Công nghệ nuôi cấy tế bào sâm ngọc linh

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH CHƯƠNG I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Đặt vấn đề: Nhân sâm Panax ginseng C A Meyer dược liệu sử dụng từ hàng ngàn năm Những tác dụng y học Nhân Sâm, dùng y học cổ truyền, chứng minh theo nguyên lý y học đại Nhân Sâm từ thuốc huyền thoại phương Đông xuất rộng rãi phương Tây, với sản phẩm thương mại đa dạng Nhân Sâm ngày thuốc mang lại giá trị kinh tế to lớn Việt Nam tự hào có lồi Nhân Sâm đặc hữu Sâm Ngọc Linh (hay gọi Sâm Khu Năm) Panax vietnamensis Ha & Grutzv., biết đến giới với tên gọi Vietnamese ginseng Sâm Ngọc Linh có thành phần ginsenosid, dược chất Nhân sâm, đánh giá vào loại nhiều so với loài khác chi Panax giới Tuy nhiên, Sâm Ngọc Linh phát muộn (vào năm 1985) cho nên, có nhiều cố gắng để phát triển thuốc quý giá tiềm Sâm Ngọc Linh chưa hoàn toàn đánh thức Cộng với địa bàn phân bố hẹp (chỉ có vùng núi Ngọc Linh), lại bị khai thác bừa bãi, nên Sâm Ngọc Linh sớm đứng trước nguy tuyệt chủng Với nỗ lực địa phương có Sâm Ngọc Linh phân bố, lồi dược liệu tránh bị tuyệt diệt Nhưng để đưa Sâm Ngọc Linh thành thuốc ngang hàng với loại Nhân sâm có thị trường dược liệu số lượng chất lượng, cần có nhiều nghiên cứu chuyên sâu ứng dụng sản xuất hiệu Trên giới, Nhân Sâm Panax ginseng C A Meyer nhân giống sản xuất dược chất ginsenosid thành công nuôi cấy mô Ginsenosid chiết từ mô sẹo ni cấy mơ Nhân sâm có dạng với ginsenosid thu từ rễ Nhân Sâm tự nhiên, tác dụng dược lý dịch chiết rượu methanol bột ginsenosid từ mô sẹo giống với dịch chiết bột thu từ rễ Nhân Sâm tự nhiên Do có hệ thống ni cấy lớn bioreactor dùng để sản xuất ginsenosid theo quy mô công nghiệp, cung cấp cho thị trường tiêu thụ ngày rộng lớn, khắc phục hạn chế canh tác Nhân Sâm như: thời gian trồng kéo dài, bị giới hạn khí hậu, thổ nhưỡng, nhiều sâu bệnh SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Sâm Ngọc Linh giới biết đến với tên gọi Vietnamese ginseng khơng có nhiều nhà khoa học quốc tế lưu ý nghiên cứu Việt Nam cần tự nghiên cứu sản xuất, cố gắng đánh thức giá trị y học giá trị kinh tế Sâm Ngọc Linh Trong hướng nghiên cứu, hướng nuôi cấy mô thật đưa nông nghiệp lên bước phát triển tiên tiến, muốn nghiên cứu đưa Sâm Ngọc Linh phát triển theo hướng đại, mang lại hiệu kinh tế cao bỏ qua kỹ thuật Thực tế, Sâm Ngọc Linh nhân giống thành công từ mô sẹo Nhưng tiến bước để sản xuất ginsenosid Sâm Ngọc Linh ni cấy mơ chưa có nghiên cứu cơng bố Với mong muốn tìm hiểu loại trồng có giá trị kinh tế với công nghệ nuôi cấy tế bào thực nhằm mục đích nhân giống sản xuất hợp chất có giá trị kinh tế, tơi thực khóa luận tốt nghiệp: “Cơng nghệ nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) hướng dẫn thầy Bùi Văn Thế Vinh 1.2 Mục đích đề tài: - Tổng quan Sâm Ngọc Linh - Tìm hiểu số công nghệ nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH CHƯƠNG II TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.1 Khái niệm Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật mô tả phương pháp nuôi cấy phận thực vật ( tế bào đơn, mô, quan…) điều kiện vô trùng  Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa hai nguyên tắc: - Dựa vào tính tồn tế bào: Mỗi tế bào thể sinh vật đa bào có khả tiềm tàng để phát triển thành cá thể hoàn chỉnh gặp điều kiện thuận lợi Mỗi tế bào hệ thống mở, tự trì tự sản xuất để tiến hành chức chuyên biệt sản sinh hệ tế bào cần thiết - Dựa vào khả biệt hóa phản biệt hóa tế bào: Biệt hóa biến đổi tế bào từ trạng thái tế bào phôi thể chức Các tế bào dùng mơi trường cấy có khả biệt hóa cấu trúc chức Trong điều kiện thích hợp, làm cho tế bào trở lại trạng thái tế bào sinh chúng - tế bào phơi q trình gọi q trình phản biệt hóa Vì tế bào gần với trạng thái tế bào phơi khả ni cấy thành công cao nhiêu  Ý nghĩa: - Nhân nhanh giống trồng - Bảo quản nguồn gen - Tạo bệnh - Sản xuất hoạt chất sinh học - Mang tính cơng nghiệp  Sơ lược lịch sử phát triển: SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP - GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 1665: Robert Hooke quan sát tế bào sống kính hiển vi đưa khái niệm tế bào - 1838: Matthias Schleiden Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào - 1904: Hannig nuôi cấy phôi loài họ cải - 1934: Kogl xác định vai trò IAA - 1951: Skoog nghiên cứu sử dụng hố chất điều hồ sinh trưởng phát sinh quan - 1952: Morel Martin thực vi ghép invitro thành công - 1962: Murashige Skoog phát minh môi trường nuôi cấy tế bào thực vật - 1964: Guha Maheshwari lần thành công tạo đơn bội từ nuôi cấy bao phấn cà rốt - 1969: Phân lập tế bào trần từ nuôi cấy tế bào dịch lỏng (huyền phù) Hapopappus gracilis - 1973: Phát Cytokinin có khả phá ngủ Gerberas - 1978: Marton cộng xây dựng quy trình chuyển gen vào tế bào trần - 1983: Công ty Mitsui Petrochemicals lần sản xuất chất trao đổi thứ cấp quy mô công nghiệp nuôi cấy tế bào dịch lỏng Lithospermum spp Mitsui 0Petrochemicals - 1988: Klein cộng tái sinh chuyển gen phương pháp bắn gen - 1994: Thương mại hóa giống cà chua chuyển gen FlavrSavr 2.1.2 Các kỹ thuật nuôi cấy 2.1.2.1 Nuôi cấy phôi Phôi phát triển qua hai giai đoạn dị dưỡng tự dưỡng Ở giai đoạn dị dưỡng cần có chất điều hòa sinh trưởng để phát triển Trong ni cấy phơi, đường đóng vai trò quan trọng, đường sucrose cho nhiều kết tốt Ngoài số chất tự nhiên nước dừa, dịch chiết malt, casein thủy phân chất cần ni cấy phơi Đối với chất điều hòa SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH sinh trưởng, auxin thường dùng nồng độ thấp, kinetin có vai trò đặc biệt cho phát triển phôi Nhiệt độ, ánh sáng ảnh hưởng đến phát triển phôi, thường phôi nuôi cấy cần nhiệt độ, ánh sáng thấp phôi phát triển tự nhiên Nhiệt độ 25 ± oC thích hợp cho sinh trưởng nảy mầm phơi Các phơi thứ cấp khó sinh trưởng hoạt động chúng tách rời nuôi điều kiện chiếu sáng 4.000 lux chiếu sáng suốt ngày nuôi  Kỹ thuật nuôi cấy phôi mang lại nhiều hiệu như: - Nhân giống trồng - Thử sức sống phơi hạt - Duy trì phơi yếu cứu phơi lai xa - Sản xuất hạt nhân tạo mà chất tế bào phôi 2.1.2.2 Nuôi cấy mô quan tách rời Trong nuôi cấy mô quan tách rời, khâu chọn mẫu có tầm quan trọng đặc biệt, mẫu phải tình trạng sinh lý tốt phát triển Nhu cầu dinh dưỡng nuôi cấy phận khác khác có số yêu cầu chung nguồn carbon, nguồn đường, nguyên tố đa lượng, vi lượng chất điều hòa sinh trưởng Muốn trì sinh trưởng phát triển quan nuôi cấy cần thường xuyên cấy chuyền qua môi trường Đối với nuôi cấy mô cần bổ sung thêm chất hữu chứa nitơ dạng acide amine, đường inositol Trong trường hợp nuôi cấy mô, chất điều hòa sinh trưởng có vai trò quan trọng mơ tách rời khơng có khả tổng hợp chất  Nuôi cấy mô quan tách rời ứng dụng trong: - Nghiên cứu điều kiện sinh trưởng phận mô - Nhân invitro - Tạo mô sẹo phục vụ cho nghiên cứu chọn dòng tế bào, đột biến soma, … SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 2.1.2.3 Nuôi cấy mô phân sinh Đặc điểm mô phân sinh chứa tế bào non trẻ, phân chia mạnh, khơng bị virus xâm nhập, mơ phân sinh mô virus Mô phân sinh thường mô đỉnh chồi cành Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ mầm non, chồi hình thành cành non Trong nuôi cấy cân chất điều hòa sinh trưởng quan trọng Muốn tạo chồi cần bổ sung cytokinin tổ hợp cytokinin với auxin, muốn tạo rễ bổ sung auxin  Nuôi cấy mô phân sinh sử dụng trong: - Tạo virus - Nhân giống invitro - Tạo đa bội qua xử lý colchicin - Nghiên cứu q trình hình thành quan 2.1.2.4 Ni cấy bao phấn hạt phấn Ưu điểm nuôi cấy bao phấn đơn giản thao tác kỹ thuật mơi trường ni cấy, tạo lưỡng bội từ soma thành bao phấn, khó phân biệt với tự lưỡng bội từ đơn bội Hạt phấn ni cấy phát triển thành đơn bội hoàn chỉnh điều kiện nuôi cấy invitro đường tạo phôi trực tiếp gián tiếp thông qua tạo mô sẹo tạo quan Phương pháp tạo đơn bội kép phương pháp chọn lọc tạo giống có hiệu chọn lọc cao, đặc biệt kết hợp với phương pháp tạo biến dị di truyền khác lai hữu tính gây đột biến nhân tạo Thành phần môi trường nuôi cấy thay đổi tùy thuộc vào kiểu gen tuổi bao phấn điều kiện mà cho bao phấn sinh trưởng Quá trình sinh trưởng sau phơi hạt phấn đòi hỏi bổ sung muối khống vào mơi trường Tần số phát sinh đơn bội sinh trưởng nói chung tốt chúng nuôi điều kiện chiếu sáng, hạt phấn số kiểu gen sinh trưởng hai điều kiện có chiếu sáng tối SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH  Nuôi cấy bao phấn hạt phấn dùng cho tạo dòng để: - Nghiên cứu gen lặn chúng khơng biểu thể dị hợp tử - Chọn dòng đột biến 2.1.2.5 Ni cấy tế bào đơn Tế bào đơn nhận đường nghiền mô, xử lý enzyme Sau chúng ni cấy dịch lỏng, có khuấy lắc tạo điều kiện thuận lợi cho trao đổi khí tiếp xúc với mơi trường dinh dưỡng Tế bào đơn lọc nuôi cấy môi trường đặc biệt tăng sinh khối Mỗi loại cây, loại tế bào khác đòi hỏi kỹ thuật nuôi cấy khác Yêu cầu dinh dưỡng cho nuôi cấy tế bào đơn phức tạp, chúng bị nhiều chất cần thiết cho sinh trưởng tách rời khỏi quần thể tế bào  Nuôi cấy tế bào đơn sử dụng cho mục đích: - Chọn dòng tế bào - Nghiên cứu cấu trúc tế bào, phát triển phân hóa tế bào điều kiện khác - Thu nhận chất trao đổi thứ cấp 2.1.2.6 Nuôi cấy protoplast Tế bào trần tế bào tách bỏ thành tế bào phương pháp học hay sử dụng enzyme Trong điều kiện ni cấy phù hợp protoplast tái sinh thành tế bào mới, phân chia tái sinh thành hoàn chỉnh Ưu kỹ thuật tách nuôi cấy tế bào trần tế bào màng cứng, trạng thái đơn bào, mật độ tế bào thu đơn vị thể tích mơi trường cao (đạt 10 tế bào/1ml môi trường)  Ứng dụng nuôi cấy protopast: - Tạo lai soma - Chuyển bào quan chuyển gen Q trình dung hợp protoplast thực hai đối tượng loài hay khác lồi - Q trình sinh tổng hợp màng tế bào SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 2.1.3 Môi trường nuôi cấy  Thành phần môi trường nuôi cấy gồm năm thành phần sau: - Muối khoáng đa lượng - Muối khoáng vi lượng - Vitamin - Nguồn carbon - Chất điều hòa sinh trưởng - Ngồi bổ sung thành phần không xác định (nước dừa, dịch chiết nấm men,…) agar  Môi trường nuôi cấy chia thành ba loại: - Mơi trường nghèo dinh dưỡng: White, Knop - Mơi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: Gamborg - Mơi trường giàu dinh dưỡng: MS Cơ sở cho việc xây dựng môi trường nuôi cấy xem xét thành phần cần cho sinh trưởng phát triển Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào mơ thực vật thay đổi tùy theo lồi phận nuôi cấy Đối với mẫu cấy tùy theo mục đích thí nghiệm thành phần mơi trường thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa mẫu cấy Tế bào mơ thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng phát triển nuôi cấy Độ pH môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới trình thu nhận chất dinh dưỡng từ mơi trường vào tế bào Vì cần điều chỉnh độ pH mơi trường thích hợp trước nuôi cấy Thường sử dụng NaOH hay HCl loãng để điều chỉnh độ pH SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 2.1.4 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 2.1.4.1 Auxin Auxin nhóm chất điều hòa sinh trưởng sử dụng rộng rãi nuôi cấy mô thực vật IAA auxin tự nhiên có mơ thực vật, NAA, IBA, 2,4-D auxin nhân tạo, thường auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh Chúng có mặt phận mơ phân sinh đỉnh, phận non khác  Sự áp dụng loại nồng độ auxin môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: - Kiểu tăng trưởng phát triển cần nghiên cứu - Hàm lượng auxin nội sinh mẫu cấy - Khả tổng hợp auxin tự nhiên mẫu cấy - Sự tác động qua lại auxin ngoại sinh auxin nội sinh - Đặc tính auxin  Vai trò chất thuộc nhóm auxin: - Kích thích phân chia kéo dài tế bào - Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ức chế sinh trưởng chồi bên - Kích thích phân hố mơ dẫn - Ảnh hưởng khác rụng lá, quả, đậu quả, phát triển chín quả, hoa mối quan hệ với điều kiện môi trường - Tạo nhân nhanh mô sẹo (callus) - Kích thích tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp) - Tạo phôi soma (2,4-D) 2.1.4.2 Cytokinin Các cytokinin dẫn xuất adenine Các cytokinin sử dụng thường xuyên BAP, Zeatin 2-iP cytokinin tự nhiên, BA kinetin cytokinin nhân tạo Chúng hòa tan NaOH HCl loãng Tỷ lệ auxin/cytokinin quan trọng phát sinh hình thái hệ thống ni cấy Đối với phát sinh phôi (embryogenesis), để tạo callus rễ cần SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH có tỷ lệ auxin/ cytokinin cao, trường hợp ngược lại dẫn đến sinh sản chồi chồi nách Cytokinin có mặt mơ phân sinh đỉnh rễ, non  Chức chủ yếu cytokinin: - Kích thích phân chia tế bào - Tạo nhân callus - Kích thích phát sinh chồi ni cấy mơ - Kích thích phát sinh chồi nách kìm hãm ảnh hưởng ưu chồi đỉnh - Làm tăng diện tích phiến kích thích lớn lên tế bào - Có thể làm tăng mở khí khổng số lồi - Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao) - Ức chế hình thành rễ - Ức chế kéo dài chồi - Ức chế trình già (hố vàng rụng) lá, kích thích tạo diệp lục 2.1.4.3 Gibberellin Trong số 20 chất thuộc nhóm gibberellin, GA3 chất sử dụng nhiều thực tiễn GA3 kích thích kéo dài chồi nảy mầm phơi vơ tính GA3 có tính hồ tan nước Gibberellin tạo đỉnh rễ, chồi, non, hạt  Gibberellin có chức sau: - Kích thích kéo dài chồi tăng cường phân bào kéo dài tế bào - Phá ngủ hạt giống củ giống - Kiểm soát hoa năm tuổi - Ức chế hình thành rễ bất định - Kích thích sinh tổng hợp α-amylase hạt ngũ cốc nảy mầm - Các chất ức chế tổng hợp kích thích q trình tạo củ (thân củ, thân hành củ) - Kích thích nảy mầm phấn hoa sinh trưởng ống phấn - Có thể gây tạo khơng hạt làm tăng kích thước nho khơng hạt - Có thể làm chậm hố già có múi 2.1.4.4 Abscisic acid (ABA) SVTH: NGUYỄN THỊ THU 10 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Đối với Sâm Ngọc Linh phận thí nghiệm đầu (mầm, thân, rễ) Chọn chồi mọc thẳng hay chồi bên làm nguyên liệu ni cấy có chiều dài 2-3 cm, cắt bỏ hết lá, xử lý cồn 70 % phút tủ cấy vơ trùng, sau tráng lại lần nước cất vơ trùng, sau xử lý mẫu dung dịch hypoclorid canxi hay HgCl2 sau tráng nước cất vơ trùng nhiều lần cho hết chất khử trùng Sau khử trùng xong cắt phần đầu có màu xanh, chiều dài 0.4 cm đặt vào môi trường Bảng 3.1: Ảnh hưởng loại nồng độ khử trùng: Mẫu Số mẫu Sâm 10 HgCl2 Ngọc Linh Thời (Mầm, gian thân, (phút) 100% 0.2% 10 15 100% 100% 20 0.3% 15 20 20% 40% 40% Chết Chết 0.4% Chết rễ) Mẫu Sâm Số mẫu Ca(OCl)2 10 Ngọc Linh Thời (mầm, gian thân, (phút) 10 5% 15 20 100% 100% 100% rễ)  Kết quả: SVTH: NGUYỄN THỊ THU 34 10% 10 15% 15 10 40% Chết Chết Chết Chết KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Sâm Ngọc Linh xử lý HgCl với nồng độ 0.2 % thời gian 20 phút tỷ lệ nhiễm thấp (20%) tỷ lệ nhiễm không cao (80%) Còn xử lý Ca(OCl)2 với nồng độ 10%, thời gian phút tỷ lệ nhiễm thấp (10 %) tỷ lệ không nhiễm cao (90%) (Bảng 3.1) 3.6.2 Khảo sát ảnh hưởng tổ hợp hoocmon lên phát sinh hình thái: Sử dụng mẫu mầm, thân, rễ Sâm Ngọc Linh Nuôi cấy phối hợp tổ hợp môi trường khác để đánh giá phát sinh hình thái Bảng 3.2: Ảnh hưởng tổ hợp hoocmon lên phát sinh hình thái Sâm Ngọc Linh cấy mơ: Bộ Đối phận tượng cấy Hoccmon sinh hình thái IBA Sâm Mầm, Ngọc IAA NAA 0.2 0.5 0.5 K 2ip G 0.2 0.5 0.5 0.25 0.2 0.5 thân, rễ Linh Kết phát 0.5 0.5 1 0.5 0.5 Chết Chết Callus Callus Rễ Phôi soma Phôi chồi Rễ Chồi  Kết quả: - Với tổ hợp hoocmon IBA 0.5 + 2ip Sâm Ngọc Linh phát sinh phôi soma - Với tổ hợp hoocmon NAA + G phát sinh phơi chồi - Với tổ hợp hoocmon NAA + 2ip 0.5 phát sinh rễ 3.6.3 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng lên khả tạo mô sẹo từ cuống lá: Tùy theo loại mẫu cấy, ánh sáng cần không cần suốt thời gian tạo mô sẹo Đối với mẫu lá, đa số trường hợp tạo mô sẹo tối thường tốt SVTH: NGUYỄN THỊ THU 35 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH sáng Tuy nhiên, số trường hợp mẫu cấy lại tạo mô sẹo tốt điều kiện sáng Môi trường tốt cho tạo mô sẹo ban đầu từ mẫu cuống dùng để khảo sát điều kiện chiếu sáng Mẫu đặt hai điều kiện tối hoàn toàn chiếu sáng (16 giờ/ ngày) Bảng 3.3: Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng lên khả tạo mô sẹo từ cuống lá: 2,4-D (mg/l) 0.5 1.0 2.0 3.0 0.5 1.0 2.0 3.0 Bộ phận Phần trăm tạo mơ sẹo (%) Chiếu sáng (16 giờ/ ngày) Tối hồn toàn 20 90 90 80 100 100 100 100 30 80 90 80 100 100 100 100 Lá Cuống  Kết quả: Kết bảng 3.3 cho thấy tỷ lệ phát sinh mô sẹo mẫu cuống gần tương đương hai điều kiện chiếu sáng tối, lượng mô sẹo điều kiện tối chất lượng mơ sẹo có tượng thủy tinh thể, mơi trường có 3.0 mg/l 2,4-D 3.6.4 Ảnh hưởng kích thước mẫu cấy ban đầu lên tăng sinh mô sẹo: Mô sẹo cắt theo ba kích thước: KT1, KT2, KT3 Mẫu mơ sẹo với kích thước xác định cấy vào môi trường nhân nhanh Mơ sẹo sau q trình tăng sinh sử dụng cho trình tái sinh chồi rễ bất định SVTH: NGUYỄN THỊ THU 36 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Bảng 3.4: Ảnh hưởng kích thước mẫu cấy ban đầu lên tăng sinh mô sẹo: Chỉ tiêu quan sát Trọng lượng tươi ban đầu (mg) Kích thước (cm) Sinh khối sau Trọng lượng tươi (mg) tuần nuôi cấy Trọng lượng khô (mg) Tỷ lệ chất khô ( %) Tỷ lệ tăng sinh khối khô KT1 KT2 KT3 (0.5*0.5) (0.7*0.7) (1.0*1.0) 147 267 ± 18 576 ± 24 1.1*0.9 1.4*1.0 1.6*1.2 667 ± 45 804 ± 35 1505 ± 66 53.9 ± 36 57.8 ± 2.5 102.8 ± 4.5 8.08 7.19 6.83 5.46 3.22 2.65  Kết quả: Kích thước mẫu cấy yếu tố quan trọng nhân giống invitro Khi khảo sát ảnh hưởng kích thước mẫu cấy ban đầu lên tăng sinh mô sẹo, ta nhận thấy kích thước nhỏ (KT1) cho hiệu tốt tỷ lệ tăng sinh khối lẫn trọng lượng khô, khơng có khác biệt nhiều khả tăng sinh KT2 KT3 (Bảng 3.4) Sự tương quan bắt nguồn từ tương quan kích thước mẫu cấy - khả thu nhận dinh dưỡng từ môi trường ảnh hưởng chất thải nội sinh mô sẹo q trình ni cấy 3.6.5 Ảnh hưởng auxin lên khả khởi tạo mô sẹo từ cuống lá: Những nghiên cứu có đối tượng thuộc chi Panax cho thấy giai đoạn khởi tạo mô sẹo thường có kết hợp cytokinin auxin Mẫu cuống sau khử trùng cấy vào môi trường MS bổ sung 0.2 mg/l TDZ loại auxin 2,4-D, IBA, NAA, với nồng độ thay đổi từ 0.5; 1.0; 2.0 3.0 mg/l Mẫu đặt ngửa mặt môi trường cuống đặt ngửa (Vết cắt hướng lên trên) SVTH: NGUYỄN THỊ THU 37 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Bảng 3.5: Ảnh hưởng auxin lên khả khởi tạo mô sẹo từ cuống lá: Auxin Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) Cuống Lá 100 20 100 90 100 90 100 80 0 0 0 0 0 0 0 0 Nồng độ auxin ( mg/l) 0.5 1.0 2.0 3.0 0.5 1.0 2.0 3.0 0.5 1.0 2.0 3.0 2,4-D IBA NAA  Kết quả: Kết thu sau tuần nuôi cấy ghi nhận bảng 3.5 Trong ba loại auxin bổ sung vào mơi trường có 2,4-D có khả kích thích cuống tạo mơ sẹo Trên môi trường bổ sung 1.0 mg/l 2,4-D, mẫu cấy có tỷ lệ hình thành mơ sẹo cao (Đạt 90 % 100 % cuống lá), có lượng sẹo hình thành nhiều nhất, cấu trúc có màu vàng sáng Ở nồng độ 3.0 mg/l 2,4-D, mơ sẹo bắt đầu có tượng thủy tinh thể Do đó, nồng độ 2,4-D từ 3.0 mg/l trở lên không phù hợp cho phát sinh mô sẹo 3.6.6 Ảnh hưởng auxin lên khả tăng sinh mô sẹo Sâm Ngọc Linh: Các mẩu mô sẹo tạo từ giai đoạn khởi tạo cấy vào môi trường MS bổ sung 0.2 mg/l TDZ loại auxin 2,4-D, IBA NAA với nồng độ thay đổi từ 0.5; 1.0; 2.0; 3.0 5.0 mg/l điều kiện chiếu sang 16 giờ/ ngày Bảng 3.6: Ảnh hường auxin lên khả tăng sinh mô sẹo Sâm Ngọc Linh: Auxin Nồng độ (mg/l) Trọng lượng tươi ban đầu (mg) SVTH: NGUYỄN THỊ THU Sinh khối sau tuần nuôi cấy Trọng lượng Trọng Tỷ lệ tươi (mg) lượng khô chất khô 38 Tỷ lệ tăng sinh khối KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2,4-D IBA NAA 0.5 1.0 2.0 3.0 5.0 0.5 1.0 2.0 3.0 5.0 0.5 1.0 2.0 3.0 5.0 203 ± 16 212 ± 14 204 ± 17 205 ± 201 ± 13 197 ± 18 203 ± 19 207 ± 13 203 ± 15 209 ± 12 218 ± 212 ± 14 206 ± 15 199 ± 205 ± 14 GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 584 ± 34 809± 37 711 ± 32 508 ± 24 493 ± 38 474 ± 23 532 ± 29 631 ± 32 552± 26 531 ± 23 485 ± 13 548 ± 21 588 ± 18 602 ± 32 720 ± 48 (mg/l) (%) 43.3 ± 2.5 66.2 ± 3.0 52.4 ± 2.4 36.6 ± 2.2 34.6 ± 1.7 45.6 ± 2.2 48.6 ± 2.7 49.5 ± 2.5 41.1 ± 1.9 35.3 ± 1.5 41.2 ± 1.1 45.0 ± 1.8 46.6 ± 1.4 45.7 ± 2.4 51.6 ± 3.4 7.42 8.18 7.37 7.21 7.01 9.62 9.14 7.84 7.45 6.66 8.49 8.22 7.92 7.60 7.20 khô 3.18 4.56 3.73 2.65 2.50 3.45 3.56 3.63 3.10 2.53 2.81 3.33 3.37 3.38 3.77  Kết quả: Bảng 3.6 cho thấy sau trình tăng sinh, mơ sẹo ni cấy mơi trường có 0.5 mg/l IBA có tỷ lệ chất khơ cao 9.62 % tỷ lệ tăng sinh khối khô cao 4.56 lần lại thu mô sẹo môi trường có 2,4-D nồng độ 1.0 mg/l Có thể kết hợp auxin cytokinin làm tăng khả thu nhận đường chất dinh dưỡng khác từ môi trường mô sẹo kéo theo tăng sinh mô sẹo, đặc biệt tăng tỷ lệ chất khơ IBA auxin kích thích thu nhận dinh dưỡng từ mơi trường kết hợp với TDZ tốt so với NAA 2,4-D Kết tỷ lệ chất khô mô sẹo ni cấy mơi trường có IBA cao ba loại auxin sử dụng Tuy IBA cho tỷ lệ mơ sẹo có tỷ lệ chất khơ cao 2,4-D có tỷ lệ tăng sinh khối khơ cao (Gấp 4.56 lần) có tỷ lệ chất khơ tương đối cao (8.18 %) Mặt khác, mô sẹo mơi trường 2,4-D có hình thái tốt nhất, dạng mơ sẹo có khả tái sinh cao 3.6.7 Ảnh hưởng BA NAA đến khả tái sinh chồi từ mô sẹo: SVTH: NGUYỄN THỊ THU 39 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Các mô sẹo thu thí nghiệm nhân nhanh mơ sẹo tách chuyển vào mơi trường ½ MS có bổ sung BA NAA với nồng độ bảng 3.6  Kết quả: Tỷ lệ auxin cytokinin đóng vai trò cần thiết cho tái sinh chồi, cytokinin thường thúc đẩy hình thành chồi trình thường kích thích bổ sung auxin với nồng độ thấp Trong thử nghiệm, sử dụng BA kết hợp với NAA kết nhận thấy tổ hợp NAA BA khác nhau, kết hợp 1.0 mg/l BA 1.0 mg/l NAA cho số chồi đạt cao 6.3 chồi/ mẫu trọng lượng trung bình 0.185 g (Bảng 3.7) Bảng 3.7: Khả tái sinh chồi từ mô sẹo môi trường MS có bổ sung BA NAA: BA (mg/l) 0.5 1.0 2.0 NAA (mg/l) 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 SVTH: NGUYỄN THỊ THU Số lượng chồi/ mẫu 5.0 6.1 4.6 3.3 3.0 5.5 6.3 5.9 3.9 3.7 4.2 5.5 2.9 2.8 2.7 40 Trọng lượng chồi (g) 0.106 0.141 0.193 0.197 0.094 0.163 0.185 0.158 0.148 0.157 0.152 0.141 0.144 0.112 0.108 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 4.0 3.3 3.0 2.6 0.8 0.154 0.122 0.122 0.108 3.6.8 Ảnh hưởng BA lên trình tăng trưởng chồi Sâm Ngọc Linh invitro: Những chồi tốt sau thu nhận tách chuyển vào mơi trường ½ MS có bổ sung 1.0 g/l than hoạt tính, 30 g/l sucrose, 0.5 mg/l NAA BA ( 0.5; 1.0; 2.0; 4.0 mg/l) Bảng 3.8: Ảnh hưởng BA lên trình tăng trưởng chồi Sâm Ngọc Linh invitro: BA (mg/l) Trọng lượng tươi (g) Chiều cao chồi (cm) Số lượng lá/ chồi 0.5 1.0 2.0 4.0 0.61 0.87 0.72 0.71 5.66 6.16 4.11 4.33 3.0 3.3 4.0 3.9  Kết quả: Trong nồng độ BA đươc sử dụng, nồng độ 1.0 mg/l BA kết hợp với 0.5 mg/l NAA cho kết tăng trưởng chồi chốt với trọng lượng tươi chồi 0.87 g chiều cao chồi 6.16 cm (Bảng 3.8) Vậy môi trường ni cấy có bổ sung 1.0 mg/l BA 0.5 mg/l tốt cho trình tăng trưởng chồi 3.6.9 Ảnh hưởng nồng độ đường đến khả tăng trưởng chồi: SVTH: NGUYỄN THỊ THU 41 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Những chồi tốt thí nghiệm tách cấy chuyền sang mơi trường ½ MS có bổ sung 0.5 mg/l NAA, 1.0 mg/l BA, pH = 5.7 đường với nồng độ đường 10; 20; 30; 40; 50; 60 g/l  Kết quả: Qua kết thử nghiệm cho thấy sucrose carbohydrate hào tan chiếm ưu nồng độ thường dùng nằm khoảng 30 - 120 g/l sucrose Nghiên cứu ảnh hưởng sucrose lên tăng trưởng chồi Sâm Ngọc Linh sau 90 ngày nuôi cấy cho thấy việc bổ sung sucrose vào môi trường ni cấy có ảnh hưởng tích cực lên sinh trưởng chồi Sự gia tăng nồng độ sucrose mơi trường khơng kích thích sinh trưởng chồi Sâm Ngọc Linh mà có tác dụng mạnh đến biến đổi khối lượng chúng Nồng độ 50 g/l sucrose cho kết tốt trọng lượng, chiều cao số lượng (Bảng 3.9) Bảng 3.9: Ảnh hưởng nồng độ đường đến khả tăng trưởng chồi: Sucrose (g/l) Trọng lượng chồi (g) Chiều cao chồi (cm) Số lượng lá/ chồi 10 20 30 40 50 60 0.49 0.55 0.68 1.06 1.46 1.28 4.4 5.4 5.7 5.8 6.1 6.1 2.2 2.5 2.6 3.2 3.5 3.2 3.6.10 Ảnh hưởng than hoạt tính đến khả tăng trưởng chồi invitro: Những chồi tốt thí nghiệm tách cấy chuyền sang mơi trường ½ MS có bổ sung 0.5 mg/l NAA, 1.0 mg/l BA, pH = 5.7 với nồng độ than hoạt tính 1.0; 2.0; 3.0 4.0 g /l Bảng 3.10: Ảnh hưởng than hoạt tính đến khả tăng trưởng chồi invitro: Than hoạt tính (g/l) Trọng lượng chồi (g) Chiều cao chồi (cm) Số lượng lá/ chồi 0.53 3.3 3.6 SVTH: NGUYỄN THỊ THU 42 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 1.0 2.0 3.0 4.0 GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 0.61 1.01 0.97 0.94 4.6 5.3 6.8 8.5 3.7 3.3 2.7 3.1  Kết quả: Than hoạt tính khơng phải chất điều hòa sinh trưởng thưc vật, có khả thay đổi thành phần mơi trường Than hoạt tính điều chỉnh pH mơi trường, hấp thụ chất làm cản trở phát triển mô Kết thu cho thấy nồng độ than hoạt tính tăng có thay đổi rõ rệt trọng lượng chiều cao chồi, số lượng khơng có thay đổi đáng kể Trọng lượng chồi đạt cao môi trường chứa 2.0 g/l than hoạt tính khoảng 1.01 g/chồi, tăng 1.9 lần so vời đối chứng (Bảng 3.10) Vậy nồng độ 2.0 g/l than hoạt tính phù hợp cho qúa trình tăng sinh chồi Sâm Ngọc Linh 3.6.11 Ảnh hưởng IAA, IBA, NAA đến khả rễ bất định từ mô sẹo: Mô sẹo cấy vào mơi trường rễ có chứa auxin (NAA, IBA, IAA) nồng độ 1.0; 3.0; 5.0; 7.0 mg/l Bảng 3.11: Ảnh hưởng IAA, IBA, NAA đến khả rễ bất định từ mô sẹo: Auxin NAA IAA IBA Nồng độ Tỷ lệ rễ Số lượng ( mg/l) (%) rễ / mẫu 1.0 3.0 5.0 7.0 1.0 3.0 5.0 7.0 1.0 3.0 5.0 30 100 70 50 0 10 70 80 100 3.0 ± 0.3 8.7 ± 0.1 2.6 ± 0.1 2.1 ± 0.1 SVTH: NGUYỄN THỊ THU Tỷ lệ khối lượng rễ / mẫu (%) 5.98 21.88 6.23 12.21 Chiều dài tối đa rễ (mm) 18 13 0.2 ± 0.2 1.6 ± 0.1 4.0 ± 0.3 4.8 ± 0.3 43 7.83 5.21 15.81 16 21 18 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 7.0 60 GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 3.5 ± 0.1 8.06 1.7  Kết quả: Quá trình khảo sát ảnh hưởng ba loại auxin trên, ta nhận thấy IAA khơng thích hợp cho q trình rễ Sâm Ngọc Linh từ mơ sẹo auxin khơng kích thích mơ sẹo rễ bất định NAA IBA ngược lại Nồng độ 3.0 mg/l NAA cho kết tố với tỷ lệ rễ lên đến 100 %, số lượng rễ/ mẫu lớn (8.7 rễ/ mẫu), tỷ lệ khối lượng rễ / mẫu lớn (21.88 %), chiều dài tối đa rễ 13 mm (Bảng 3.11) IBA nồng độ 5.0 mg/l cho tỷ lệ rễ đạt 100 %, Số lượng rễ trung bình/ mẫu 4.8 mẫu, tỷ lệ khối lượng 15.81 % chiều dài tối đa rễ 18 mm Kết giải thích auxin tổng hợp có hoạt tính cao dạng tự nhiên Vậy hai mơi trường kích thích rễ tốt mơi trường Ms ½ bổ sung 3.0 mg/l NAA mơi trường MS ½ bổ sung mg/l IBA 3.6.12 Ảnh hưởng IBA NAA đến khả nhân rễ bất định: RỄ bất định sau tạo thí nghiệm tách cấy chuyền sang mơi trường nhân rễ có bổ sung auxin NAA, IBA nồng độ 1.0; 3.0; 5.0 mg/l  Kết quả: Từ kết bảng 3.12 bảng 3.13 cho thấy nguồn gốc mẫu rễ có ảnh hưởng lớn đến hiệu nhân rễ Mẫu rễ bảng 3.12 có khả nhân rễ tốt hơn, nghiệm thức rễ, tỷ lệ rễ cao 60 %, số rễ thứ cấp cao rễ/ mẫu Mẫu rễ bảng 3.13 có tỷ lệ rễ cao 40 %, số rễ thứ cấp cao rễ/ mẫu, có nghiệm thức rễ mẫu lại cấy môi trường chứa NAA Khi xét đến ảnh hưởng loại auxin, ta thấy NAA phù hợp với trình nhân rễ bất định Sâm Ngọc Linh Ở nồng độ 5.0 mg/l NAA kích thích nhân rễ tốt (60 %), có số rễ thứ cấp nhiều (9 rễ/ mẫu) mẫu tăng trọng cao (Trọng lượng tươi trung bình 390 ± 20 mg/l, tăng 3.5 lần so với ban đầu) Hơn SVTH: NGUYỄN THỊ THU 44 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH nữa, có tới 5/6 nghiệm thức bổ sung NAA cho kết rễ so với IBA có 4/6 nghiệm thức Vậy IBA NAA, NAA nồng độ 3.0 mg/l phù hợp cho việc khơi tạo rễ từ mô sẹo NAA nồng độ 5.0 mg/l phù hợp cho trình nhân rễ bất định Sâm Ngọc Linh Bảng 3.12: Ảnh hưởng IBA NAA đến khả nhân rễ mẫu có nguồn gốc từ môi trường bổ sung NAA: NAA IBA Tỷ lệ rễ Số rễ thứ (mg/l) (mg/l) (%) cấp - 20 30 60 10 20 30 Trọng lượng tươi trung bình (mg/l) 140 ± 10 290 ± 10 390 ± 20 450 ± 50 330 ± 20 280 ± 30 Bảng 3.13: Ảnh hưởng IBA NAA đến khả nhân rễ mẫu có nguồn gốc từ môi trường bổ sung IBA: NAA IBA Tỷ lệ rễ Số rễ thứ (mg/l) (mg/l) (%) cấp - 40 20 10 0 1 0 SVTH: NGUYỄN THỊ THU 45 Trọng lượng tươi trung bình (mg/l) 350 ± 10 180 ± 30 270 ± 10 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Sâm Ngọc Linh cơng nhận Sâm có hàm lượng saponin cao với số lượng nhiều nhất, so với loài Panax khác giới Do việc nghiên cứu ứng dụng cơng nghệ ni cấy mô tế bào thực vật mang lại nhiều ý nghĩa thực tiễn việc bảo tồn nguồn dược liệu quý giá - Quá trình khảo sát ảnh hưởng loại nồng độ auxin lên khả tạo mô sẹo ban đầu cuống cho thấy nồng độ 3.0 mg/l 2.4-D trở lên không phù hợp cho phát sinh mô sẹo từ Sâm Ngọc Linh - Trong giai đoạn tăng trưởng chồi, số chồi tái sinh từ mô sẹo đạt cao môi trường ½ MS bổ sung 1.0 mg/l BA, 1.0 mg/l NAA, 50 g/l sucrose - Đối với trình rễ từ mô sẹo, mẫu mô sẹo nuôi cấy mơi trường ½ MS có bổ sung 3.0 mg/l NAA cho tỷ lệt rễ cao nhất, số lượng rễ nhiều tỷ lệ trọng lượng tươi rễ/ mẫu cao - Mơi trường ½ MS có bổ sung 5.0 mg/l NAA kích thích nhân rễ tốt nhất, cho tỷ lệ rễ cao rễ phân nhánh nhiều 4.2 Kiến nghị: - Được giới ghi nhận loài Sâm quý bậc nhất, đến Sâm Ngọc Linh chưa biết đến nhiều loài Sâm Hàn Quốc hay Sâm Triều Tiên - Việc nghiên cứu tạo nguồn nguyên liệu loài Sâm giới nhiều tác giả tiến hành nhiều năm, Việt Nam khẳng định tính thực khả tạo nguồn Sâm đường nuôi cấy mô tế bào Nhưng cần nhiều nghiên cứu loài Sâm Ngọc Linh Việt Nam để Việt Nam chủ động nguồn nguyên dược liệu quý, đồng thời đưa thương hiệu Sâm Việt Nam mang tầm quốc tế SVTH: NGUYỄN THỊ THU 46 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP - GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Là lồi Sâm đặc hữu tìm thấy với số lượng phạm vi phân bố hẹp, nhạy cảm với mơi trường sống, nguồn cung cấp hạn chế, thời gian từ lúc trồng từ hạt thu củ lên đến 5-6 năm Do đó, nguồn Sâm Ngọc Linh cạn kiệt dần nguy tuyệt chủng cao, nên cần có nhiều biện pháp cấp bách để bảo tồn phát triển nguồn tài nguyên thiên nhiên quốc gia SVTH: NGUYỄN THỊ THU 47 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THU GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 48 ... giá trị kinh tế với công nghệ nuôi cấy tế bào thực nhằm mục đích nhân giống sản xuất hợp chất có giá trị kinh tế, tơi thực khóa luận tốt nghiệp: Công nghệ nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh (Panax... Sâm Ngọc Linh - Tìm hiểu số công nghệ nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH CHƯƠNG II TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế. .. thể tế bào  Nuôi cấy tế bào đơn sử dụng cho mục đích: - Chọn dòng tế bào - Nghiên cứu cấu trúc tế bào, phát triển phân hóa tế bào điều kiện khác - Thu nhận chất trao đổi thứ cấp 2.1.2.6 Nuôi cấy