Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng phát sinh callus từ bao phấn cây dưa chuột (cucumis sativus l ) in vitro

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG  CHÂU THỊ VƯỢNG NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG PHÁT SINH CALLUS TỪ BAO PHẤN CÂY DƯA CHUỘT (CUCUMIS SATIVUS L.) IN VITRO Ngành: Công nghệ sinh học Người hướng dẫn: TS Nguyễn Minh Lý Đà Nẵng – 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả khóa luận Châu Thị Vượng ii LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực Khóa luận tốt nghiệp Khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng, học hỏi nhiều kiến thức lý thuyết thực hành thí nghiệm phương pháp ni cấy mơ tế bào thực vật, qua thân tơi trưởng thành tư duy, bố trí tiến hành các nghiên cứu khoa học Để hoàn thành Khóa luận tốt nghiệp này, ngồi nỡ lực của thân, tơi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tận tình hướng dẫn, giúp đỡ mặt khoa học của TS Nguyễn Minh Lý Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô thuộc khoa Sinh- Môi trường truyền dạy cho nhiều kiến thức phát triển kĩ thực hành thí nghiệm q trình tơi thực đề tài Khố luận Tơi xin gửi lời cảm ơn đến các thành viên nhóm nghiên cứu, ln giúp đỡ chia sẻ kinh nghiệm thời gian tơi thực khóa luận Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn gia đình, bạn bè động viên, khích lệ vật chất lẫn tinh thần để tơi có thể đạt kết tốt Xin trân trọng cảm ơn Đà Nẵng, tháng năm 2018 Sinh viên thực Châu Thị Vượng iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài 3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài .3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY DƯA CHUỘT .4 1.1.1 Nguồn gốc phân loại dưa chuột .4 1.1.2 Giá trị dinh dưỡng 1.1.3 Giá trị kinh tế 1.1.4 Các giống dưa chuột lai sử dụng sản xuất 1.2 VAI TRÒ CỦA CÂY ĐƠN BỘI TRONG CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG 1.2.1 Giá trị đơn bội 1.2.2 Phương pháp tạo đơn bội 1.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ NUÔI CẤY BAO PHẤN 11 1.3.1 Ảnh hưởng điều kiện sinh trưởng kiểu gen mẹ .11 1.3.2 Ảnh hưởng giai đoạn phát triển bao phấn 12 1.3.3 Ảnh hưởng việc xử lí vật liệu trước nuôi cấy 12 1.3.4 Ảnh hưởng điều kiện sau nuôi cấy .12 1.3.5 Ảnh hưởng thành phần môi trường nuôi cấy 13 1.4 NGHIÊN CỨU VỀ KỸ THUẬT NUÔI CẤY BAO PHẤN Ở DƯA CḤT ĐƠN BỢI VÀ CÁC CÂY TRONG HỌ BẦU BÍ .14 iv 1.4.1 Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy bao phấn giới 14 1.4.2 Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy bao phấn Việt Nam 17 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .19 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.1.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu .20 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 20 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.3.1 Phương pháp thu nụ dưa chuột 20 2.3.2 Phương pháp vào mẫu 20 2.3.3 Bố trí thí nghiệm xử lí thống kê 21 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 26 3.1 CÔNG THỨC KHỬ TRÙNG MẪU NỤ HOA 26 3.2 ẢNH HƯỞNG CỦA KIỂU GEN DƯA CHUỘT ĐẾN KHẢ NĂNG PHÁT SINH CALLUS 27 3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA KÍCH THƯỚC NỤ HOA DƯA CḤT ĐẾN KHẢ NĂNG PHÁT SINH CALLUS 28 3.4 ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN THU MẪU VÀ THỜI GIAN XỬ LÝ LẠNH ĐẾN HIỆU QUẢ TẠO CALLUS 29 3.4.1 Ảnh hưởng thời gian thu mẫu đến hiệu tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 29 3.4.2 Ảnh hưởng thời gian xử lý lạnh đến hiệu tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 30 3.5 ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG (ĐHST) ĐẾN SỰ PHÁT SINH CALLUS ĐƠN BỘI VÀ TÁI SINH CÂY 31 3.5.1 Ảnh hưởng nồng độ 2,4-D đến hiệu tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột .31 v 3.5.2 Ảnh hưởng nồng độ 2,4-D KIN đến hiệu tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 33 3.5.3 Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh từ callus bao phấn dưa chuột 34 3.5.4 Kết khảo sát ảnh hưởng KIN NAA đến khả tái sinh từ callus bao phấn dưa chuột 36 3.6 ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN HIỆU QUẢ TẠO CALLUS TỪ NUÔI CẤY IN VITRO BAO PHẤN DƯA CHUỘT 38 3.6.1 Điều kiện nhiệt độ .38 3.6.2 Điều kiện ánh sáng 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 Kết luận .41 Kiến nghị 41 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO .42 vi DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : Dichlorophenoxylacetic acid BAP : 6-Benzylaminopurine ĐHST : Điều hòa sinh trưởng KIN : Kinetin MS : Murashige Skoog (1962) NAA : α-Naphthaleneacetic acid SH : Schenk Hildebrandt (1972) TDZ : Thidiazuron vii DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu Tên bảng ảng 1.2 Thành phần dinh dưỡng ăn 100 dưa chuột 1.3 (Theo“Bảng thành phần hóa học thức ăn Việt Nam - 2007”) Tình hình sản xuất dưa cḥt của số nước giới giai đoạn 2012-2016 (Nguồn FAOSTAT 2018) Trang 1.4 Điều kiện nuôi cấy bao phấn một số tḥc họ bầu bí 16 2.1 Đặc điểm giống dưa cḥt sử dụng thí nghiệm 19 2.2 (Nguồn: East West Seed Lucky Seed) Các côngCông thức ty khử trùng 21 3.1 Hiệu của công thức khử trùng mẫu nụ hoa 26 3.2 Sự ảnh hưởng của kích thước nụ hoa dưa chuột đến khả 27 3.3 phát sinh callus Sự ảnh hưởng của thời gian thu mẫu đến khả phát sinh 30 callus 3.4 Sự ảnh hưởng của tiền xử lý lạnh (40C đến khả 31 phát sinh callus 3.5 Sự ảnh hưởng của 2,4-D đến phát sinh callus 32 3.6 Sự ảnh hưởng của 2,4-D KIN đến phát sinh callus 33 3.7 Ảnh hưởng của BAP đến khả tái sinh từ callus 35 3.8 3.9 3.10 bao phấn dưa chuột Ảnh hưởng của KIN đến khả tái sinh từ callus bao phấn dưa chuột Sự ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ đến khả tạo callus từ bao phấn dưa chuột Sự ảnh hưởng của điều kiện ánh sáng đến khả tạo callus từ bao phấn dưa chuột 36 38 39 viii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 3.1 3.2 Tên hình Hình callus phát sinh từ bao phấn Callus sau tuần nuôi cấy (A) Giống dưa chuột HMT 356 (B) Giống dưa chuột F1 Nhật 3.3 Sự ảnh hưởng của kích thước nụ hoa dưa chuột đến khả 3.4 Callus phát sinh mơi trường MS có bổ sung 0,33 mg/l 2,4-D phát sinh callus sau tuần nuôi cấy Trang 26 27 29 31 3.5 0,22 mg/l KIN, nụ hoa xử lý (4 C) ngày Sự tăng trưởng kích thước của callus 32 Callus phát sinh mơi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D 3.6 0,2 mg/l KIN quan sát kính hiển vi Thanh ngang tỷ lệ 34 mm 3.7 Tái sinh rễ từ phôi sau tuần nuôi cấy môi trường bổ sung 3.8 Tái sinh rễ từ phôi sau tuần nuôi cấy môi trường bổ sung BAP 1,0 mg/l, ngang tỉ lệ mm 35 36 BAP 1,0 mg/l, ngang tỉ lệ mm 3.9 Rễ từ phôi sau tuần nuôi cấy môi trường bổ sung BAP 1,0 3.10 Tái sinh rễ từ phôi sau tuần nuôi cấy môi trường bổ sung mg/l tái sinh trở lại mô sẹo; ngang tỉ lệ mm 36 37 KIN 4,0 mg/l; ngang tỉ lệ mm 3.11 3.12 Tái sinh rễ từ phôi sau tuần nuôi cấy môi trường bổ sung KIN 4,0 mg/l; ngang tỉ lệ mm Tái sinh rễ từ callus sau tuần nuôi cấy môi trường bổ sung KIN 4,0 mg/l; ngang tỉ lệ mm 37 37 Callus sau 3,4,5 tuần nuôi cấy với điều kiện nuôi cấy thích hợp 3.13 nhiệt đợ 320C ngày sau 250C các ngày 250C quá trình ni cấy, tối hồn tồn 39 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Cây dưa chuột (Cucumis sativus L.) mợt loại có giá trị kinh tế trồng phổ biến nhiều nơi giới, chúng sử dụng chủ yếu dạng tươi, có thể dùng để chế biến mợt số loại ăn, một phần bảo quản chế biến cho mục đích sử dụng lâu dài [10] Ngoài ra, dưa cḥt có giá trị mợt vị thuốc q, dưa cḥt có chứa hàm lượng vitamin C cao mợt số men có lợi kích thích tiêu hoá tốt cho sức khỏe Nhiều sản phẩm chế biến sau thu hoạch từ dưa chuột dưa cḥt muối, đóng hợp ưa cḥng giới Đối với Việt Nam dưa cḥt mợt sản phẩm có giá trị xuất cao, sản phẩm từ dưa chuột Việt Nam xuất sang nhiều thị trường rộng lớn như: Hoa Kỳ, Hàn Quốc, Đài Loan, Trung Quốc, Nhật Bản, Singapo… [10] Tính chung tháng đầu năm 2017 giá trị xuất dưa cḥt đạt 20 nghìn USD [2] Các tiêu chuẩn các quy định hình thức, chất lượng dưa chuột dùng xuất cao, bên cạnh yếu tố suất giống dưa chuột dùng cho mục đích cần đáp ứng yêu cầu khắt khe khác độ dày cùi, màu sắc vỏ, kích thước quả, thời gian bảo quản, hàm lượng chất [13].Thời gian gần đây, có nhiều cố gắng công tác chọn giống trồng, bộ giống dưa cḥt của nước ta hạn chế, giống dùng cho tiêu thụ nợi địa suất chất lượng thấp, giống dùng cho chế biến ít, hầu hết giống nhập nội từ Nhật Bản, Liên Bang Nga, Thái Lan…[2] Dưa chuột rau ăn ngắn ngày Ở nước ta có thể trồng nhiều vụ năm, cho thu hoạch nhiều đợt, suất trung bình đạt xấp xỉ 17 tấn/ha tương đương với suất trung bình tồn giới Trồng điều kiện nhà che phủ nylông ứng dụng công nghệ cao Hà Nội, suất đạt tới 120 tấn/ha, 1/3 suất dưa cḥt nước ngồi điều kiện tương tự [13] Mặc dù rau đa dụng, trồng phổ biến, song suất chất lượng dưa cḥt nước ta thấp, mợt phần sử dụng nhiều giống địa phương, độ đồng không cao, mẫu mã kém; giống lai nhập nợi có tính chống chịu yếu với sâu bệnh hại mơi 32 yếu để kích thích phân bào sinh trưởng của mô sẹo Mỗi chất riêng lẻ hoặc kết hợp với cho hiệu phát sinh callus khác Sử dụng giống dưa chuột, khử trùng mẫu Cồn 700 30 giây; Javen phút, nụ hoa có kích thước 11- 16 mm để thí nghiệm Kết ảnh hưởng của chất ĐHST thể bảng 3.5 Bảng 3.5 Sự ảnh hưởng 2,4-D đến phát sinh callus STT Nồng độ 2,4-D Tỉ lệ phát sinh (mg/l) callus (%) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 68,57 a 58,57 b 64,28 a 52,85 b 21,42 c 17,14 c ĐC CT1 CT CT CT CT CT Đường kính callus (mm) tuần tuần 5tuần 3,5 2,8 3,9 3,2 2,3 2,1 7,8 5,2 6,4 6,7 4,1 4,3 10,5 7,6 9,3 8,5 6,7 7,5 Chú thích: Dấu “–”: khơng có tượng phát sinh callus 10.5 9.3 7.8 8.5 7.6 6.4 7.5 6.7 6.7 5.2 3.5 3.9 2.8 tuần tuần 4.3 4.1 3.2 2.3 2.1 t̀n Hình 3.5: Sự tăng trưởng kích thước callus Qua bảng kết bảng 3.5 cho ta thấy nồng độ 2,4 D từ 0,5 – cho tỷ lệ bao phấn tạo callus Theo Đặng Thị Mai thành công việc tạo callus đơn bội dưa cḥt mơi trường MS có bổ sung 1,5mg/l 2,4-D [2] Nhưng thí nghiệm 33 cho phát sinh callus cao mơi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D có thể khác kiểu gen điều kiện ngoại cảnh trồng giống Callus thu nhỏ gọn, màu vàng nhạt, kết khối Sử dụng 2,4 D nồng đợ 0,5 mg/l cho thí nghiệm sau Trong q trình thí nghiệm nhận thấy 2,4 D ảnh hưởng đến tỷ lệ bao phấn tạo callus mà ảnh hưởng đến tăng trưởng của callus Tuỳ thuộc vào nồng độ 2,4-D bổ sung vào mơi trường khác tốc đợ tăng trưởng callus khác Sự tăng trưởng đường kính callus nhanh nhất, cụ thể đường kính tăng từ 3,510,5 mm bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D Khi bổ sung nồng độ 2,4-D từ 1,5 mg/l đến 2,5 mg/l tốc đợ tăng trưởng của callus chậm dần Bổ sung 2,4-D nồng độ 0,5 mg/l 1,5 mg/l cho tốc độ tăng trưởng callus tăng dần 3.5.2 Ảnh hưởng nồng độ 2,4-D KIN đến hiệu tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột Dựa theo kết của thí nghiệm trước, thí nghiệm tiến hành sử dụng 2,4 D nồng độ 0,5 mg/l nồng độ KIN bổ sung vào môi trường 0; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9;1,0 Theo dõi cơng thức thí nghiệm thu kết thể bảng 3.6.: Bảng 3.6 Sự ảnh hưởng 2,4-D KIN đến phát sinh callus STT Đối chứng CT CT CT CT CT CT CT CT CT Nồng độ KIN (mg/l) 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 Tỷ lệ bao phấn tạo callus 44,29 c 75,71 d 68,57 d 32,85 b 45,71 c 24,28 a - Chú thích: Dấu “–”: khơng có tượng phát sinh callus 34 Hình 3.6 Callus phát sinh mơi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D 0,2 mg/l KIN quan sát kính hiển vi Thanh ngang tỷ lệ mm Kết cho thấy bổ sung 2,4 D kết hợp với KIN vào mơi trường tạo callus có hiệu cao so với sử dụng 2,4 D Môi trường tạo callus hiệu từ nuôi cấy bao phấn dưa cḥt MS có bổ sung 3% sucrose, 0,8% agar, pH = 5,75 0,5 mg/l 2,4-D 0,2- 0,3 mg/l KIN (cảm ứng tạo callus 75,71% 68,57% với callus thu màu vàng nhạt) Với nồng độ KIN từ 0,7 mg/l trở lên, bao phấn không tạo callus Kết thu khác với thí nghiệm trước Theo kết nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Dung năm 2007 cho thấy kết hợp mg/l 2,4-D với mg/l KIN cho hiệu tạo callus cao dưa hấu Tuy nhiên, nghiên cứu của H.G Ashok Kumar giống dưa chuột Calypso Green Long cho thấy tạo callus mơi trường có bổ sung mg/l 2,4-D hoặc mg/l 2,4-D + mg/l BAP cho kết tốt 3.5.3 Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh từ callus bao phấn dưa chuột BAP chất điều tiết sinh trưởng có tác dụng tích cực việc kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian sinh trưởng của mô phân sinh làm hạn chế già hóa của tế bào Trong tái sinh từ callus nhân giống in vitro, BAP có vai trò đặc biệt quan trọng việc kích thích hình thành chồi non, định hệ số nhân chất lượng chồi 35 Bảng 3.7 Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh từ callus bao phấn dưa chuột Nồng độ chất KTST Tỷ lệ mô sẹo tạo rễ (%) (mg/l) 0,5 BAP 1,0 BAP 1,5 BAP 2,0 BAP 2,5 BAP 47,61 a 27,46 b 77,77 c 41,26 d 23,80 e - Màu sắc, số lượng, kích thước rễ (mm) Màu trắng, 1-3 rễ, dài 5-10 Màu trắng,1-2 rễ, dài 3-6 Màu vàng, 4- rễ, dài 10Màu trắng, 2-3 rễ, dài 6-10 Màu trắng,1- rễ, dài 3-6 Không tạo rễ Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p < 0,05 Đối với phương án đối chứng không bổ sung BAP mẫu tạo rễ (47,61%) Môi trường nuôi cấy bổ sung BAP (1,0 mg/l) cho tỷ lệ tạo rễ đạt cao chiếm 77,77% Rễ thu màu vàng, 4-5 rễ, dài 10-15 mm Ở môi trường nuôi cấy bổ sung BAP (2,5 mg/l) callus khơng tạo rễ Còn mơi trường có bổ sung BAP (1,5 mg/l) đạt giá trị trung bình 47,61 % Qua đó, mơi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l BAP cho hiệu tạo rễ đạt cao Hình 3.7 Tái sinh rễ từ phôi sau tuần nuôi cấy môi trường bổ sung BAP 1,0 mg/l, ngang tỉ lệ mm 36 Hình 3.8 Tái sinh rễ từ phơi sau tuần nuôi cấy môi trường bổ sung BAP 1,0 mg/l, ngang tỉ lệ mm Hình 3.9 Rễ từ phôi sau tuần nuôi cấy môi trường bổ sung BAP 1,0 mg/l tái sinh trở lại mô sẹo; ngang tỉ lệ mm 3.5.4 Kết khảo sát ảnh hưởng KIN NAA đến khả tái sinh từ callus bao phấn dưa chuột Kinetin thường sử dụng nuôi cấy tế bào thực vật để kích thích hình thành callus (kết hợp với auxin) tái tạo các mô chồi từ callus (có nồng đợ auxin thấp hơn) Bảng 3.8 Ảnh hưởng KIN NAA đến khả tái sinh từ callus bao phấn dưa chuột Nồng độ chất Tỷ lệ callus tạo rễ Màu sắc, số lượng, kích thước KTST (mg/l) (%) rễ (mm) 60,71 a Màu trắng, 4-5 rễ, dài 20-25 1,0 KIN + 0,01 NAA 19,04 b Màu trắng, 1-3 rễ, dài 10-15 2,0 KIN + 0,02 NAA 35,71 c Màu trắng, 3- rễ, dài 10-15 3,0 KIN + 0,03 NAA 47,61 d Màu trắng, 3-4 rễ, dài 12-17 4,0 KIN + 0,04 NAA 77,38 e Màu trắng, 5-7 rễ, dài 25-30 5,0 KIN + 0,05 NAA 5,95 f Màu trắng, 1-2 rễ, dài 7-12 37 Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p