Ảnh hưởng của 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), -naphthaleneacetic acid (NAA), thành phần khoáng, giá thể, nguồn mẫu, điều kiện nuôi cấy lên sự cảm ứng, tăng sinh mô sẹo “xốp” và bước đầu nuôi cấy huyền phù tế bào cây sâm Ngọc Linh đã được trình bày trong nghiên cứu này. Kết quả cho thấy, mẫu cấy cảm ứng và tăng sinh tạo thành mô sẹo “xốp” với tỷ lệ tạo mô sẹo, khối lượng tươi, khối lượng khô cao nhất ở nồng độ kết hợp giữa 1,0 mg/l 2,4-D và 1,0 mg/l NAA và cao gấp 1,6 lần so với khi chỉ bổ sung riêng rẽ 2,4-D. Môi trường khoáng MS là thích hợp cho mẫu cấy cảm ứng và tăng sinh tạo thành mô sẹo “xốp”. Mặc dù, mẫu cấy tăng sinh tốt trên giá thể gelrite và agar, tuy nhiên, agar vẫn là giá thể phù hợp được chọn nhằm tiết kiệm chi phí nhưng vẫn đạt hiệu quả cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” cao. Mẫu cuống lá được nuôi cấy ở điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày cho khả năng cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” tốt nhất. Để tạo huyền phù tế bào, sau 8 tuần nuôi cấy, các mô sẹo “xốp”, mọng nước được dùng làm nguyên liệu nuôi cấy dịch huyền phù tế bào bằng cách cấy chuyền sang môi trường MS lỏng có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D, 1,0 mg/l NAA, 30 g/l sucrose và được lắc ở tốc độ 100 vòng/phút. Huyền phù tế bào tăng sinh nhanh và thu được sinh khối lớn nhất vào ngày thứ 14 (23,67 mg/ml).
Trang 1ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN KHẢ NĂNG TĂNG SINH MÔ SẸO
“XỐP” VÀ BƯỚC ĐẦU NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO SÂM NGỌC LINH
(Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
Lê Kim Cương, Hoàng Xuân Chiến, Nguyễn Bá Nam, Trịnh Thị Hương, Dương Tấn Nhựt*
Viện Sinh học Tây Nguyên, (*)duongtannhut@gmail.com
TÓM TẮT: Ảnh hưởng của 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), -naphthaleneacetic acid (NAA),
thành phần khoáng, giá thể, nguồn mẫu, điều kiện nuôi cấy lên sự cảm ứng, tăng sinh mô sẹo “xốp” và bước đầu nuôi cấy huyền phù tế bào cây sâm Ngọc Linh đã được trình bày trong nghiên cứu này Kết quả cho thấy, mẫu cấy cảm ứng và tăng sinh tạo thành mô sẹo “xốp” với tỷ lệ tạo mô sẹo, khối lượng tươi, khối lượng khô cao nhất ở nồng độ kết hợp giữa 1,0 mg/l 2,4-D và 1,0 mg/l NAA và cao gấp 1,6 lần so với khi chỉ bổ sung riêng rẽ 2,4-D Môi trường khoáng MS là thích hợp cho mẫu cấy cảm ứng và tăng sinh tạo thành mô sẹo “xốp” Mặc dù, mẫu cấy tăng sinh tốt trên giá thể gelrite và agar, tuy nhiên, agar vẫn là giá thể phù hợp được chọn nhằm tiết kiệm chi phí nhưng vẫn đạt hiệu quả cảm ứng và tăng sinh mô sẹo
“xốp” cao Mẫu cuống lá được nuôi cấy ở điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày cho khả năng cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” tốt nhất Để tạo huyền phù tế bào, sau 8 tuần nuôi cấy, các mô sẹo “xốp”, mọng nước được dùng làm nguyên liệu nuôi cấy dịch huyền phù tế bào bằng cách cấy chuyền sang môi trường MS lỏng có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D, 1,0 mg/l NAA, 30 g/l sucrose và được lắc ở tốc độ 100 vòng/phút Huyền phù tế bào tăng sinh nhanh và thu được sinh khối lớn nhất vào ngày thứ 14 (23,67 mg/ml)
Từ khóa: Panax vietmamensis, 2,4-D, huyền phù tế bào, mô sẹo “xốp”, NAA, tăng sinh mô sẹo
MỞ ĐẦU
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.) là một trong những cây dược liệu quý
cần được bảo tồn có trong Sách Đỏ Việt Nam
2007 [5] Sâm Ngọc Linh chứa 52 loại saponin,
17 acid amin, 20 chất khoáng vi lượng, 0,1%
tinh dầu Tại hội nghị quốc tế về sâm, loài sâm
này được xếp vào nhóm các loài sâm quý trên
thế giới cùng với sâm Triều Tiên (Panax
ginseng), sâm Mỹ (Panax quinquefolium)
[21] Hiện nay, nguồn cung cấp sâm Ngọc Linh
còn rất hạn chế do loài sâm này chỉ được trồng
tập trung ở vùng núi Ngọc Linh và thời gian từ
lúc trồng từ hạt cho đến khi thu được củ lên đến
5-6 năm Chính vì hàm lượng dược tính cao, giá
trị kinh tế lớn mà sâm Ngọc Linh đã sớm cạn
kiệt và đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng
do việc khai thác quá mức Do đó, yêu cầu tìm
ra những kỹ thuật mới giúp thu được sinh khối
sâm nhanh và hiệu quả đang trở nên bức thiết
Hướng nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh
học trong nhân sinh khối các loài sâm khác đã
được mở rộng như thu nhận sinh khối rễ sâm
Triều Tiên (Panax ginseng) [13], thu nhận sinh
khối từ huyền phù tế bào sâm Triều Tiên
(Panax ginseng) [25], thu nhận sinh khối từ
huyền phù tế bào trên cây sâm Hoa Kỳ (Panax
quinquefolium) [28] Tuy nhiên, đối với sâm
Ngọc Linh thì các nghiên cứu về việc thu nhận
sinh khối từ huyền phù tế bào còn hạn chế
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung vào việc khảo sát các yếu tố như chất điều hòa sinh trưởng thực vật, thành phần chất dinh dưỡng, giá thể, nguồn mẫu cấy, điều kiện nuôi cấy lên sự cảm ứng, tăng sinh mô sẹo “xốp” và bước đầu sử dụng nguồn mô sẹo “xốp” này để nuôi cấy dịch huyền phù tế bào cây sâm Ngọc
Linh (Panax vietnamensis) với mục tiêu tạo
nguồn nguyên liệu ban đầu cho việc nhân giống
in vitro; thu sinh khối tế bào ở quy mô công
nghiệp, cung cấp nguồn nguyên liệu ổn định cho ngành sản xuất dược liệu ở nước ta; đồng thời, phục vụ cho các nghiên cứu sâu hơn ở mức
độ tế bào: dung hợp tế bào trần, chuyển gien… trên đối tượng sâm Ngọc Linh
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu
Nguồn mẫu Nguồn mẫu là các cây sâm Ngọc Linh in vitro 3 tháng tuổi, cao khoảng 4,5 cm hiện có tại
Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống cây trồng (Viện Sinh học Tây Nguyên) Lá và cuống
Trang 2lá của cây sâm in vitro được sử dụng làm nguồn
mẫu Lá được cắt thành những mẫu có kích
thước khoảng 1 x 1 cm, cuống lá cắt thành từng
đoạn dài khoảng 1 cm
Môi trường nuôi cấy
Môi trường dinh dưỡng khoáng MS [17],
½MS (môi trường MS có thành phần khoáng đa
lượng giảm đi một nửa), SH [23] có bổ sung 30
g/l sucrose, 8 g/l agar (ngoại trừ thí nghiệm
khảo sát giá thể) Tùy theo thí nghiệm mà các
chất điều hòa sinh trưởng khác nhau được sử
dụng (2,4-D, NAA) Các thí nghiệm được điều
chỉnh pH về 5,8 trước khi hấp khử trùng ở
121ºC, 1 atm trong 30 phút Mẫu được cấy vào
bình thủy tinh 250 ml chứa 40 ml môi trường,
mỗi công thức 50 mẫu (5 mẫu/bình, 3 lần
lặp lại) đối với các thí nghiệm khảo sát mô sẹo
Huyền phù tế bào được nuôi cấy trong bình
thủy tinh 250 ml chứa 50 ml môi trường lỏng,
đặt trên máy lắc (100 vòng/phút) (Hermle,
Đức)
Phương pháp
Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và NAA lên sự
cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc
Linh từ mẫu cấy cuống lá in vitro
Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự cảm ứng và tăng
sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh
Mẫu cuống lá (1 cm) được nuôi cấy trên
môi trường MS bổ sung 2,4-D ở các nồng độ
khác nhau (0; 0,5; 1,0 và 2,0 mg/l), 30 g/l
sucrose và 8 g/l agar
Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với NAA lên sự
cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc
Linh
Mẫu cuống lá (1 cm) được nuôi cấy trên
môi trường MS có bổ sung 2,4-D với nồng độ
tốt nhất thu được ở thí nghiệm trên kết hợp với
NAA ở các nồng độ khác nhau (0,5; 1,0 và 2,0
mg/l), 30 g/l sucrose và 8 g/l agar
Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng
lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp”
sâm Ngọc Linh từ mẫu cấy cuống lá in vitro
Mẫu cuống lá (1 cm) được nuôi cấy trên
môi trường MS, ½MS, SH, bổ sung 30 g/l
sucrose, 8 g/l agar với nồng độ 2,4-D, NAA tốt
nhất ở thí nghiệm trên
Khảo sát ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy lên
sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh
Mẫu cuống lá (1 cm) được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng tối ưu ở thí nghiệm trên và sử dụng các loại giá thể khác nhau: agar (8 g/l), gelrite (2 g/l), bông gòn (kích thước 4 4 cm, khoảng 1,95 ± 0,46 g) nhằm tìm ra giá thể thích hợp nhất cho sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo
“xốp” sâm Ngọc Linh
Khảo sát ảnh hưởng của nguồn mẫu và điều kiện chiếu sáng lên sự cảm ứng và tăng sinh
mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh
Mẫu cấy lá (1 × 1 cm) và cuống lá (1 cm) được cấy vào môi trường tốt nhất thu được ở các thí nghiệm trên Sau đó, các mẫu cấy được đặt dưới điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ 45 µmol.m-2.s-1 hoặc tối hoàn toàn
Bước đầu nuôi cấy huyền phù tế bào sâm Ngọc Linh
Sau khi tìm ra môi trường nuôi cấy với nồng độ chất điều hòa sinh trưởng, giá thể, nguồn mẫu và điều kiện chiếu sáng phù hợp thì các mẫu mô sẹo “xốp”, bở được dùng làm nguyên liệu nuôi cấy huyền phù tế bào Mô sẹo
“xốp” có khối lượng tươi 1 g được nuôi cấy trên môi trường lỏng với thành phần khoáng, chất điều hòa sinh trưởng thực vật, điều kiện nuôi cấy tối ưu ở các thí nghiệm trên Huyền phù tế bào sau khi thu nhận được tái sinh lại trên môi trường rắn với thành phần dinh dưỡng tương tự như môi trường nuôi cấy huyền phù tế bào
Phương pháp xác định sinh khối
Xác định khối lượng mô sẹo
Mẫu mô sẹo được lấy ra khỏi bình nuôi cấy
và cân trên cân phân tích (Sartorius, Đức) để xác định khối lượng tươi Sau đó, tiến hành sấy mẫu mô sẹo ở 60ºC cho đến khi khối lượng không đổi để xác định khối lượng khô
Xác định mật độ tế bào
Huyền phù tế bào sâm Ngọc Linh được thu nhận và được nhuộm bằng thuốc nhuộm carmine-iodine với tỷ lệ 2:1 (dịch huyền phù tế bào:thuốc nhuộm carmine-iodine) Sau đó, hút 5
µl dịch huyền phù đã nhuộm bằng micropipette
Trang 3trải lên lamelle Đặt lên lame lõm, quan sát dưới
kính hiển vi (Olympus, Nhật Bản) và đếm tế
bào dưới vật kính ×10
Xác định khối lượng tươi và khối lượng khô sinh
khối
Tiến hành cân eppendorf, hút 1 ml dịch
huyền phù tế bào cho vào eppendorf Sau đó,
dịch huyền phù tế bào này được ly tâm với tốc
độ 10000 vòng/phút trong 10 phút Nhẹ nhàng
hút bỏ dịch nổi, giữ lại phần cặn lắng đã được ly
tâm Cân eppendorf có chứa sinh khối tế bào
lắng ở đáy để xác định khối lượng tươi Khối
lượng tươi sinh khối là độ lệch giữa hai lần cân
Sau đó, tiến hành xác định khối lượng khô bằng
cách sấy eppendorf chứa huyền phù tế bào (đã
ly tâm và hút bỏ dịch nổi) trong tủ sấy ở 60ºC
đến khi khối lượng không đổi Khối lượng khô
sinh khối là độ chệnh lệch giữa lần cân cuối và
lần cân đầu tiên
Điều kiện thí nghiệm
Các thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện
nhiệt độ 23±2ºC, thời gian chiếu sáng 16
giờ/ngày với cường độ 45 µmol.m-2.s-1 (đối với
các thí nghiệm có chiếu sáng) và độ ẩm trung
bình 75-80%
Chỉ tiêu theo dõi và thống kê xử lý số liệu
Các thí nghiệm khảo sát về sự cảm ứng và
tăng sinh mô sẹo bao gồm các chỉ tiêu sau: tỷ lệ
tạo thành mô sẹo “xốp” (%), khối lượng tươi
(mg), khối lượng khô (mg) được thu nhận sau 8
tuần nuôi cấy Trong nuôi cấy huyền phù tế bào,
chúng tôi tiến hành ghi nhận các chỉ tiêu như
mật độ tế bào, khối lượng tươi, khối lượng khô
của sinh khối huyền phù tế bào sau 7, 14, 21 và
28 ngày nuôi cấy Số liệu được xử lý và phân
tích bằng phần mềm SPSS 16.0 theo phương
pháp Duncan test với α = 0,05 [8]
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Ảnh hưởng của 2,4-D và NAA lên sự cảm
ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” từ mẫu cấy
cuống lá in vitro sâm Ngọc Linh
Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự cảm ứng và tăng
sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh
Mẫu cấy cuống lá in vitro sâm Ngọc Linh
cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” trên môi
trường có chứa 2,4-D sau 8 tuần nuôi cấy được thể hiện qua bảng 1, hình 1a Sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo khác nhau ở các nồng độ
2,4-D khác nhau trong môi trường nuôi cấy Sự khác nhau đó được thể hiện qua tỷ lệ tạo mô sẹo, khối lượng tươi, khối lượng khô của mô sẹo Tỷ lệ cảm ứng tạo mô sẹo “xốp” đạt 100%
ở các công thức có bổ sung 1,0 mg/l, 2,0 mg/l 2,4-D (bảng 1) Khối lượng tươi và khối lượng khô của mô sẹo cũng đạt cao nhất ở công thức
có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D (268,4 mg/mẫu và 9,4 mg/mẫu), mô sẹo tạo thành “xốp”, mọng nước và có màu trắng trong (bảng 1, hình 1a) Ở công thức bổ sung nồng độ 2,4-D thấp (0,5 mg/l), mẫu cấy hầu như không cảm ứng tạo thành mô sẹo mà cảm ứng tạo thành rễ; còn ở nghiệm thức không bổ sung 2,4-D thì mẫu cấy hóa nâu và chết Điều đó chứng tỏ 2,4-D có vai trò quan trọng trong việc cảm ứng và tăng sinh
mô sẹo sâm Ngọc Linh Kết quả này tương tự
với kết quả của một số nghiên cứu về chi Panax như trên cây sâm Triều Tiên (Panax ginseng C.A Meyer) [25, 6], cây sâm Mỹ (Panax quinquefolium) [27], mẫu cấy cảm ứng hình
thành mô sẹo mềm, “xốp” và tăng sinh nhanh khi bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D vào môi trường nuôi cấy
Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với NAA lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh
Sự kết hợp 1,0 mg/l 2,4-D và NAA ở các nồng độ khác nhau (0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 mg/l) vào trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng một cách đáng kể đến sự cảm ứng và tăng sinh của mô sẹo “xốp” Ở nghiệm thức có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D và 1,0 mg/l NAA thì 100% mẫu cấy tạo thành các mô sẹo “xốp”, mọng nước, màu trắng trong với khối lượng tươi (434,2 mg/mẫu) và khối lượng khô (22,8 mg/mẫu) cao nhất so với các nghiệm thức còn lại, cao gấp 1,6 lần so với nghiệm thức không bổ sung NAA (bảng 2, hình 1b) Trong khi đó, nghiệm thức có
bổ sung NAA ở nồng độ thấp hoặc cao hơn 1,0 mg/l cũng không làm tăng khả năng tăng sinh của mô sẹo
Sự kết hợp của hai loại auxin trong quá trình cảm ứng mô sẹo cũng đã được nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau Trên cây Thu thảo
Trang 4kê (Pogonatherum paniceum) khi bổ sung kết
hợp 2,4-D và NAA với các nồng độ khác nhau,
mẫu cấy cũng cảm ứng và tạo thành mô sẹo có
hình thái khác nhau; bên cạnh sự xuất hiện của
các mô sẹo “xốp”, mềm, màu trắng xanh hay
vàng nhạt còn có các mô sẹo cứng, chắc, màu
vàng đậm [29] Ở cây Ngũ trảo (Vitex negundo)
khi bổ sung 2,4-D kết hợp với NAA ở nồng độ
thấp (dưới 1,0 mg/l) tạo thành mô sẹo bở, màu
trắng; nồng độ 2,4-D và NAA khoảng 1,0 mg/l -
2,0 mg/l mẫu cấy cảm ứng tạo thành mô sẹo
“xốp”, bở, mọng nước, màu trắng Khi bổ sung
ở nồng độ NAA và 2,4-D cao hơn 2,0 mg/l mô sẹo hình thành bở, có màu vàng hoặc trắng xanh [10]
Như vậy, trên đối tượng cây sâm Ngọc Linh, tỷ lệ cảm ứng tạo thành mô sẹo, khối lượng tươi, khối lượng khô đạt cao nhất khi nuôi cấy mẫu cuống lá trên môi trường có sự kết hợp của 1,0 mg/l 2,4-D và 1,0 mg/l NAA và cao gấp 1,6 lần so với môi trường chỉ bổ sung 2,4-D riêng rẽ
Bảng 1 Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh
2,4-D
(mg/l)
Tỷ lệ tạo mô
sẹo “xốp”
(%)
Khối lượng tươi (mg/mẫu)
Khối lượng khô (mg/mẫu)
Hình thái mô sẹo
Hầu hết mẫu cảm ứng tạo rễ trực tiếp, một số mẫu tạo mô sẹo có màu xanh nhạt, hơi “xốp”
trắng trong
trong, một số mẫu xuất hiện phôi
Bảng 2 Ảnh hưởng của 1,0 mg/l 2,4-D kết hợp với NAA ở các nồng độ khác nhau lên sự cảm ứng
và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh
NAA
(mg/l)
Tỷ lệ tạo mô
sẹo “xốp”
(%)
Khối lượng tươi (mg/mẫu)
Khối lượng khô (mg/mẫu)
Hình thái mô sẹo
trắng trong
cảm ứng tạo rễ
trắng trong
trong, một số mẫu hình thành phôi Các chữ cái a,b,… thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức α = 0,05 trong phép thử Duncan
Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự
cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” từ các
mẫu cấy cuống lá in vitro sâm Ngọc Linh
Các mẫu cấy cuống lá in vitro sâm Ngọc
Linh đều cảm ứng và tăng sinh thành mô sẹo
“xốp” trên các môi trường khoáng MS, ½MS,
SH Ở cả ba loại môi trường tỷ lệ mẫu cấy cảm
ứng tạo thành mô sẹo “xốp” gần như không có
sự khác biệt (bảng 3) Tuy nhiên, các chỉ tiêu khối lượng tươi và khối lượng khô của mô sẹo lại khác nhau khi nuôi cấy trên các nguồn khoáng khác nhau Khối lượng tươi và khối lượng khô của mô sẹo cao nhất khi nuôi cấy trên môi trường MS (431,6 và 20 mg/mẫu), tiếp
Trang 5theo là môi trường ½MS (302,2 và 16,4
mg/mẫu) và cuối cùng là môi trường SH (194
và 8,2 mg/mẫu) (bảng 3) Các mẫu mô sẹo được
hình thành trên môi trường MS thì “xốp”, mọng
nước và có màu trắng trong Trên môi trường
½MS và SH, mô sẹo cũng có hình thái tương tự, nhưng một số mẫu lại cảm ứng hình thành rễ (hình 1c)
Hình 1 Ảnh hưởng của 2,4-D, NAA, nguồn khoáng, giá thể, nguồn mẫu và điều kiện chiếu sáng lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
a Nồng độ 2,4-D (0; 0,5; 1,0; 2,0 mg/l, từ phải qua trái); b Nồng độ NAA (0; 0,5; 1,0; 2,0 mg/l, từ phải qua trái); c Nguồn khoáng ½MS, MS, SH (từ phải qua trái); d Giá thể bông gòn, gelrite, agar (từ phải qua trái); Mẫu cấy lá (e1) và cuống lá (e3) ở điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày; Mẫu cấy lá (e2) và cuống lá (e4) ở điều kiện tối hoàn toàn; thanh đo: 25 mm
Trang 6Bảng 3 Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp”
sâm Ngọc Linh
Môi
trường
Tỷ lệ tạo mô
sẹo “xốp” (%)
Khối lượng tươi (mg/mẫu)
Khối lượng khô (mg/mẫu) Hình thái mô sẹo
trong, một số mẫu cảm ứng tạo rễ
trong
trong, một số mẫu cảm ứng tạo rễ
Trong nuôi cấy in vitro, thành phần khoáng có
vai trò quan trọng trong việc cảm ứng, tăng sinh
và phát sinh hình thái mô sẹo Một số nghiên cứu
về ảnh hưởng của hàm lượng khoáng đến khả
năng cảm ứng và tăng sinh mô sẹo cho thấy, mô
sẹo được hình thành từ mẫu cấy lá sâm Ngọc Linh
thì cứng và chắc, có khối lượng tươi cao nhất khi
được nuôi cấy trên môi trường SH, còn trên môi
trường MS và ½MS lại cho kết quả thấp hơn [19]
Trong khi đó, mô sẹo sâm Triều Tiên (Panax
ginseng) lại tăng sinh tốt trên môi trường khoáng
½MS [7], còn mô sẹo sâm Mỹ (Panax
quinquefolium) lại tăng sinh tốt trên môi trường
khoáng MS [1] Do đó, môi trường khoáng thích
hợp là điều kiện tất yếu cho sự cảm ứng hình
thành mô sẹo “xốp” của sâm Ngọc Linh Qua kết
quả thí nghiệm cho thấy, môi trường khoáng MS
là thích hợp cho mẫu cấy cảm ứng tạo thành mô
sẹo “xốp” và tăng sinh cao nhất
Ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy lên sự cảm
ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc
Linh
Bên cạnh chất tạo đông được sử dụng phổ
biến như agar, gelrite trong nuôi cấy mô thực
vật thì việc sử dụng các giá thể có cấu trúc xốp,
thông thoáng khí lại tiết kiệm được chi phí đang
được chú ý Trong nghiên cứu này, các mẫu cấy cuống lá đều cảm ứng tạo mô sẹo “xốp” trên các giá thể nuôi cấy khác nhau (100%) (bảng 4) Tuy nhiên, khối lượng tươi và khối lượng khô của mô sẹo lại có sự khác biệt rõ rệt Trên giá thể agar và gelrite, mô sẹo tăng sinh nhiều hơn
so với giá thể bông gòn (bảng 4) Mô sẹo cảm ứng trên giá thể agar và gelrite đều “xốp”, mọng nước và có màu trắng trong, còn trên giá thể bông gòn mô sẹo có màu vàng nhạt (hình 1d) Các mô sẹo màu trắng trong, mọng nước thường “xốp”, rời rạc hơn và dễ phân tán trong môi trường lỏng so với các mô sẹo có màu vàng Do đó, các mô sẹo này thích hợp làm nguyên liệu tạo huyền phù tế bào sâm Ngọc Linh Trong nghiên cứu này, giá thể agar thích hợp cho sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh Trong giá thể agar có chứa Ca,
Mg, K và Na [18] có thể là yếu tố cần thiết cho
mô sẹo “xốp” cảm ứng và tăng sinh Giá thể bông gòn tuy dẫn truyền chất dinh dưỡng tốt nhưng lại không thích hợp cho mẫu mô sẹo
“xốp” tăng sinh Mặc dù, mẫu cấy cảm ứng và tăng sinh tốt trên giá thể agar và gelrite, nhưng xét về hiệu quả kinh tế thì agar vẫn là giá thể được chọn nhằm tiết kiệm chi phí, nhưng vẫn đảm bảo cho hiệu quả cao
Bảng 4 Ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh
Giá
thể
Tỷ lệ tạo mô
sẹo “xốp”(%)
Khối lượng tươi (mg/mẫu)
Khối lượng khô (mg/mẫu) Hình thái mô sẹo
trắng trong Gelrite 100 355,8ab 18,2a Mô sẹo “xốp”, mọng nước, màu
trắng trong Bông
Mô sẹo “xốp”, mọng nước, màu vàng nhạt
Trang 7Ảnh hưởng của nguồn mẫu và điều kiện
chiếu sáng lên sự cảm ứng và tăng sinh mô
sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh
Mô sẹo có thể được tạo ra từ nhiều loại cơ
quan khác nhau của một cơ thể thực vật Khả
năng cảm ứng và tăng sinh tạo thành mô sẹo
“xốp” ở các mẫu cấy có nguồn gốc khác nhau là
khác nhau Tùy theo từng loại mẫu cấy, ánh
sáng cần hoặc không cần trong suốt thời gian
tạo thành mô sẹo [20] Trong nghiên cứu này,
các mẫu cuống lá được nuôi cấy trong điều kiện
chiếu sáng 16 giờ/ngày và trong điều kiện tối
hoàn toàn đều cảm ứng tạo thành mô sẹo với tỷ
lệ là 100% Tuy nhiên, khối lượng tươi và khối
lượng khô của mô sẹo thu được trong điều kiện
sáng cao hơn so với điều kiện tối (bảng 5) Các
chỉ tiêu như khối lượng tươi, khối lượng khô
của mô sẹo hình thành từ cuống lá (453 mg/mẫu
và 23 mg/mẫu) cũng cao hơn so với mô sẹo
hình thành từ lá (286,25 mg/mẫu và 26,25
mg/mẫu) (bảng 5) Ở điều kiện chiếu sáng, mô
sẹo hình thành từ các mẫu cuống lá thì “xốp”,
mọng nước và có màu trắng trong (hình 1e3);
còn trong điều kiện tối thì mô sẹo “xốp”, mọng
nước nhưng lại có màu vàng đục (hình 2e4) Đối
với các mẫu cấy lá trong điều kiện sáng cũng
cho tỷ lệ tạo mô sẹo “xốp” (96%), khối lượng
tươi (286,25 mg/mẫu), khối lượng khô (26,25
mg/mẫu) cao hơn so với các mẫu cấy lá được
đặt trong tối (bảng 5) Các mẫu lá được nuôi cấy
trong điều kiện tối hoàn toàn đều chuyển sang
màu vàng, mô sẹo hình thành hơi “xốp” và có
màu vàng đục (hình 1e2) khác với mẫu mô sẹo
hình thành từ mẫu cấy lá ở điều kiện sáng có màu trắng đục và hơi “xốp” (hình 1e1)
Kết quả của nghiên cứu này tương tự một số nghiên cứu về ảnh hưởng của các loại cơ quan khác nhau và điều kiện chiếu sáng đến khả năng khởi tạo, biệt hóa và tăng sinh mô sẹo trên các đối tượng thuộc chi Nhân sâm Lim & Lee (1997) [15] sử dụng lá, trụ thượng diệp, cuống
hoa và rễ từ cây sâm Triều Tiên (Panax ginseng) nuôi cấy in vitro; tất cả các mẫu cấy đều tạo
thành mô sẹo cứng, chắc với tỷ lệ cao (100%) và
có khả năng tạo rễ bất định khi nuôi cấy ở điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày Trên đối tượng sâm
Mỹ (Panax quinquefolium) thì mô sẹo được hình
thành từ các mẫu cấy ban đầu là rễ sau 2-3 tuần nuôi cấy, mô sẹo cứng, chắc, màu vàng nhạt, tạo phôi soma sau 3 tháng nuôi cấy [26] Khi nuôi cấy một số các cơ quan như rễ, lá, cuống lá, trụ
hạ diệp thì sự tạo thành mô sẹo trong điều kiện tối tốt hơn ngoài sáng [3, 11, 12, 24] Tuy nhiên, trong một số trường hợp, mẫu cấy lại tạo mô sẹo tốt hơn trong điều kiện chiếu sáng Trên mẫu cấy
lá cây Vải (Litchi chinensis), mô sẹo cảm ứng và
tăng sinh tốt ở điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày [16] Khối lượng tươi đạt cao nhất khi nuôi cấy
mô sẹo phát sinh từ lá cây Cuccumis sativus ở
điều kiện chiếu sáng là 16 giờ/ngày [9]
Kết quả trong nghiên cứu này cho thấy, mẫu cấy cuống lá được nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày là thích hợp cho quá trình cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh
Bảng 5 Ảnh hưởng của nguồn mẫu và điều kiện chiếu sáng lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo
“xốp” sâm Ngọc Linh
Điều kiện
chiếu sáng
Nguồn mẫu
Tỷ lệ tạo mô sẹo “xốp”
(%)
Khối lượng tươi (mg/mẫu)
Khối lượng khô (mg/mẫu)
Hình thái mô sẹo
Sáng
“xốp”,trắng đục Cuống
Mô sẹo “xốp”, mọng nước, trắng trong Tối
vàng đục Cuống
Mô sẹo “xốp”, mọng nước, vàng đục
Trang 8Nuôi cấy huyền phù tế bào từ mô sẹo “xốp”
cây sâm Ngọc Linh
Nuôi cấy huyền phù tế bào thích hợp cho
việc nhân giống in vitro và sản xuất sinh khối tế
bào ở quy mô công nghiệp Bên cạnh đó, việc
nuôi cấy tế bào đơn còn có nhiều ứng dụng khác
như nghiên cứu sự sinh trưởng, phát triển và phân hóa tế bào trong những điều kiện khác nhau; thu nhận các chất trao đổi thứ cấp; chọn dòng tế bào, tuyển chọn các đặc tính thích hợp
để phục vụ cho nhu cầu sống của con người mà đặc biệt là các kỹ thuật chuyển gien, dung hợp
tế bào cũng như các thao tác ở mức tế bào [22]
Hình 2 Sự sinh trưởng và phát triển của sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh sau các khoảng thời gian
nuôi cấy khác nhau; MĐTB: mật độ tế bào (tế bào/5 µl); KLT: khối lượng tươi sinh khối (mg/ml); KLK: khối lượng khô sinh khối (mg/ml)
Qua nghiên cứu này, bước đầu ghi nhận
được đường cong sinh trưởng của tế bào cây
sâm Ngọc Linh (hình 2; hình 3a, b, c, d) Mô
sẹo được đưa vào môi trường nuôi cấy từ ngày
đầu tiên đến ngày thứ 7 là giai đoạn thích ứng
với môi trường nuôi cấy Thời gian để các tế
bào thích ứng với môi trường nuôi cấy phụ
thuộc vào nhiều yếu tố như tuổi mẫu, khối
lượng mẫu và các điều kiện nuôi cấy Từ ngày
nuôi cấy thứ 7 đến khoảng ngày thứ 12 các tế
bào bước sang giai đoạn phân chia nhanh theo
hàm số mũ (20 tế bào/5 µl) Sự phân chia tế bào
đạt cao nhất được ghi nhận vào ngày thứ 14
(23,67 mg/ml) Hình 2 cho thấy, đỉnh của đường
cong sinh trưởng tế bào tương đối hẹp, điều này
chứng tỏ pha ổn định của tế bào khá ngắn (vào
khoảng ngày nuôi cấy thứ 12 đến ngày thứ 16)
Sau đó, sự sinh trưởng của tế bào giảm đi đáng
kể, tế bào bước vào giai đoạn suy thoái và chết nếu không được cấy chuyền (hình 2)
Vì vậy, việc duy trì huyền phù tế bào phải được thực hiện vào giai đoạn đầu của pha ổn định, vào lúc các tế bào phân chia và phát triển nhanh chóng, nếu vượt qua giai đoạn này thì sức sống của huyền phù tế bào sẽ giảm xuống Do đó, ngày nuôi cấy thứ 14 là thời điểm thích hợp cho việc cấy chuyền huyền phù
tế bào cây sâm Ngọc Linh Nghiên cứu bước đầu này sẽ là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về huyền phù tế bào sâm Ngọc Linh Kết quả cũng cho thấy pha ổn định của tế bào tương đối ngắn, do đó, các nghiên cứu tiếp theo về đường cong sinh trưởng tế bào cần tiến hành ghi nhận sinh khối tế bào ở những khoảng thời gian ngắn hơn (cứ mỗi 1 hoặc 2 ngày tiến hành thu
số liệu 1 lần)
Trang 9Hình 3 Hình thái tế bào sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính x40
a Tế bào đơn sâm Ngọc Linh; b Tế bào đang phân chia; c Cụm 3 tế bào;
d Cụm 4 tế bào; e Mô sẹo tái sinh từ huyền phù tế bào sâm Ngọc Linh Các giai đoạn sinh trưởng của tế bào cũng
phụ thuộc từng loại cây khác nhau Trên cây
Lộc vừng hoa vàng (Barringtonia racemosa),
thời gian thích ứng với môi trường nuôi cấy kéo
dài đến 14 ngày và sinh khối tế bào đạt cao nhất
vào ngày thứ 32 [4] Giai đoạn thích nghi của tế
bào cây Ớt chuông (Capsicum annuum L.) chỉ kéo dài 5 ngày, sinh khối tế bào thu được vào ngày nuôi cấy thứ 20 là cao nhất [14] Bên cạnh
đó, đường cong sinh trưởng của các loài khác nhau trong cùng một chi cũng đã được nghiên
cứu như trên cây Origanum vulgare và O
Trang 10syriacum giai đoạn thích nghi của tế bào, giai
đoạn ổn định và giai đoạn suy vong của hai loài
này lại có sự khác biệt Sinh khối tế bào thu
được cao nhất ở Origanum vulgare L là vào
ngày thứ 18 và ở O syriacum L là vào ngày thứ
21 [2] Những kết quả này cho thấy, đường
cong sinh trưởng của tế bào ở các loài khác
nhau không giống nhau
Huyền phù tế bào sâm Ngọc Linh sau khi
cấy chuyền 4-6 lần được trải lên môi trường MS
rắn có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D, 1,0 mg/l NAA,
30 g/l sucrose, 8,0 g/l agar Sau 4 tuần nuôi cấy,
chúng tôi nhận thấy có sự xuất hiện của các mô
sẹo từ dịch huyền phù (hình 3e) Điều này
chứng tỏ, khả năng sống sót và tái sinh khá tốt
của huyền phù tế bào sâm Ngọc Linh, mở ra
tiển vọng mới trong việc nhân giống và thu
nhận sinh khối trên quy mô lớn
KẾT LUẬN
Trong nghiên cứu này, mẫu cấy cuống lá
sâm Ngọc Linh được cảm ứng và tăng sinh tạo
thành mô sẹo “xốp” tốt nhất trên môi trường
khoáng MS có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D, 1,0 mg/l
NAA, 30 g/l sucrose, 8,0 g/l agar, pH = 5,8 ở
điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày Mô sẹo “xốp”
được nuôi cấy trong môi trường MS lỏng bổ
sung 1,0 mg/l 2,4-D, 1,0 mg/l NAA, 30 g/l
sucrose để tạo huyền phù tế bào; sinh khối tế
bào thu được cao nhất (23,67 mg/ml) vào ngày
nuôi cấy thứ 14 Nghiên cứu này bước đầu thu
nhận được sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh
dùng làm nguyên liệu ban đầu cho việc nhân
giống in vitro; tiến đến việc thu nhận sinh khối
tế bào ở quy mô công nghiệp và cung cấp nguồn
nguyên liệu ổn định cho ngành sản xuất dược
liệu ở nước ta
Lời cảm ơn: Các tác giả xin chân thành cảm ơn
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Bộ
Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã hỗ trợ
kinh phí cho đề tài nghiên cứu này
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Andrew S W., 1990 Callus induction and
plant regeneration of American ginseng
Hort Sci., 25(5): 571-572
2 Arafeh R M., Shibli R A., Mahmoud M A
and Shatnawi M A., 2006 Callusing, cell
suspension culture and secondary metabolites production in persian oregano
(Origanum vulgare L ) and arabian oregano (O syriacum L.) Jordan J Agric Sci., 2(3):
274-282
3 Arya S., Arya I D I and Eriksson T., 1993 Rapid multiplication of adventitious somatic
embryos of Panax ginseng Plant Cell Tiss
Org., 34: 157-162
4 Behbahani M., Shanehsazzadeh M and Hessami M J., 2011 Optimization of callus
and cell suspension cultures of Barringtonia
lycopene production Sci Agric (Piracaba, Braz), 68(1): 69-76
5 Bộ Khoa học và Công nghệ, Viện Khoa học
và Công nghệ Việt Nam, 2007 Sách Đỏ Việt Nam, phần II: Thực vật Nxb Khoa học tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội, trang
516
6 Bonfill M., Cusidó R M., Palazón J., Canut E., Piňol T and Morales C., 2003 Relationship between peroxidase activity
and organogenesis in Panax ginseng
calluses Plant Cell Tiss Org., 73: 37-41
7 Choi K T., Kim M W., Shin H S., 1982 Induction of callus and organ in tissue
culture of ginseng (Panax ginseng C A
Meyer) Kor J Ginseng Sci., 6: 162-167
8 Duncan D B., 1955 Multiple range and
multiple F test Biometrics, 11: 1-42
9 Elmeer K M S and Hennerty M J., 2008 Observations on the combined effects of light, NAA and 2,4-D on somatic
embryogenesis of cucumber (Cucumis sativus) hybrids Plant Cell Tiss Org., 95:
381-384
10 Farzana B C., Safiul A F M., Maruf H M., Farhana I J., Anita R C., Syeda S., Zubaida K and Mohammed R., 2011
Studies with callus induction of Vitex negundo: an aromatic medicinal plant Am.-Eurasian J Sustain Agric., 5(1): 6-14.
11 Gao X., Zhu C., Jia W., Gao W., Qiu M., Zhang Y and Xiao P., 2005 Induction and characterization of adventitious roots