Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết BA 2,4-D 2,4-D 2,4-D 2,4-D 2,4-D NAA NAA NAA 2,0 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 0,1 0,2 0,5 0e 0e 0e 0e 16,6 d 63,3 c 0e 0e 0e 0e 0e 0e 83,3 a 63,3 b 33,3 d 0e 0e 0e 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 31,3 c 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 0d 2,0 c NAA 1,0 86,6 a 0e 75,5 b 6,4 b NAA 2,0 76,6 b 46,6 c 89,9 a 15,5 a Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mô sẹo màu vàng, xốp Mô sẹo màu vàng, xốp Mô sẹo màu nâu Mẫu chết Mẫu chết Rễ ngắn, màu trắng Mơ sẹo màu đen, Rễ màu trắng, phân nhánh Mơ sẹo màu vàng, Rễ nhiều, màu trắng, phân nhánh Ghi chú: Những chữ khác (a, b…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test 3.1.1.3 Ảnh hưởng CĐHSTTV riêng lẻ lên phát sinh hình thái mẫu cuống lTCL_C điều kiện chiếu sáng tối hoàn toàn Các tiêu ghi nhận sau 10 tuần nuôi cấy thể qua bảng 3.4, 3.5 hình 3.4, 3.5 Bảng 3.4 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng riêng lẻ lên phát sinh hình thái mẫu cuống lTCL_C điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày CĐHS TTV Nồng độ (mg/l) Phôi (%) ĐC TDZ TDZ TDZ TDZ TDZ TDZ BA BA BA BA BA 2,4-D 0,01 0,05 0,1 0,2 0,5 1,0 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 0,1 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e Mô sẹo (%) 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 2,4-D 0,2 23 d 2,4-D 0,5 2,4-D 2,4-D Rễ (%) Số rễ/mẫu Đặc điểm 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0c 0c 0c 0c 0c 0c 0c 0c 0c 0c 0c 0c 0c 24,4 d 25,6 d 0,8 c 59,6 c 89,9 b 79,9 a 4,7 ab 1,0 86,3 a 97,7 a 85,5 a 6,2 a 2,0 69,6 b 98,8 a 71 b 4,0 b Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Phơi Mơ sẹo màu nâu đen cứng Phơi tạo thành cụm, hình cầu, hình tim, hai mầm Mô sẹo màu nâu vàng, cứng Rễ dài, màu xanh Phơi nhiều, hình cầu, hình tim, hai mầm thủy lơi Mơ sẹo có màu nâu Rễ nhiều, có màu vàng Phơi phát sinh hai đầu cuống NAA NAA NAA 0,1 0,2 0,5 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0f 0f 0f 0c 0c 0c NAA 1,0 58,6 c 84,4 c 10,6 e 3,1 b NAA 2,0 84,0 a 96,6 a 37,7 c 4,0 b lá, hình tim, hình cầu Mơ sẹo có màu nâu, cứng Rễ màu trắng trong, Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mơ sẹo nhiều, màu tím đặc trưng Phơi có màu tím, trắng, mọc thành cụm Phơi có màu ngả vàng, dạng hình cầu, hình tim Mơ sẹo màu nâu đen, Ghi chú: Những chữ khác (a, b, …) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test Bảng 3.5 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng riêng lẻ lên phát sinh hình thái mẫu cuống lTCL_C điều kiện tối hoàn toàn CĐHST TV Nồng độ (mg/l) Phôi (%) ĐC TDZ TDZ TDZ TDZ TDZ TDZ BA BA BA BA BA 0,01 0,05 0,1 0,2 0,5 1,0 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 0c 0c 0c 0c 0c 0c 0c 0c 0c 0c 0c 0c Mô sẹo (%) 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 0e 2,4-D 0,1 0c 2,4-D 0,2 2,4-D Rễ (%) Số rễ/mẫu Đặc điểm 0g 0g 0g 0g 0g 0g 0g 0g 0g 0g 0g 0g 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 0f 46,6 d 11,0 f 0,34 ef 0c 67,7 c 35,5 de 0,91 d 0,5 49,6 b 84,4 b 41,1 cd 0,51 e 2,4-D 1,0 69,6 a 94,4 a 46,6 c 1,87 c 2,4-D NAA NAA NAA 2,0 0,1 0,2 0,5 0c 0c 0c 0c 0e 0e 0e 0e 0g 0g 0g 31,1 e 0f 0f 0f 0,94 d NAA 1,0 0c 45,5 d 61,1 b 6,09 b NAA 2,0 0c 81 b 94,4a 19,2 a Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mô sẹo có cấu trúc giống phơi Rễ ít, màu vàng Mô sẹo nhiều, màu trắng vàng Rễ màu trắng Phơi ít, có dạng hình cầu Mơ sẹo màu nâu Rễ ít, ngắn Mơ sẹo màu trắng, xốp Rễ trắng Phơi Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Rễ ít, màu trắng Mơ sẹo ít, màu vàng Rễ ngắn, màu trắng đục Mơ sẹo ít, màu vàng Rễ ngắn, nhiều, màu trắng đục Ghi chú: Những chữ khác (a, b, …) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test 11 0,5 2,0 1,0 1,0 Mơ sẹo màu vàng nâu, cứng, Mơ sẹo màu trắng sữa vàng, mềm xốp, nhiều 80,0 d 100 a Ghi chú: Những chữ khác (a, b, …) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test Bảng 3.9 Ảnh hưởng kết hợp 2,4-D BA nồng độ khác lên phát sinh hình thái mẫu tTCL_L điều kiện tối hoàn toàn CĐHSTTV (mg/l) 2,4-D BA 1,0 0,1 1,0 0,2 1,0 0,5 1,0 1,0 1,0 2,0 0,1 1,0 0,2 1,0 0,5 1,0 2,0 1,0 Loại hình thái phát sinh Mơ sẹo (%) Tạo rễ (%) 100 a 27,3 a 100 a 25,5 b 100 a 0c 100 a 0c 93,3 b 0c 73,3 d 0c 80,0 c 0c 93,3 b 0c 93,3 b 0c Đặc điểm Mô sẹo màu trắng sữa vàng, xốp Mô sẹo màu trắng sữa, xốp, nhiều Mô sẹo màu trắng sữa trắng trong, xốp Mô sẹo màu trắng sữa, trắng, mềm xốp Mơ sẹo màu vàng nâu, mềm, Mơ sẹo màu vàng nâu trong, cứng, Mơ sẹo màu vàng nâu, trong, cứng, Mơ sẹo màu trắng sữa, trắng, mềm xốp Mô sẹo màu trắng đỏ nâu, xốp Ghi chú: Những chữ khác (a, b, …) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test Bảng 3.10 Ảnh hưởng kết hợp 2,4-D TDZ nồng độ khác lên phát sinh hình thái mẫu tTCL_L điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày CĐHSTTV (mg/l) 2,4-D 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 0,1 0,2 0,5 2,0 TDZ 0,01 0,05 0,1 0,2 0,5 1,0 0,2 0,2 0,2 0,2 Loại hình thái phát sinh Mơ sẹo (%) 100 a 100 a 100 a 100 a 100 a 100 a 80 b 80 b 100 a 73,3 c Đặc điểm hình thái Mơ sẹo màu trắng vàng, xốp Mô sẹo màu trắng xanh vàng nâu, cứng Mô sẹo màu trắng xanh vàng đỏ, cứng, nhiều Mơ sẹo màu trắng xanh vàng, mềm, Mơ sẹo màu trắng xanh vàng đỏ, cứng, Mơ sẹo màu trắng vàng nâu, mềm xốp Mô sẹo màu trắng xốp xanh cứng, Mơ sẹo màu xanh, cứng, Mơ sẹo màu trắng nâu, xốp Mô sẹo màu trắng xanh vàng nâu, mềm Ghi chú: Những chữ khác (a, b, …) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa v ới α = 0,05 Duncan’s test Bảng 3.11 Ảnh hưởng kết hợp 2,4-D TDZ nồng độ khác lên phát sinh hình thái mẫu tTCL_L điều kiện tối hoàn toàn CĐHSTTV (mg/l) 2,4-D 1,0 1,0 1,0 1,0 TDZ 0,01 0,05 0,1 0,2 Loại hình thái phát sinh Mô sẹo (%) 100 a 100 a 100 a 100 a Đặc điểm hình thái Mơ sẹo màu vàng nâu, mềm xốp Mô sẹo màu trắng sữa vàng, xốp Mô sẹo màu trắng sữa, xốp, nhiều Mô sẹo màu trắng vàng nâu, 12 1,0 1,0 0,1 0,2 0,5 2,0 0,5 1,0 0,2 0,2 0,2 0,2 100 a 86,6 c 80,0 d 93,3 b 93,3 b 0e Mô sẹo màu trắng sữa trắng trong, xốp Mô sẹo màu trắng sữa vàng nâu, mềm, Mơ sẹo màu trắng nâu, mềm, Mơ sẹo màu trắng nâu, mềm Mô sẹo màu trắng sữa vàng nâu, xốp, Mẫu chết Ghi chú: Những chữ khác (a, b, …) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test Bảng 3.12 Ảnh hưởng kết hợp NAA BA nồng độ khác lên phát sinh hình thái mẫu tTCL_L điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày CĐHSTTV (mg/l) NAA 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 0,1 0,2 0,5 2,0 BA 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Loại hình thái phát sinh Mơ sẹo (%) 13,3 c 0d 0d 33,3 b 0d 0d 0d 0d 60 a Đặc điểm Mô sẹo màu xanh, cứng, Mẫu chết Mẫu chết Mơ sẹo màu nâu, phát sinh Mẫu sống chưa cảm ứng Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mô sẹo màu xanh, cứng, Ghi chú: Những chữ khác (a, b, …) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test Bảng 3.13 Ảnh hưởng kết hợp NAA BA nồng độ khác lên phát sinh hình thái mẫu tTCL_L điều kiện tối hoàn toàn CĐHSTTV (mg/l) NAA 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 0,1 0,2 0,5 2,0 BA 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Loại hình thái phát sinh Mô sẹo (%) 40 e 33,3 f 53,3d 93,3 b 13,3 g 0h 0h 90,0 c 100 a Đặc điểm Mô sẹo màu trắng vàng nâu, mềm, Mơ sẹo màu nâu, phát sinh Mô sẹo màu nâu, cứng, phát sinh Mô sẹo màu trắng vàng nâu, mềm Mô sẹo màu vàng nâu, Mẫu sống, khơng cảm ứng Mẫu chết Mơ sẹo màu trắng xanh, vàng nâu, cứng, Mô sẹo màu trắng nâu, mềm Ghi chú: Những chữ khác (a, b, …) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test 3.1.1.6 Ảnh hưởng kết hợp auxin cytokinin lên phát sinh hình thái mẫu cuống tTCL_C điều kiện chiếu sáng tối hoàn toàn Sau 10 tuần nuôi cấy, kết quan sát, ghi nhận so sánh hiệu cặp chất 2,4-D kết hợp với BA, 2,4-D kết hợp với TDZ 13 BA kết hợp với NAA thể bảng 3.14, 3.15, 3.16, 3.17, 3.18, 3.19 hình 3.11, 3.12, 3.13 Bảng 3.14 Ảnh hưởng kết hợp 2,4-D BA nồng độ khác lên phát sinh hình thái mẫu cuống tTCL_L điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày CĐHSTTV (mg/l) 2,4-D 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 0,1 0,2 0,5 2,0 BA 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Loại hình thái phát sinh Mơ sẹo (%) 98,8 a 97,7 a 98,8 a 97,7 a 74,4 c 96,6 a 98,8 a 98,8 a 86,6 b Đặc điểm Mô sẹo xanh, đỏ nâu, cứng, Mơ sẹo màu trắng vàng, mềm Mô sẹo màu vàng, mềm Mô sẹo màu trắng sữa, xanh nâu đỏ, cứng, Mơ sẹo màu vàng nhạt, xốp, Mơ sẹo màu xanh, cứng, Mơ sẹo màu xanh trắng, cứng Mơ sẹo xanh tím vàng tím, cứng, nhiều Mơ sẹo màu vàng, xốp, Ghi chú: Những chữ khác (a, b, …) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test Bảng 3.15 Ảnh hưởng kết hợp 2,4-D BA nồng độ khác lên phát sinh hình thái mẫu cuống tTCL_L điều kiện tối hoàn toàn CĐHSTTV (mg/l) 2,4-D 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 0,2 0,5 2,0 BA 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 1,0 1,0 1,0 Loại hình thái phát sinh Mơ sẹo (%) 97,7 a 98,8 a 97,7 a 97,7 a 98,8 a 96,6 a 97,7 a 96,6 a Đặc điểm Mô sẹo màu vàng nhạt, mềm Mô sẹo màu trắng sữa vàng, xốp, nhiều Mô sẹo màu trắng sữa vàng nhạt, xốp Mơ sẹo màu vàng nhạt, nâu vàng, xốp, Mơ sẹo màu vàng nhạt, nâu vàng, xốp,ít Mơ sẹo màu vàng nâu, mềm Mô sẹo màu trắng sữa vàng, mềm, xốp Mơ sẹo màu vàng, mềm, Ghi chú: Những chữ khác (a, b, …) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test Bảng 3.16 Ảnh hưởng kết hợp 2,4-D TDZ nồng độ khác lên phát sinh hình thái mẫu cuống tTCL_C điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày CĐHSTTV (mg/l) 2,4-D 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 TDZ 0,01 0,05 0,1 0,2 0,5 Loại hình thái phát sinh Mô sẹo (%) 100 a 100 a 100 a 100 a 100 a Đặc điểm Mô sẹo màu trắng xanh, mềm xốp Mô sẹo màu vàng nâu, mềm, Mơ sẹo màu trắng sữa vàng, xốp, nhiều Mô sẹo màu trắng sữa vàng, xốp, Mô sẹo màu trắng, nâu xanh, phát sinh không 14 1,0 0,1 1,0 0,2 100 a 100 a 0,2 0,2 86,6 b 0,5 2,0 0,2 0,2 100 a 0c đồng đều, Mơ sẹo màu trắng sữa vàng, xốp Mơ sẹo màu xanh, cứng, kích thước nhỏ Mô sẹo màu xanh vàng nâu, dạng cứng mềm khơng đồng đều, Mơ sẹo màu trắng sữa vàng, xốp Mẫu chết Ghi chú: Những chữ khác (a, b, …) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test Bảng 3.17 Ảnh hưởng kết hợp 2,4-D TDZ nồng độ khác lên phát sinh hình thái mẫu cuống tTCL_C điều kiện tối hoàn toàn CĐHSTTV (mg/l) 2,4-D 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 0,1 0,2 0,5 2,0 TDZ 0,01 0,05 0,1 0,2 0,5 1,0 0,2 0,2 0,2 0,2 Loại hình thái phát sinh Mơ sẹo (%) 100 a 100 a 100 a 100 a 100 a 100 a 93,3 c 93,3 c 79,9 c 100 a Đặc điểm Mô sẹo màu trắng vàng nâu, mềm Mô sẹo màu vàng nâu, mềm Mô sẹo màu trắng sữa vàng, xốp, nhiều Mô sẹo màu vàng trong, mềm Mô sẹo màu vàng đỏ nâu, mềm Mơ sẹo màu đỏ nâu, mềm, Mơ sẹo màu vàng nâu, cứng, Mơ sẹo màu vàng, mềm, Mô sẹo màu trắng vàng, xốp Mô sẹo màu trắng sữa, xốp, Ghi chú: Những chữ khác (a, b, …) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test Bảng 3.18 Ảnh hưởng kết hợp NAA BA nồng độ khác lên phát sinh hình thái mẫu cuống tTCL_C điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày CĐHSTTV (mg/l) NAA 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 0,1 0,2 0,5 2,0 BA 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Loại hình thái phát sinh Mơ sẹo (%) 100 a 100 a 100 a 100 a 100 a 0c 0c 0c 86,6 b Đặc điểm Mô sẹo chết Mô sẹo chết Mô sẹo màu trắng vàng, cứng, nhiều Mô sẹo màu trắng vàng, cứng Mô sẹo màu vàng nâu cứng Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mơ sẹo màu vàng nâu, cứng, Ghi chú: Những chữ khác (a, b, …) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test 15 Bảng 3.19 Ảnh hưởng kết hợp NAA BA nồng độ khác lên phát sinh hình thái mẫu cuống tTCL_C điều kiện tối hoàn toàn CĐHSTTV (mg/l) NAA 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 0,1 0,2 0,5 2,0 BA 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Loại hình thái phát sinh Mô sẹo (%) 100 a 100 a 100 a 100 a 100 a 0b 100 a 100 a 100 a Đặc điểm Mô sẹo màu vàng nâu, mềm, Mơ sẹo màu trắng sữa vàng, xốp, Mơ sẹo màu vàng nâu, mềm, Mơ sẹo màu vàng nâu, mềm, Mơ sẹo màu vàng nâu, mềm, Mẫu chết Mơ sẹo màu vàng nâu, mềm, Mơ sẹo màu vàng nâu, mềm, Mơ sẹo màu vàng nâu, mềm, Ghi chú: Những chữ khác (a, b, …) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test 3.1.1.7 Ảnh hưởng kết hợp auxin cytokinin lên phát sinh hình thái mẫu cuống lTCL_C điều kiện chiếu sáng tối hoàn toàn Kết ghi nhận sau 10 tuần nuôi cấy thể từ bảng 3.20 đến 3.25 hình 3.14, 3.15, 3.16 Bảng 3.20 Ảnh hưởng kết hợp 2,4-D BA nồng độ khác lên phát sinh hình thái mẫu cuống lTCL_C điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày CĐHSTTV (mg/l) Loại hình thái phát sinh Mô sẹo Tạo phôi (%) 2,4-D BA (%) 1,0 0,1 100 a 24,4 c 1,0 0,2 93,3 b 48,8 a 1,0 0,5 86,6 c 31,0 b 1,0 1,0 66,7 d 0d 1,0 0,1 0,2 0,5 2,0 1,0 1,0 1,0 13,3 e 86,6 c 100 a 93,3 b 2,0 1,0 100 a 0d 0d 0d 0d 0d Đặc điểm Mô sẹo màu nâu đỏ, xanh, vàng, cứng, Mơ sẹo màu trắng sữa, đỏ, xốp, phân bố đồng Mô sẹo màu xanh, đỏ, trắng đục, cứng, Mơ sẹo màu đỏ, nâu vàng, xanh nhạt, ít, phân bố khơng đồng Mơ sẹo màu vàng nhạt, đỏ, Cảm ứng mơ sẹo Mơ sẹo màu nâu, cứng, Mơ sẹo màu vàng, xanh, phát sinh đầu vị trí cắt Mơ sẹo màu trắng sữa vàng, xốp, phát sinh đầu vị trí cắt khắp bề mặt mẫu, nhiều vụn Ghi chú: Những chữ khác (a, b, …) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test Bảng 3.21 Ảnh hưởng kết hợp 2,4-D BA nồng độ khác lên phát sinh hình thái mẫu cuống lTCL_C điều kiện tối hồn tồn 16 CĐHSTTV (mg/l) Loại hình thái phát sinh Mô sẹo Tạo phôi (%) (%) 2,4-D BA 1,0 0,1 100 a 0b 1,0 1,0 1,0 1,0 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 1,0 100 a 100 a 100 a 100 a 46,7 d 21,0a 0b 0b 0b 0b 0,2 1,0 80,0 c 0b 0,5 1,0 93,3 b 0b 2,0 1,0 100 a 0b Đặc điểm Mô sẹo màu nâu, nâu vàng, trắng sữa, xốp, mô sẹo phân bố không đồng Mô sẹo màu trắng sữa, xốp, nhiều Mô sẹo màu trắng sữa, xốp, phân bố không đồng Mô sẹo màu trắng sữa vàng, xốp, Mơ sẹo màu vàng nhạt, xốp Mô sẹo màu nâu, cứng, Mô sẹo màu nâu vàng, cứng, phát sinh đầu vị trí cắt rải rác bề mặt mẫu Mô sẹo màu trắng sữa, xốp, phát sinh chủ yếu đầu vị trí cắt rải rác bề mặt mẫu Mô sẹo màu vàng nâu, xốp, Ghi chú: Những chữ khác (a, b, …) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test Bảng 3.22 Ảnh hưởng kết hợp 2,4-D TDZ nồng độ khác lên phát sinh hình thái mẫu cuống lTCL_C điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày CĐHSTTV (mg/l) 2,4-D TDZ Loại hình thái phát sinh Mơ sẹo (%) 1,0 0,01 86,6 c 1,0 0,05 93,3 b 1,0 0,1 93,3 b 1,0 0,2 100 a 1,0 0,5 100 a 1,0 1,0 93,3 b 0,1 0,2 73,3 d 0,2 0,2 73,3 d 0,5 0,2 93,3 b 2,0 0,2 0e Đặc điểm Mô sẹo màu trắng sữa, trắng trong, mềm, ít, phát sinh chủ yếu đầu vị trí cắt Mơ sẹo phát sinh ít, bề mặt mẫu có màu trắng sữa, xốp Mô sẹo đầu màu nâu đỏ, mềm Mô sẹo màu trắng xanh trắng trong, cứng Mô sẹo màu trắng sữa nâu đỏ, mềm xốp, kích thước lớn Mơ sẹo phát sinh đầu bề mặt mẫu Mô sẹo màu trắng xanh, cứng, phát sinh đầu mẫu cấy Mô sẹo màu trắng sữa, xốp nâu đỏ, mềm, phát sinh không đồng đầu Mô sẹo màu xanh, cứng, phát sinh đầu mẫu cấy Mơ sẹo màu trắng sữa, xốp, vụn, phát sinh chủ yếu đầu Mô sẹo màu trắng xanh, xốp, nhiều, phát sinh đầu rải rác bề mặt Mẫu chết Ghi chú: Những chữ khác (a, b, …) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa v ới α = 0,05 Duncan’s test Bảng 3.23 Ảnh hưởng kết hợp 2,4-D TDZ nồng độ khác lên phát sinh hình thái mẫu cuống lTCL_C điều kiện tối hoàn toàn CĐHSTTV (mg/l) 2,4-D TDZ 1,0 0,01 Loại hình thái phát sinh Mô sẹo (%) 93,3 b Đặc điểm Mô sẹo màu trắng sữa, xốp vàng nâu, mềm, phát sinh nhiều 17 1,0 0,05 100 a 1,0 0,1 100 a 1,0 0,2 100 a 1,0 0,5 93,3 b 1,0 1,0 86,6 c 0,1 0,2 0e 0,2 0,2 80,0 d 0,5 0,2 100 a 2,0 0,2 86,6 c đầu Mô sẹo màu trắng sữa vàng, xốp, phát sinh chủ yếu đầu mẫu cấy Mô sẹo màu trắng sữa trắng trong, xốp, nhiều, phát sinh đầu bề mặt mẫu Mô sẹo màu trắng sữa vàng nâu, mềm xốp, phát sinh không đồng đầu Mô sẹo màu trắng sữa vàng, xốp, nhiều, phát sinh chủ yếu đầu Mô sẹo màu trắng vàng, mềm xốp, phát sinh đầu bề mặt mẫu Mẫu sống chưa cảm ứng Mô sẹo màu trắng vàng nâu, mềm, phát sinh đầu bề mặt mẫu Mô sẹo màu trắng vàng nâu, mềm xốp, phát sinh đầu bề mặt mẫu Mơ sẹo màu vàng nâu, mềm, phát sinh đầu mẫu Ghi chú: Những chữ khác (a, b, …) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test Bảng 3.24 Ảnh hưởng kết hợp NAA BA nồng độ khác lên phát sinh hình thái mẫu cuống lTCL_C điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày CĐHSTTV (mg/l) NAA BA Loại hình thái phát sinh Mơ sẹo (%) Đặc điểm 1,0 0,1 60,0 c Mô sẹo màu xanh nâu, cứng, phát sinh đầu mẫu cấy 1,0 0,2 53,3 d Mô sẹo màu xanh, cứng, phát sinh đầu mẫu cấy 1,0 0,5 13,3 f Mô sẹo màu nâu, phát sinh 1,0 1,0 46,6 e Mô sẹo màu nâu, cứng, phát sinh đầu mẫu 1,0 2,0 80,0 b Mô sẹo màu xanh vàng nâu, cứng, phát sinh đầu rải rác bề mặt mẫu 0,1 1,0 0g Mẫu chết 0,2 1,0 0g Mẫu chết 0,5 1,0 0g 2,0 1,0 93,3 a Mẫu chết Mô sẹo màu trắng vàng nâu, cứng, phát sinh chủ yếu đầu rải rác bề mặt mẫu Ghi chú: Những chữ khác (a, b, …) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test 18 Bảng 3.25 Ảnh hưởng kết hợp NAA BA nồng độ khác lên phát sinh hình thái mẫu cuống lTCL_C điều kiện tối hoàn toàn CĐHSTTV (mg/l) Loại hình thái phát sinh Rễ bất định NAA BA Mô sẹo (%) 1,0 0,1 1,0 Đặc điểm Rễ (%) Số rễ/mẫu 86,6 c 80,0 b 1,1 b 0,2 100 a 93,3 a 3,9 a 1,0 0,5 93,3 b 7,7 c 0c 1,0 1,0 86,6 c 0d 0c Mơ sẹo màu vàng, mềm, ít, phần lớn phát sinh đầu mẫu 1,0 2,0 86,6 c 0d 0c Mô sẹo màu vàng nâu, mềm, phát sinh đầu mẫu cấy 0,1 1,0 0d 0d 0c Mẫu chết 0,2 1,0 0d 0d 0c Mẫu chết 0,5 1,0 0d 0d 0c Mẫu sống chưa cảm ứng 2,0 1,0 100 a 0d 0c Mô sẹo màu trắng sữa trắng trong, mềm xốp, nhiều đầu bề mặt mẫu Mô sẹo màu vàng nâu, mềm, phát sinh nhiều đầu rải rác bề mặt mẫu Rễ nhỏ, dài, màu trắng sữa Mô sẹo màu vàng vàng nâu, mềm, phát sinh đầu bề mặt mẫu Rễ nhỏ, dài, màu trắng sữa Mô sẹo màu trắng vàng, mềm, Rễ nhỏ, ngắn, màu trắng sữa Ghi chú: Những chữ khác (a, b, …) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test 3.1.1.8 Ảnh hưởng kết hợp auxin cytokinin lên phát sinh hình thái mẫu thân rễ tTCL_R điều kiện chiếu sáng tối hoàn toàn Sau 10 tuần nuôi cấy, kết ghi nhận bảng 3.26 đến 3.31 hình 3.17, 3.18, 3.19 Bảng 3.26 Ảnh hưởng kết hợp 2,4-D BA nồng độ khác lên phát sinh hình thái mẫu thân rễ tTCL_R điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày CĐHSTTV (mg/l) 2,4-D BA 1,0 0,1 1,0 0,2 1,0 0,5 1,0 1,0 Loại hình thái phát sinh Mô sẹo (%) 100 a 100 a 100 a 100 a Đặc điểm Mô sẹo màu trắng nâu vàng, cứng, nhiều Mô sẹo màu trắng vàng nâu, cứng, nhiều Mô sẹo màu trắng sữa, xốp, nhiều Mô sẹo màu trắng sữa, mềm, nhiều 19 1,0 0,1 0,2 0,5 2,0 2,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Mô sẹo màu trắng xanh, vàng nhạt, xốp Mô sẹo màu nâu đen, cứng, Mơ sẹo màu vàng nâu, cứng, Mơ sẹo màu vàng nâu, mềm xốp, Mơ sẹo màu trắng sữa vàng, cứng, 100 a 34,4 e 66,6 c 50 d 72,2 b Ghi chú: Những chữ khác (a, b, …) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test Bảng 3.27 Ảnh hưởng kết hợp 2,4-D BA nồng độ khác lên phát sinh hình thái mẫu thân rễ tTCL_R điều kiện tối hoàn toàn CĐHSTTV (mg/l) 2,4-D BA 1,0 0,1 1,0 0,2 1,0 0,5 1,0 1,0 1,0 2,0 0,1 1,0 0,2 1,0 0,5 1,0 2,0 1,0 Loại hình thái phát sinh Mơ sẹo (%) 100 a 100 a 100 a 100 a 100 a 13,3 e 73,3 d 83,3 c 86,6 b Đặc điểm Mô sẹo màu trắng, vàng, cứng, nhiều Mô sẹo màu trắng sữa, vàng, cứng, nhiều Mô sẹo màu trắng sữa, xốp, nhiều Mô sẹo màu trắng sữa, xốp, nhiều Mô sẹo màu vàng trắng sữa, xốp, nhiều Mô sẹo màu vàng, cứng, Mơ sẹo màu vàng nâu, cứng, Mơ sẹo có màu trắng sữa, vàng nâu, cứng, Mơ sẹo màu vàng trắng, cứng, Ghi chú: Những chữ khác (a, b, …) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test Bảng 3.28 Ảnh hưởng kết hợp 2,4-D TDZ nồng độ khác lên phát sinh hình thái mẫu thân rễ tTCL_R điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày CĐHSTTV (mg/l) 2,4-D TDZ 1,0 0,01 1,0 0,05 1,0 0,1 1,0 0,2 1,0 0,5 1,0 1,0 Loại hình thái phát sinh Mơ sẹo (%) Chồi (%) 100 a 0b 100 a 0b 100 a 0b 100 a 0b 86,6 b 0b 86,6 b 0b 0,1 0,2 33,3 d 42 a 0,2 0,2 33,3 d 42 a 0,5 0,2 86,7 b 0b 2,0 0,2 80,0 c 0b Đặc điểm Mơ sẹo có màu trắng Mơ sẹo màu trắng vàng nâu, mềm, Mơ sẹo màu trắng xanh, cứng, nhiều Mô sẹo màu trắng sữa vàng, xốp Mô sẹo màu trắng sữa nâu, xốp Mô sẹo màu vàng nâu trắng xanh, mềm xốp Mẫu màu đen, cứng; Một vài mẫu phát sinh chồi, chồi có màu xanh trắng Mẫu màu đen, cứng; Một vài mẫu phát sinh chồi, chồi có màu xanh trắng Mô sẹo màu trắng sữa, xốp, viền có màu vàng nâu, cứng Mơ sẹo màu trắng sữa, màu vàng, cứng Ghi chú: Những chữ khác (a, b, …) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test 20 Bảng 3.29 Ảnh hưởng kết hợp 2,4-D TDZ nồng độ khác lên phát sinh hình thái mẫu thân rễ tTCL_R điều kiện tối hoàn toàn CĐHSTTV (mg/l) 2,4-D TDZ 1,0 0,01 1,0 0,05 1,0 0,1 1,0 0,2 1,0 0,5 1,0 1,0 0,1 0,2 0,2 0,2 0,5 0,2 2,0 0,2 Loại hình thái phát sinh Mô sẹo (%) 100 a 100 a 100 a 100 a 93,3 b 80,0 c 33,3 d 80,0 c 93,3 b 93,3 b Đặc điểm Mô sẹo màu trắng sữa vàng nâu, xốp, nhiều Mô sẹo màu trắng sữa vàng, xốp, nhiều Mô sẹo màu trắng sữa vàng nâu, xốp Mô sẹo màu vàng nâu, mềm Mô sẹo màu trắng vàng nâu, mềm xốp, Mơ sẹo màu trắng vàng nâu, Mơ sẹo màu vàng, cứng, Mơ sẹo màu vàng, xốp Mô sẹo màu trắng sữa, vàng, mềm, nhiều Mơ sẹo màu trắng sữa, mềm, Ghi chú: Những chữ khác (a, b, …) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test Bảng 3.30 Ảnh hưởng kết hợp NAA BA nồng độ khác lên phát sinh hình thái mẫu thân rễ tTCL_R điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày CĐHSTTV (mg/l) NAA BA 1,0 0,1 1,0 0,2 1,0 0,5 1,0 1,0 1,0 2,0 0,1 1,0 0,2 1,0 0,5 1,0 2,0 1,0 Loại hình thái phát sinh Mô sẹo (%) 100 a 86,6 b 86,6 b 80,0 c 50 e 0f 0f 0f 73,3 d Đặc điểm Mô sẹo màu trắng xanh, cứng, nhiều Mô sẹo màu xanh, trắng, vàng viền, cứng, Mơ sẹo màu xanh, cứng, Mơ sẹo màu xanh nâu, cứng, Mơ sẹo màu nâu đen, trắng, cứng, Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mô sẹo màu vàng xanh, cứng, Ghi chú: Những chữ khác (a, b, …) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test Bảng 3.31 Ảnh hưởng kết hợp NAA BA nồng độ khác lên phát sinh hình thái mẫu thân thân rễ tTCL_R điều kiện tối hoàn toàn CĐHSTTV (mg/l) NAA BA 1,0 0,1 1,0 0,2 1,0 0,5 1,0 1,0 1,0 2,0 0,1 1,0 Loại hình thái phát sinh Mô sẹo (%) 100 a 86,7 c 80,0 d 80,0 d 73,3 e 0g Đặc điểm Mô sẹo màu trắng, vàng, mềm, Mơ sẹo màu nâu xung quanh, mềm, Mơ sẹo màu trắng, nâu xung quanh, Mơ sẹo màu vàng nâu, trắng, mềm, Mơ sẹo có màu vàng nâu, Mẫu chết 21 0,2 0,5 2,0 1,0 1,0 1,0 Mẫu chết Mô sẹo màu nâu đen Mơ sẹo màu trắng vàng, cứng 0g 33,3 f 93,3 b Ghi chú: Những chữ khác (a, b, …) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa với α = 0,05 Duncan’s test 3.1.1.9 Quan sát thay đổi phát sinh hình thái phơi vơ tính sâm Ngọc Linh Kết giải phẫu hình chụp soi hình dạng phát triển phơi cho thấy phôi thu nhận từ nghiệm thức khác biệt hình thái tồn dạng hình cầu, hình tim, hình thủy lơi hình hai mầm 3.1.1.10 Tạo hồn chỉnh từ phơi vơ tính Sau tuần ni cấy, thu có củ, phát triển đồng đều, hình thái bình thường có cấu trúc giống với sinh trưởng tự nhiên 3.1.2 Nghiên cứu sinh trưởng phát triển in vitro điều kiện sinh thái khác 3.1.2.1 Quá trình sinh trưởng phát triển sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro đem trồng Quảng Nam Bảng 3.33 Kết khảo sát tỷ lệ sống sót, sinh trưởng phát triển sâm Ngọc Linh in vitro giai đoạn vườn ươm khu vực núi Ngọc Linh, tỉnh Quảng Nam Thời gian điều tra 06 tháng sau trồng năm sau trồng 1,5 năm sau trồng năm sau trồng Tỷ lệ sống sót (%) 93 91 90 90 Tỷ lệ nảy mầm (%) 66 78 87 87 Hình thành củ (%) 20 45 70 100 Ghi chú: tỷ lệ % mọc hình thành củ nhánh tính theo tỷ lệ sống 3.1.2.2 Nghiên cứu trình sinh trưởng phát triển sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro Khu vực cổng trời, vườn quốc gia Biđoup Núi Bà, Lâm Đồng 22 Bảng 3.34 Kết khảo sát tỷ lệ sống sót sinh trưởng sâm Ngọc Linh in vitro tại khu vực Cổng Trời, Vườn quốc gia Bidoup Núi Bà Lâm Đồng Thời gian điều tra 06 tháng sau trồng 1năm sau trồng 1,5 năm sau trồng năm sau trồng Tỷ lệ sống sót (%) 70 60 50 50 Tỷ lệ nảy mầm (%) 30 40 50 50 Hình thành củ (%) 20 30 50 Ghi chú: tỷ lệ % mọc hình thành củ nhánh tính theo tỷ lệ sống 3.1.3 Định tính định lượng saponin sâm Ngọc Linh in vitro sâm Ngọc Linh giai đoạn vườn ươm 3.1.3.1 Định tính saponin sâm in vitro, sâm tháng, năm năm trồng núi Ngọc Linh Kết phân tích sắc lớp mỏng cho thấy mẫu sâm Ngọc Linh có nguồn gốc từ ni cấy lớp mỏng tế bào (cây sâm in vitro, sâm tháng tuổi, năm tuổi năm tuổi) có xuất vết saponin Rg1, Rb1, MR2 mỏng chạy dung môi cloroform:methanol:nước = 65:35:10 Điều chứng tỏ sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro ex vitro có diện đầy đủ loại Rg1, Rb1, MR2 Như vậy, kết định tính cho thấy mẫu có chứa saponin 3.1.3.2 Định lượng saponin sâm in vitro, sâm tháng tuổi, năm tuổi năm trồng núi Ngọc Linh Bảng 3.35 Hàm lượng saponin sâm in vitro ex vitro Mẫu (cây in vitro) Rg1 (%) 0,68 Rb1 (%) 0,51 MR2 (%) 0,97 Tổng (%) 2,17 (cây tháng tuổi) 0,11 0,11 0,47 0,70 (cây năm tuổi) 0,96 0,85 0,87 2,69 (cây năm tuổi) 1,02617 1,74 0,77 3,54 23 KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ Kết luận Mẫu tTCL_L cho khả phát sinh phôi trực tiếp số phôi cao (89,6%; 29 phôi/mẫu) nuôi cấy môi trường bổ sung mg/l NAA điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày Mẫu cuống lTCL_C, mẫu tTCL_L ni cấy mơi trường có bổ sung 1,0 2,0 mg/l 2,4-D điều kiện chiếu sáng tối cho tỷ lệ phát sinh mô sẹo cao (97,7%; 98,8%) Mẫu thân rễ tTCL_R nuôi cấy môi trường bổ sung mg/l NAA điều kiện tối cho tỷ lệ phát sinh rễ 98,8% 21,7 rễ/mẫu Tỷ lệ tái sinh chồi cao 42% nguồn mẫu thân rễ tTCL_R nuôi cấy môi trường bổ sung 0,2 mg/l TDZ kết hợp với 0,2 mg/l 2,4-D điều kiện sáng Mẫu tTCL_L, cuống tTCL_C lTCL_C, thân rễ tTCL_R ni cấy mơi trường có bổ sung 2,4-D kết hợp với BA TDZ nồng độ khác điều kiện sáng tối hồn tồn cho khả phát sinh mơ sẹo cao Phôi thu tất nghiệm thức khơng có khác biệt hình thái tồn dạng hình cầu, hình tim, hình thủy lơi hình hai mầm Phơi cấy vào mơi trường SH có bổ sung mg/l BA, 0,5 mg/l NAA, 50 g/l sucrose, g/l agar, g/l than hoạt tính ni cấy điều kiện chiếu sáng 16h/ngày có củ to, phát triển, hình thái bình thường có cấu trúc giống với sinh trưởng tự nhiên Đề tài thu 10.000 giống sâm Ngọc Linh Tỷ lệ sống đạt cao (90%); tỷ lệ hình thành sau thời gian ngủ (87%) đặc biệt năm tuổi có hình thành củ nhánh 100% có xu phát triển thành bụi trồng núi Ngọc Linh, xã Trà Linh, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam Còn trồng Bidoup Núi Bà tỷ lệ sống đạt 70%, tỷ lệ mọc sau thời gian ngủ đông đạt 30% 24 trình phát triển hệ rễ chậm so với trồng Quảng Nam Hàm lượng saponin tổng thu cao năm tuổi trồng núi Ngọc Linh tương ứng (3,54%) Đề nghị Khảo sát thêm vị trí mẫu cách đặt mẫu cấy lên khả phát sinh hình thái Tiếp tục theo dõi tiêu sinh trưởng phân tích hàm lượng saponin tích lũy sâm Ngọc Linh có nguồn gốc từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào độ tuổi khác NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Những nghiên cứu trước đối tượng sâm Ngọc Linh chủ yếu phát sinh hình thái gián tiếp qua mô sẹo Điều làm kéo dài thời gian nuôi cấy làm giảm hiệu kinh tế Việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL) phát sinh hình thái tất nguồn mẫu (lá, cuống lá, thân rễ) đối tượng sâm Ngọc Linh in vitro, đề tài thu kết khả quan q trình phát sinh trực tiếp phơi vơ tính, chồi, rễ bất định mô sẹo từ mẫu cấy Đây hướng hiệu việc tái sinh sâm Ngọc Linh in vitro - Xác định mơi trường ni cấy thích hợp cho khả phát sinh phôi từ lá, tái sinh chồi từ thân rễ nhằm phục vụ cho vi nhân giống - Đề tài thu 10.000 sâm Ngọc Linh từ phôi ni cấy in vitro có khả phát triển tốt điều kiện tự nhiên (vùng núi Ngọc Linh thuộc tỉnh Quảng Nam khu vực Cổng trời Vườn quốc gia Bidoup Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng) - Xây dựng quy trình nhân giống sâm Ngọc Linh từ kỹ thuật nuôi cấy TCL tăng khả sống sót từ phơi có nguồn gốc từ ni cấy TCL 25 CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Vũ Thị Hiền, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Phúc Huy, Nguyễn Bá Nam, Bùi Văn Thế Vinh, Thái Xuân Du, Dương Tấn Nhựt 2014 Phát sinh phôi trực tiếp từ lá, cuống thân rễ sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Tạp chí Sinh học, 36(1SE): 277-282 Vũ Thị Hiền, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Phúc Huy, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Thị Kim Loan, Nguyễn Thanh Sang, Vũ Thị Thủy, Nguyễn Hồng Hoàng, Thái Xuân Du, Dương Tấn Nhựt 2015 Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào nghiên cứu trình phát sinh hình thái sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro Tạp chí Khoa học Phát triển, 13(4): 661-669 Vu Thi Hien, Nguyen Phuc Huy, Bui Van The Vinh, Hoang Xuan Chien, Hoàng Thanh Tung, Nguyen Ba Nam, Vu Quoc Luan, Duong Tan Nhut 2015 Somatic embryogenesis from leaf transverse thin cell layer derived-callus of Vietnamese giseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 13(4): 1-11 Duong Tan Nhut, Hoang Thanh Tung, Vu Thi Hien, Nguyen Ba Nam, Nguyen Phuc Huy, Vu Quoc Luan 2016 Assessment of the possibility of flowering, fruiting and saponin accumulation of somatic embryo-derived Panax vietnamensis Ha et Grushv plants growing in kon tum and quang nam Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 14(1A): 263-268 Duong Tan Nhut, Nguyen Phuc Huy, Ngo Thanh Tai, Nguyen Ba Nam, Vu Quoc Luan, Vu Thi Hien, Hoang Thanh Tung, Bui The Vinh, Tran Cong Luan 2015 Light-emitting diodes and their potential in callus growth, plantlet development and saponin accumulation during somatic embryogenesis of Panax vietnamensis Ha et Grushv Biotechnology and Biotechnological Equipment, 29(2): 299-308 ... để thu hoạch Chính vậy, đề tài Nghiên cứu q trình tái sinh nhân giống in vitro sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào tiến hành với mục đích thu... saponin sâm Ngọc Linh in vitro sâm Ngọc Linh giai đoạn vườn ươm 3.1.3.1 Định tính saponin sâm in vitro, sâm tháng, năm năm trồng núi Ngọc Linh Kết phân tích sắc ký lớp mỏng cho thấy mẫu sâm Ngọc Linh. .. Sâm; (2) Sơ lược sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.); (3) Kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào; (4) Các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh hình thái; (5) Các chất điều hòa sinh trưởng thực

Ngày đăng: 20/06/2018, 16:22

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan