Nghiên cứu quá trình tái sinh và nhân giống in vitro cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) bằng kỹ thuật cấy lớp mỏng tế bào

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - VŨ THỊ HIỀN NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TÁI SINH VÀ NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY LỚP MỎNG TẾ BÀO LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC TP HỒ CHÍ MINH – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - VŨ THỊ HIỀN NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TÁI SINH VÀ NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY LỚP MỎNG TẾ BÀO Chuyên ngành Mã số : Sinh lý học thực vật : 9.42.01.12 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS Dương Tấn Nhựt TS Thái Xuân Du TP HỒ CHÍ MINH - 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn PGS.TS Dương Tấn Nhựt Nghiên cứu thực hỗ trợ kinh phí đề tài dự án Phòng Sinh học Phân tử Chọn tạo giống trồng Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên: (1) Đề tài cấp quốc gia: Hệ thống chiếu sáng đơn sắc - nguồn sáng nhân tạo cho nghiên cứu tái sinh nhân giống số loại trồng nuôi cấy in vitro, Mã số: 106.16-2012.32, Quỹ phát triển khoa học Công nghệ Quốc (NAFOSTED) thuộc Khoa học Công nghệ quản lý; (2) Dự án sản xuất cấp Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam: “Hồn thiện quy trình nhân giống sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) với số lượng lớn hệ thống chiếu sáng đơn sắc (LED) phục vụ nhu cầu tỉnh Quảng Nam Toàn số liệu kết nghiên cứu luận án trung thực chưa sử dụng để cơng bố cơng trình nghiên cứu để nhận học vị, thơng tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm cam đoan Đà Lạt, ngày… tháng… năm 2018 Người cam đoan Vũ Thị Hiền ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, suốt thời gian vừa qua nhận nhiều động viên giúp đỡ q thầy cơ, đồng nghiệp, bạn bè người thân gia đình Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Dương Tấn Nhựt (Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên), thầy Thái Xuân Du (Viện Sinh học Nhiệt đới) Quí thầy tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tạo điều kiện thuận lợi để tơi hoàn thành luận án Cảm ơn ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, Viện Sinh học Nhiệt đới tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập trình thực đề tài Cảm ơn anh, chị em Phòng Sinh học Phân tử Chọn tạo giống trồng - Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên giúp đỡ suốt thời gian qua Cảm ơn tất anh, em nghiên cứu sinh Viện Sinh học Nhiệt Đới, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam, Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Khoa học Huế học tập, nghiên cứu, chia sẻ động viên suốt thời gian học tập thực luận án Một tình cảm sâu sắc từ tận đáy lòng, xin dành gửi đến gia đình tơi, người nguồn động viên to lớn cho tôi, tạo điều kiện học tập nghiên cứu suốt năm học vừa qua Và cuối tình thương yêu mẹ gửi đến hai yêu quý mẹ Cảm ơn hai ln bên giúp mẹ có thêm nghị lực để vượt qua khó khăn, vất vả sống Mẹ mong hai mạnh khỏe, ngoan học giỏi Đà Lạt, tháng … năm 2018 Vũ Thị Hiền iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT xi DANH MỤC BẢNG xii DANH MỤC HÌNH xviii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu yêu cầu đề tài Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 3.1 Phương pháp luận đề tài 3.2 Ý nghĩa khoa học đề tài 3.3 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Đối tượng phạm vi nghiên cứu đề tài 4.1 Đối tượng nghiên cứu 4.2 Phạm vi nghiên cứu đề tài Những đóng góp luận án CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chi Nhân Sâm 1.1.1 Hệ thống phân loại chi nhân sâm 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.4 Giá trị kinh tế y học Nhân sâm 1.1.4.1 Giá trị kinh tế 1.1.4.2 Nhân sâm y học cổ truyền 1.1.4.3 Nhân sâm y học đại 1.1.5 Tác dụng dược lý sâm Triều Tiên Panax ginseng C.A Meyer, Korean ginseng 1.2 Sơ lược sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 1.2.1 Nguồn gốc lịch sử phát triển 1.2.2 Hình thái thực vật iv 1.2.3 Phân bố 11 1.2.4 Thành phần hoá học 11 1.2.4.1 Thành phần hợp chất saponin 12 1.2.4.2 Các thành phần khác 14 1.2.5 Các tác dụng sâm Ngọc Linh 14 1.2.6 Độc tính 15 1.2.6.1 Rễ thân rễ 15 1.2.6.2 Thân 15 1.2.7 Giá trị kinh tế sâm Ngọc Linh 16 1.2.8 Tình hình trồng sâm Ngọc Linh 16 1.2.8.1 Hiện trạng tiềm sâm Ngọc Linh 16 1.2.8.2 Các khu vực trồng Sâm Ngọc Linh 17 1.2.8.3 Chăm sóc bảo vệ 18 1.2.8.4 Sâu bệnh hại sâm Ngọc Linh 18 1.2.9 Tình hình nghiên cứu sâm Ngọc Linh 19 1.2.9.1 Nhân giống truyền thống 21 1.2.9.2 Nghiên cứu nhân giống vơ tính 22 1.2.9.3 Nghiên cứu hạt nhân tạo 23 1.2.9.4 Nghiên cứu phát sinh phôi 23 1.2.9.5 Nghiên cứu hình thành rễ thứ cấp rễ bất định 24 1.2.9.6 Nghiên cứu ảnh hưởng ánh sáng 25 1.2.9.7 Nghiên cứu nhân sinh khối 25 1.2.9.8 Nghiên cứu tạo củ in vitro 26 1.2.9.9 Nghiên cứu định tính định lượng saponin 27 1.3 Kỹ thuật lớp mỏng tế bào 27 1.3.1 Khái niệm lớp mỏng tế bào 27 1.3.2 Định nghĩa hệ thống lớp mỏng tế bào 28 1.3.3 Những đặc điểm hệ thống lớp mỏng tế bào 29 1.3.4 Ưu điểm hệ thống lớp mỏng tế bào 29 1.3.5 Một số thành tựu đạt ứng dụng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào đối tượng Panax 30 1.3.5.1 Ứng dụng hệ thống TCL đối tượng Panax ginseng 30 v 1.3.5.2 Ứng dụng hệ thống TCL đối tượng sâm Ngọc Linh 31 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả phát sinh hình thái 31 1.4.1 Loại mẫu cấy 31 1.4.2 Tuổi tuổi sinh lý mẫu 31 1.4.3 Điều kiện phát triển mẫu 32 1.4.4 Vị trí mẫu cấy 32 1.4.5 Kích thước mẫu cấy 32 1.4.6 Vết thương 32 1.5 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (phytohormones) 33 1.5.1 Auxin 33 1.5.2 Cytokinin 34 1.6 Vai trò ánh sáng tái sinh, sinh trưởng phát triển thực vật 34 1.7 Quá trình tái sinh 35 1.7.1 Giai đoạn phản biệt hóa 35 1.7.2 Giai đoạn cảm ứng với chất điều hòa sinh trưởng thực vật 36 1.7.3 Giai đoạn phát sinh quan hình thành chồi 36 1.7.4 Chuyển vườn ươm, giai đoạn cuối tái sinh 36 CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1 Vật liệu nghiên cứu 37 2.1.1 Vật liệu 37 2.1.2 Thiết bị - dụng cụ, hóa chất dung môi 37 2.1.2.1 Thiết bị - dụng cụ 37 2.1.2.2 Hóa chất dung mơi 38 2.2 Nội dung nghiên cứu 38 2.2.1 Nội dung 1: Nghiên cứu trình phát sinh hình thái từ nguồn mẫu khác 38 2.2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu sinh trưởng phát triển in vitro điều kiện sinh thái khác 39 2.2.3 Nội dung 3: Định tính định lượng saponin sâm in vitro sâm hoàn chỉnh giai đoạn vườn ươm 39 2.3 Phương pháp nghiên cứu 39 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu phát sinh hình thái 39 vi 2.3.2 Phương pháp giải phẫu hình thái thực vật quan sát kính hiển vi soi 39 2.3.3 Phương pháp phân tích hàm lượng saponin 40 2.3.3.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 40 2.3.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC: High Performance Liquid Chromatography) 40 2.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 40 2.4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu trình phát sinh hình thái từ nguồn mẫu khác 40 2.4.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng CĐHSTTV riêng lẻ lên phát sinh hình thái mẫu tTCL_L điều kiện chiếu sáng tối hoàn toàn 40 2.4.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng CĐHSTTV riêng lẻ lên phát sinh hình thái mẫu cuống tTCL_L điều kiện sáng tối hoàn toàn 42 2.4.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng CĐHSTTV riêng lẻ lên phát sinh hình thái mẫu cuống lTCL_C điều kiện sáng tối hoàn toàn 43 2.4.1.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng CĐHSTTV riêng lẻ lên phát sinh hình thái mẫu thân củ tTCL_R điều kiện sáng tối hoàn toàn 44 2.4.1.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng kết hợp auxin cytokinin lên phát sinh hình thái mẫu tTCL_L điều kiện sáng tối hoàn toàn 45 2.4.1.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng kết hợp auxin cytokinin lên phát sinh hình thái mẫu cuống tTCL_C điều kiện chiếu sáng tối hoàn toàn 47 2.4.1.7 Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng kết hợp auxin cytokinin lên phát sinh hình thái mẫu cuống lTCL_C điều kiện chiếu sáng tối hoàn toàn 48 vii 2.4.1.8 Thí nghiệm 8: Khảo sát ảnh hưởng kết hợp auxin cytokinin lên phát sinh hình thái mẫu thân củ tTCL_R điều kiện chiếu sáng tối hoàn toàn 50 2.4.1.9 Giải phẫu hình thái học 52 2.4.1.10 Tạo hồn chỉnh từ phơi vơ tính 52 2.4.2 Nội dung 2: Nghiên cứu sinh trưởng phát triển in vitro điều kiện sinh thái khác 52 2.4.2.1 Thí nghiệm 09: Nghiên cứu q trình sinh trưởng phát triển sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro đem trồng Quảng Nam 52 2.4.2.2 Thí nghiệm 10: Nghiên cứu q trình sinh trưởng phát triển sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro đem trồng khu vực Cổng Trời, Vườn Quốc gia Bidoup - Núi Bà (Lâm Đồng) 53 2.4.3 Nội dung 3: Định tính định lượng saponin sâm in vitro sâm hoàn chỉnh giai đoạn vườn ươm 54 2.4.3.1 Thí nghiệm 11: Định tính saponin sâm Ngọc Linh in vitro, sâm tháng, năm năm tuổi trồng Quảng Nam 54 2.4.3.2 Thí nghiệm 12: Định lượng saponin sâm Ngọc Linh in vitro, sâm tháng, năm năm tuổi trồng Quảng Nam 54 2.5 Phương pháp xử lý thống kê 56 2.6 Điều kiện nuôi cấy 56 2.6.1 Điều kiện in vitro 56 2.6.2 Điều kiện ex vitro 56 2.7 Thời gian địa điểm thực đề tài nghiên cứu 56 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 58 3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 58 3.1.1 Nghiên cứu trình phát sinh hình thái từ nguồn mẫu khác 58 3.1.1.1 Ảnh hưởng CĐHSTTV riêng lẻ lên phát sinh hình thái mẫu tTCL_L điều kiện chiếu sáng tối hoàn toàn 58 3.1.1.2 Ảnh hưởng CĐHSTTV riêng lẻ lên phát sinh hình thái mẫu cuống tTCL_C điều kiện chiếu sáng tối hoàn toàn 63 viii 3.1.1.3 Ảnh hưởng CĐHSTTV riêng lẻ lên phát sinh hình thái mẫu cuống lTCL_C điều kiện chiếu sáng tối hoàn toàn 65 3.1.1.4 Ảnh hưởng CĐHSTTV riêng lẻ lên phát sinh hình thái mẫu thân rễ tTCL_R điều kiện chiếu sáng tối hoàn toàn 69 3.1.1.5 Ảnh hưởng kết hợp auxin cytokinin lên phát sinh hình thái mẫu tTCL_L điều kiện chiếu sáng tối hoàn toàn 73 3.1.1.6 Ảnh hưởng kết hợp auxin cytokinin lên phát sinh hình thái mẫu cuống tTCL_C điều kiện chiếu sáng tối hoàn toàn 80 3.1.1.7 Ảnh hưởng kết hợp auxin cytokinin lên phát sinh hình thái mẫu cuống lTCL_L điều kiện chiếu sáng tối hoàn toàn 86 3.1.1.8 Ảnh hưởng kết hợp auxin cytokinin lên phát sinh hình thái thân rễ tTCL_R điều kiện chiếu sáng tối hoàn toàn 94 3.1.1.9 Quan sát thay đổi hình thái phơi vơ tính sâm Ngọc Linh 102 3.1.1.10 Tạo hồn chỉnh từ phơi vơ tính 103 3.1.2 Nghiên cứu sinh trưởng phát triển in vitro điều kiện sinh thái khác 104 3.1.2.1 Nghiên cứu trình sinh trưởng phát triển sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro đem trồng Quảng Nam 104 3.1.2.2 Nghiên cứu trình sinh trưởng phát triển sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro Khu vực Cổng Trời, Vườn Quốc gia Biđoup - Núi Bà Lâm Đồng 107 3.1.3 Định tính định lượng saponin sâm in vitro sâm hoàn chỉnh giai đoạn vườn ươm 109 3.1.3.1 Định tính saponin sâm in vitro, sâm tháng, năm năm tuổi trồng núi Ngọc Linh 109 3.1.3.2 Định lượng saponin sâm in vitro, sâm tháng tuổi, năm tuổi năm tuổi trồng núi Ngọc Linh 110 3.2 THẢO LUẬN 113 3.2.1 Nghiên cứu trình phát sinh hình thái từ nguồn mẫu khác 113 3.2.1.1 Q trình phát sinh phơi vơ tính 114 3.2.1.2 Quá trình tái sinh chồi bất định 116 ... hồn chỉnh, vv Chính vậy, đề tài Nghiên cứu trình tái sinh nhân giống in vitro sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào tiến hành với mục đích thu số... 3.1.2.1 Nghiên cứu trình sinh trưởng phát triển sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro đem trồng Quảng Nam 104 3.1.2.2 Nghiên cứu trình sinh trưởng phát triển sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro Khu... DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - VŨ THỊ HIỀN NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TÁI SINH VÀ NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY SÂM NGỌC LINH (Panax