Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng phát sinh callus từ bao phấn cây dưa chuột (cucumis sativus l ) in vitro

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG CHÂU THỊ VƯỢNG NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG PHÁT SINH CALLUS TỪ BAO PHẤN CÂY DƯA CHUỘT (CUCUMIS SATIVUS L.) IN VITRO Ngành: Công nghệ sinh học Người hướng dẫn: TS Nguyễn Minh Lý Đà Nẵng – 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả khóa luận Châu Thị Vượng ii LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực Khóa luận tốt nghiệp Khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng, học hỏi nhiều kiến thức lý thuyết thực hành thí nghiệm phương pháp ni cấy mơ tế bào thực vật, qua thân tơi trưởng thành tư duy, bố trí tiến hành các nghiên cứu khoa học Để hoàn thành Khóa luận tốt nghiệp này, ngồi nỡ lực của thân, tơi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tận tình hướng dẫn, giúp đỡ mặt khoa học của TS Nguyễn Minh Lý Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô thuộc khoa Sinh- Môi trường truyền dạy cho nhiều kiến thức phát triển kĩ thực hành thí nghiệm quá trình tơi thực đề tài Khoá luận Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thành viên nhóm nghiên cứu, ln giúp đỡ chia sẻ kinh nghiệm thời gian thực khóa luận Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn gia đình, bạn bè ln đợng viên, khích lệ tơi vật chất lẫn tinh thần để tơi có thể đạt kết tốt Xin trân trọng cảm ơn Đà Nẵng, tháng năm 2018 Sinh viên thực Châu Thị Vượng iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài 3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY DƯA CHUỘT 1.1.1 Nguồn gốc phân loại dưa chuột 1.1.2 Giá trị dinh dưỡng 1.1.3 Giá trị kinh tế 1.1.4 Các giống dưa chuột lai sử dụng sản xuất .8 1.2 VAI TRỊ CỦA CÂY ĐƠN BỢI TRONG CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG 1.2.1 Giá trị đơn bội 1.2.2 Phương pháp tạo đơn bội 1.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ NUÔI CẤY BAO PHẤN 11 1.3.1 Ảnh hưởng điều kiện sinh trưởng kiểu gen mẹ 11 1.3.2 Ảnh hưởng giai đoạn phát triển bao phấn 12 1.3.3 Ảnh hưởng việc xử lí vật liệu trước nuôi cấy 12 1.3.4 Ảnh hưởng điều kiện sau nuôi cấy 12 1.3.5 Ảnh hưởng thành phần môi trường nuôi cấy 13 1.4 NGHIÊN CỨU VỀ KỸ THUẬT NUÔI CẤY BAO PHẤN Ở DƯA CHUỘT ĐƠN BỢI VÀ CÁC CÂY TRONG HỌ BẦU BÍ 14 iv 1.4.1 Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy bao phấn giới 14 1.4.2 Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy bao phấn Việt Nam 17 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 19 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.1.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 20 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 20 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.3.1 Phương pháp thu nụ dưa chuột 20 2.3.2 Phương pháp vào mẫu 20 2.3.3 Bố trí thí nghiệm xử lí thống kê 21 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 26 3.1 CÔNG THỨC KHỬ TRÙNG MẪU NỤ HOA 26 3.2 ẢNH HƯỞNG CỦA KIỂU GEN DƯA CHUỘT ĐẾN KHẢ NĂNG PHÁT SINH CALLUS 27 3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA KÍCH THƯỚC NỤ HOA DƯA CḤT ĐẾN KHẢ NĂNG PHÁT SINH CALLUS 28 3.4 ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN THU MẪU VÀ THỜI GIAN XỬ LÝ LẠNH ĐẾN HIỆU QUẢ TẠO CALLUS 29 3.4.1 Ảnh hưởng thời gian thu mẫu đến hiệu tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 29 3.4.2 Ảnh hưởng thời gian xử lý lạnh đến hiệu tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 30 3.5 ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG (ĐHST) ĐẾN SỰ PHÁT SINH CALLUS ĐƠN BỘI VÀ TÁI SINH CÂY 31 3.5.1 Ảnh hưởng nồng độ 2,4-D đến hiệu tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 31 v 3.5.2 Ảnh hưởng nồng độ 2,4-D KIN đến hiệu tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 33 3.5.3 Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh từ callus bao phấn dưa chuột 34 3.5.4 Kết khảo sát ảnh hưởng KIN NAA đến khả tái sinh từ callus bao phấn dưa chuột 36 3.6 ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN HIỆU QUẢ TẠO CALLUS TỪ NUÔI CẤY IN VITRO BAO PHẤN DƯA CHUỘT .38 3.6.1 Điều kiện nhiệt độ 38 3.6.2 Điều kiện ánh sáng 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 Kết luận 41 Kiến nghị 41 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 vi DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : Dichlorophenoxylacetic acid BAP : 6-Benzylaminopurine ĐHST : Điều hòa sinh trưởng KIN : Kinetin MS : Murashige Skoog (1962) NAA : α-Naphthaleneacetic acid SH : Schenk Hildebrandt (1972) TDZ : Thidiazuron vii DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu 1.2 1.3 Thàn (Theo Tình giai đ 1.4 Điều 2.1 Đặc 2.2 Các c 3.1 Hiệu 3.2 Sự ả 3.3 Sự ản callus 3.4 Sự ản phát 3.5 Sự ản 3.6 Sự ản 3.7 Ảnh h bao p 3.8 3.9 Ảnh h phấn Sự ản callus 3.10 Sự ản callus viii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 3.1 3.2 3.3 Hình callus phát s Callus sau tuần Giống dưa chuột Sự ảnh hưởng của phát sinh callus sa 3.4 3.5 Callus phát sinh t 0,22 mg/l KIN Sự tăng trưởng Callus phát sinh t 3.6 0,2 mg/l KIN q mm 3.7 Tái sinh rễ từ ph BAP 1,0 mg/l, tha 3.8 Tái sinh rễ từ ph BAP 1,0 mg/l, tha 3.9 Rễ từ phôi sau t mg/l tái sinh trở l 3.10 Tái sinh rễ từ ph KIN 4,0 mg/l; tha 3.11 3.12 Tái sinh rễ từ ph KIN 4,0 mg/l; tha Tái sinh rễ từ ca sung KIN 4,0 mg Callus sau 3,4,5 tu 33 cho phát sinh callus cao mơi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D có thể khác kiểu gen điều kiện ngoại cảnh trồng giống Callus thu nhỏ gọn, màu vàng nhạt, kết khối Sử dụng 2,4 D nồng đợ 0,5 mg/l cho thí nghiệm sau Trong quá trình thí nghiệm nhận thấy 2,4 D khơng ảnh hưởng đến tỷ lệ bao phấn tạo callus mà ảnh hưởng đến tăng trưởng của callus Tuỳ thuộc vào nồng độ 2,4-D bổ sung vào môi trường khác tốc đợ tăng trưởng callus khác Sự tăng trưởng đường kính callus nhanh nhất, cụ thể đường kính tăng từ 3,510,5 mm bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D Khi bổ sung nồng độ 2,4-D từ 1,5 mg/l đến 2,5 mg/l tốc đợ tăng trưởng của callus chậm dần Bổ sung 2,4-D nồng độ 0,5 mg/l 1,5 mg/l cho tốc độ tăng trưởng callus tăng dần 3.5.2 Ảnh hưởng nồng độ 2,4-D KIN đến hiệu tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột Dựa theo kết của thí nghiệm trước, thí nghiệm tiến hành sử dụng 2,4 D nồng độ 0,5 mg/l nồng độ KIN bổ sung vào môi trường 0; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9;1,0 Theo dõi các cơng thức thí nghiệm thu kết thể bảng 3.6.: Bảng 3.6 Sự ảnh hưởng 2,4-D KIN đến phát sinh callus STT Đối ch CT CT CT CT CT CT CT CT CT Chú thích: Dấu “–”: khơng có tượng phát sinh callus 34 Hình 3.6 Callus phát sinh mơi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4D 0,2 mg/l KIN quan sát kính hiển vi Thanh ngang tỷ lệ mm Kết cho thấy bổ sung 2,4 D kết hợp với KIN vào môi trường tạo callus có hiệu cao so với sử dụng 2,4 D Môi trường tạo callus hiệu từ nuôi cấy bao phấn dưa chuột MS có bổ sung 3% sucrose, 0,8% agar, pH = 5,75 0,5 mg/l 2,4-D 0,2- 0,3 mg/l KIN (cảm ứng tạo callus 75,71% 68,57% với callus thu màu vàng nhạt) Với các nồng độ KIN từ 0,7 mg/l trở lên, bao phấn không tạo callus Kết thu khác với các thí nghiệm trước Theo kết nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Dung năm 2007 cho thấy kết hợp mg/l 2,4-D với mg/l KIN cho hiệu tạo callus cao dưa hấu Tuy nhiên, nghiên cứu của H.G Ashok Kumar giống dưa chuột Calypso Green Long cho thấy tạo callus mơi trường có bổ sung mg/l 2,4-D hoặc mg/l 2,4-D + mg/l BAP cho kết tốt 3.5.3 Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh từ callus bao phấn dưa chuột BAP chất điều tiết sinh trưởng có tác dụng tích cực việc kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian sinh trưởng của mô phân sinh làm hạn chế già hóa của tế bào Trong tái sinh từ callus nhân giống in vitro, BAP có vai trò đặc biệt quan trọng việc kích thích hình thành chồi non, định hệ số nhân chất lượng chồi 35 Bảng 3.7 Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh từ callus bao phấn dưa chuột Nồng độ chấ (mg/ 0,5 BA 1,0 BA 1,5 BA 2,0 BA 2,5 BA Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p < 0,05 Đối với phương án đối chứng không bổ sung BAP mẫu tạo rễ (47,61%) Môi trường nuôi cấy bổ sung BAP (1,0 mg/l) cho tỷ lệ tạo rễ đạt cao chiếm 77,77% Rễ thu màu vàng, 4-5 rễ, dài 10-15 mm Ở môi trường nuôi cấy bổ sung BAP (2,5 mg/l) callus không tạo rễ Còn mơi trường có bổ sung BAP (1,5 mg/l) đạt giá trị trung bình 47,61 % Qua đó, mơi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l BAP cho hiệu tạo rễ đạt cao Hình 3.7 Tái sinh rễ từ phơi sau tuần nuôi cấy môi trường bổ sung BAP 1,0 mg/l, ngang tỉ lệ mm 36 Hình 3.8 Tái sinh rễ từ phôi sau tuần nuôi cấy môi trường bổ sung BAP 1,0 mg/l, ngang tỉ lệ mm Hình 3.9 Rễ từ phơi sau tuần nuôi cấy môi trường bổ sung BAP 1,0 mg/l tái sinh trở lại mô sẹo; ngang tỉ lệ mm 3.5.4 Kết khảo sát ảnh hưởng KIN NAA đến khả tái sinh từ callus bao phấn dưa chuột Kinetin thường sử dụng nuôi cấy tế bào thực vật để kích thích hình thành callus (kết hợp với auxin) tái tạo các mơ chồi từ callus (có nồng độ auxin thấp hơn) Bảng 3.8 Ảnh hưởng KIN NAA đến khả tái sinh từ callus bao phấn dưa chuột Nồng độ c KTST (m 1,0 KIN + 0,0 2,0 KIN + 0,0 3,0 KIN + 0,0 4,0 KIN + 0,0 5,0 KIN + 0,0 37 Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p